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Artículo de método

Entrega efectiva y segura de genes al riñón de ratón mediante inyección lenta retrógrada en la pelvis renal de vectores de virus adenoasociados

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DOI:

10.3791/67716

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1 de agosto de 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Medical Genetics, Oregon Health & Science University, 2Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health & Science University, 3Division of Neuroscience, Oregon National Primate Research Center

En este artículo

Resumen

Este informe detalla el método de inyección localizada de vectores AAV a través de la pelvis renal para una transferencia de genes efectiva y segura al riñón del ratón.

Resumen

El desarrollo de herramientas y métodos in vivo eficaces para la administración de genes al riñón es crucial para avanzar en la investigación renal básica y la terapia génica para las enfermedades renales. Además, la creciente conciencia sobre las enfermedades renales monogénicas, impulsada por pruebas genéticas avanzadas, subraya el potencial de la terapia génica para tratar e incluso curar enfermedades renales genéticas difíciles de tratar. En este sentido, los vectores de virus adenoasociados (AAV) han atraído una atención cada vez mayor como una plataforma sólida para la administración de genes in vivo ; sin embargo, aún no se ha establecido completamente el método más eficaz y seguro para la administración de genes mediada por vectores AAV a cada tipo de célula terapéuticamente relevante en el riñón. Aquí, se detalla el método de inyección lenta de pelvis renal retrógrada (RP) de vectores AAV, y se demuestra su alto potencial para transducir riñones de ratón cuando se usa con cápsidas AAV seleccionadas adecuadamente. Además, se ha demostrado que este método es eficaz no solo con los vectores AAV (CsCl AAV) purificados por ultracentrifugación de cloruro de cesio estándar, sino también con minipreparados vectoriales AAV (CU AAV) ultrafiltrados centrífugamente, que se pueden preparar de forma rápida y sencilla utilizando técnicas que no requieren experiencia especializada en vectores AAV. Como ejemplo, este estudio demuestra que la inyección lenta de RP de los vectores CsCl y CU AAV-KP3 da como resultado una transducción robusta de túbulos proximales en el riñón del ratón sin daño tisular aparente, a diferencia de los enfoques hidrodinámicos informados anteriormente que inevitablemente conducen al daño tisular. Por lo tanto, este estudio destaca que la inyección lenta de RP retrógrada de vectores seleccionados derivados de la cápside de AAV es un método eficaz y seguro para la administración de genes al riñón. Este método será aplicable a un amplio espectro de investigación renal, incluidos los estudios de terapia génica. El uso de minipreparados vectoriales CU AAV aumentará significativamente el rendimiento y mejorará la eficiencia de tiempo y costos necesarios para generar datos preliminares y obtener información crucial.

Introducción

Los métodos eficaces y seguros para la administración de genes al riñón en animales experimentales pequeños y grandes brindan oportunidades cruciales para avanzar en la investigación renal básica y explorar enfoques terapéuticos innovadores. El establecimiento de tales métodos es particularmente relevante para la terapia génica para diversas enfermedades renales. Los avances recientes en las pruebas genéticas clínicas han revelado una mayor prevalencia de trastornos renales monogénicos de lo estimado anteriormente, afectando aproximadamente al 30% de los pacientes con enfermedades renales crónicas (ERC)1. La ERC se caracteriza por un daño renal progresivo, que en última instancia conduce a insuficiencia renal sin terapias modificadoras de la enfermedad verdaderamente efectivas. La hemodiálisis y el trasplante renal son tratamientos disponibles actualmente; sin embargo, tienen limitaciones que perjudican significativamente la calidad de vida de los pacientes con ERC2. Por lo tanto, la terapia génica, un enfoque poderoso clínicamente probado para tratar enfermedades genéticas, ha atraído una atención significativa en los últimos años como una vía novedosa para el tratamiento efectivo de las enfermedades renales genéticas que conducen a la ERC 3,4,5,6. Este enfoque puede abordar directamente las causas fundamentales de las enfermedades y potencialmente ofrecer una cura.

A pesar de los constantes avances en el campo, la administración de genes al riñón sigue siendo un desafío importante tanto en la investigación como en los entornos terapéuticos. Dirigirse eficazmente a las células renales con genes terapéuticos es difícil debido a la compleja estructura del órgano y a las barreras fisiológicas únicas, incluida la barrera de filtración glomerular, que está compuesta por células endoteliales glomerulares, la membrana basal glomerular y los procesos del pie podocitario. Se han explorado varias estrategias para la administración de genes dirigidos al riñón, incluida la inyección directa de la corteza renal (CR) 7,8, la inyección de la arteria renal (AR) 9,10,11, la inyección de la vena renal (VD) 12,13,14, la inyección de la pelvis renal (RP) 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 e inyección intravenosa (IV) 19,26,27,28,29,30 de vectores de administración de genes virales o no virales, así como administración de ácido nucleico mediada por ultrasonido y microburbujas 31,32. Estos enfoques demostraron eficiencias de transducción variables o resultados funcionales, a menudo produciendo resultados inconsistentes que son difíciles de conciliar (revisado en las referencias 3,33,34,35). La administración de genes al riñón aún está poco desarrollada, lo que dificulta las comparaciones directas entre los sistemas de vectores y las metodologías. Sin embargo, los métodos de administración localizados, que facilitan la administración de agentes altamente concentrados directamente en el riñón, generalmente han logrado mejores resultados que la administración intravenosa sistémica. Además, los vectores de virus adenoasociados (AAV), con sus sólidos perfiles de seguridad y su historial comprobado de traducción clínica36,37, han sido los más estudiados y se consideran la principal opción para la transferencia de genes renales.

Los serotipos comunes de AAV y las cápsidas diseñadas han demostrado una transducción efectiva de células mesangiales y mesenquimales en el riñón después de la inyección intravenosa en ratones 28,30,38. En particular, estudios recientes han demostrado que la administración intravenosa de AAV9 puede transducir eficazmente podocitos en modelos de ratón de síndrome nefrótico y síndrome de Alport, aunque este efecto no se observa en riñón sano38,39, y que la administración intravenosa de una cápside AAV2 modificada puede dirigirse exclusivamente a las células endoteliales glomerulares en riñones sanos e inflamados en ratones40. Históricamente, los túbulos renales han sido difíciles de transducir por vía intravenosa. Sin embargo, recientemente se ha descubierto que la inyección de RP de cápsidas AAV seleccionadas, como AAV-KP141, puede lograr la transducción de túbulos proximales a niveles más de un orden de magnitud más altos que los logrados con la cápside AAV9 de referencia38. Aunque se necesitan más mejoras, estos avances abren nuevas vías para la investigación renal básica y la terapia génica, ofreciendo oportunidades que antes eran inalcanzables.

En el presente artículo, la inyección retrógrada lenta de vectores AAV se detalla como un método eficaz y seguro para la administración de genes al riñón del ratón38. Como ejemplo representativo de esta técnica, se eligió AAV-KP3 como cápside ejemplar basándose en el descubrimiento de que es una de las seis cápsidas (es decir, AAV-KP1, AAV-KP2, AAV-KP341, AAV-DJ42, AAV2G943 y AAV2.7m844) que mostró una transducción renal mejorada en comparación con AAV9 después de la inyección de RP en ratones38. En particular, los tejidos renales inyectados con RP retrógrado lento no mostraron daño tisular aparente en contraste con los tratados con enfoques hidrodinámicos previamente informados23,24. Además, los vectores miniprep AAV45 purificados crudamente por ultrafiltración centrífuga rápida y simple (es decir, vectores CU AAV) alcanzaron niveles de transducción renal aproximadamente el 70% de los alcanzables por preparaciones de vectores AAV purificadas por la ultracentrifugación en gradiente estándar de cloruro de cesio (CsCl) (es decir, vectores CsCl AAV) cuando se administraron en el mismo título del genoma del vector. Por lo tanto, el método y las observaciones presentadas aquí proporcionan un recurso valioso y práctico para los investigadores que buscan mejorar la entrega de genes al riñón en ratones y animales potencialmente más grandes.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales descritos aquí fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Salud y Ciencias de Oregón (OHSU) y se realizaron de acuerdo con las pautas para el cuidado de animales en OHSU. En este estudio, se utilizaron ratones machos C57BL / 6J de ocho semanas de edad. Los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Producción de vectores AAV mediante una transfección de plásmido libre de adenovirus

  1. Cultivo de 293 células de riñón embrionario humano (HEK) en el medio de águila modificado modificado (DMEM) con alto contenido de glucosa (4,5 g/L) de Dulbecco suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 1% de mezcla de penicilina y estreptomicina y 1 mM de L-glutamina, en una incubadora a 37 °C con 5% de dióxido de carbono (CO2).
  2. El día -2 (48 h antes de la transfección), coloque 4 x 106 HEK 293 células por matraz T225 en 40 ml del medio de cultivo como se describe en el paso 1.1. Esto alcanza ~95% de confluencia en el día 0.
    NOTA: La escala de cultivo se puede ajustar según la aplicación. Para una minipreparación de AAV (paso 2), prepare un número adecuado de matraces en función del título objetivo y la concentración del vector, teniendo en cuenta que el proceso de purificación suele dar lugar a una pérdida aproximada del 50% de material. Para lograr >6 x 1012 vg/ml de vectores AAV9 y AAV-KP3 para la inyección de RP en ratones a una dosis de 3 x 1011 vg/ratón en una solución vectorial de 50 μl, se recomiendan al menos 2 matrazs. Para la producción de vectores AAV a mayor escala, como la de los vectores AAV purificados en gradiente de densidad CsCl (AAV CsCl), normalmente se utilizan 25 o más matrazs.
  3. Día 0: Transfección de ADN plasmídico
    1. Preparación para la transfección
      1. Asegúrese de que las células hayan alcanzado una confluencia de ~ 95%.
      2. Calentar DMEM suplementado con una mezcla de penicilina y estreptomicina al 1% y 1 mM de L-glutamina pero sin FBS (es decir, medio sin suero) en un baño de agua a 37 °C.
      3. Deje que la solución lineal de polietilenimina (PEI) alcance la temperatura ambiente.
    2. Preparación de la mezcla de ADN plasmídico
      1. Mezcle los plásmidos (15 μg de pAAV-CAG-tdTomato, pRepCap y pHelper) en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) sin CaCl2 o MgCl2 en tubos estériles de microcentrífuga de 1,5 ml. La cantidad total de ADN es de 45 μg/matraz.
        NOTA: Los volúmenes de solución de ADN plasmídico se pueden ignorar si son mínimos. Sin embargo, se recomienda ajustar el volumen si el volumen total de la solución es de ≥225 μL. Las secuencias de los plásmidos utilizados en este estudio están disponibles en el Archivo Suplementario 1.
    3. Transfección de PEI
      1. Agregue 90 μL de solución de PEI (1 mg/mL) a 1 mL de PBS y mezcle con la mezcla de PBS-ADN plasmídico (preparada como se indicó anteriormente) en un tubo de polipropileno de 50 mL. El volumen final es de aproximadamente 2 mL (5% del volumen del medio de cultivo).
      2. Agite los tubos durante 5 s y gire brevemente los tubos con una centrífuga para recoger el líquido hasta el fondo de los tubos.
    4. Mantener a temperatura ambiente durante 15 min para formar complejos plasmídicos de ADN-PEI.
    5. Una vez completada la incubación de 15 minutos, agregue los 40 ml de medio sin suero precalentado preparado en el paso 1.3.1.2 a los complejos plasmídicos ADN-PEI. El volumen es de aproximadamente 42 mL.
    6. Reemplace el medio de cultivo del matraz T225 con complejos plásmidos de ADN-PEI que contengan medio sin suero descrito en el paso 1.3.4.
    7. Mantenga las células en este medio de transfección hasta la cosecha el día 5 (no se requiere cambio de medio).
    8. El día 2, observe las células transfectadas con el plásmido que expresa proteínas fluorescentes (p. ej., pAAV-CAG-tdTomato) bajo un microscopio de fluorescencia invertida para evaluar la eficiencia de la transfección de plásmidos.
      NOTA: Las condiciones descritas anteriormente suelen dar como resultado eficiencias de transfección superiores al 70%. Se pueden observar algunos cambios morfológicos (por ejemplo, elongación celular), probablemente debido al ambiente libre de suero.
    9. En los días 3 a 5, continúe cultivando las células transfectadas en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2.
    10. El día 5, recoja las células y el medio que contiene virus en un tubo de polipropileno de 50 ml.
    11. Almacene las muestras a -80 °C hasta su uso.

2. Purificación por ultrafiltración centrífuga (CU) de vectores AAV (minipreparación de AAV)

  1. Descongelar la muestra congelada del paso 1.3.11 en un baño de agua a 37 °C.
  2. Mantenga 1 ml de lisado crudo a un lado para el ensayo de transferencia de puntos de ADN (utilizado como fracción 1).
  3. Agregue 80 μL de cloruro de magnesio 1M (MgCl2, concentración final de 2 mM), 160 μL de hidróxido de sodio 0.1M (NaOH, concentración final de 0.4 mM) y 16 μL de endonucleasa Serratia marcescens (concentración final de 100 unidades / mL) en un tubo de 50 mL. Incubar a 37 °C durante 1 h. Agite la muestra cada 15 minutos durante la incubación.
  4. Recoja la muestra tratada con endonucleasa de Serratia marcescens en un frasco de centrífuga de 250 ml y centrifugue a 10.000 x g a 4 °C durante 30 min.
  5. Transfiera el sobrenadante a un tubo de polipropileno de 50 ml con una pipeta serológica de 50 ml.
  6. Filtre el sobrenadante para eliminar los residuos con un filtro de jeringa de PVDF de 0,45 μm. Mantenga a un lado 1 ml de muestra filtrada de 0,45 μm para el ensayo de transferencia de puntos de ADN (utilizado como fracción 2).
  7. Agregue 10 ml de agua de grado molecular a un tubo de ultrafiltración centrífugo de corte de peso molecular (MWCO) de 100 kDa y centrifugue a 2.000 x g a 4 °C durante 10 min. Retire el flujo continuo.
  8. Añadir 15 ml de sorbitol al 5% en PBS al tubo de ultrafiltración centrífuga y centrifugar a 2.000 x g a 4 °C durante 10 min. Retire el flujo continuo.
  9. Agregue hasta 15 ml de muestra filtrada de 0,45 μm como se describe en el paso 2.6 y centrifugue a 2.000 x g a 4 °C durante 15 min para la concentración hasta alcanzar el volumen objetivo de aproximadamente 500 μl. Mantenga 1 ml de flujo a un lado para el ensayo de transferencia de puntos de ADN (utilizado como fracción 3).
    NOTA: Antes de cada centrifugación, vuelva a suspender el retenido con una pipeta para interrumpir el gradiente de concentración. No toque la membrana con la punta de la pipeta. Si no se alcanza el volumen objetivo después de 15 minutos de centrifugación, amplíe la centrifugación según sea necesario ajustando la duración en función del volumen restante en el tubo.
  10. Repita el paso 2.9 hasta que se filtre toda la muestra, alcanzando el volumen objetivo de aproximadamente 500 μL. Mantenga 1 ml del flujo continuo de la primera y segunda iteración del paso 2.10 a un lado para el ensayo de transferencia de puntos de ADN (utilizado como Fracción 4 y Fracción 5).
    NOTA: Se puede utilizar un solo tubo de ultrafiltración centrífuga para procesar muestras obtenidas de dos o más matraces.
  11. Agregue 15 ml de sorbitol al 5% en PBS y centrifugue a 2.000 x g a 4 ° C durante 15 min hasta alcanzar el volumen objetivo de aproximadamente 500 μl. Mantenga 1 ml de flujo a un lado para el ensayo de transferencia de puntos de ADN (utilizado como Fracción 6).
  12. Repita el paso 2.11 (utilizado como Fracción 7).
    NOTA: Si se requieren títulos de AAV más altos para los experimentos posteriores, el volumen objetivo final se puede reducir aún más a 150 μL.
  13. Transfiera el vector AAV ultrafiltrado a un tubo con tapón de rosca de 2 ml con una junta tórica. Mantenga a un lado 10 μL de vector AAV ultrafiltrado para el ensayo de transferencia de puntos de ADN (utilizado como Fracción 8).
  14. Determinar los títulos de AAV mediante el ensayo DNA dot blot como se describió anteriormente46.
    NOTA: Los vectores purificados con CU (CU AAV) contienen niveles más altos de contaminación de la cápside vacía e impurezas derivadas de la célula huésped en comparación con los vectores purificados con CsCl (CsCl AAV). Estos factores pueden afectar la eficiencia de la transducción y las respuestas inmunitarias, lo que requiere una cuidadosa consideración en la interpretación de los datos.

3. Purificación de gradiente de densidad de CsCl de vectores AAV

  1. Descongelar la muestra congelada del paso 1.3.11 en un baño de agua a 37 °C.
  2. Centrifugar a 10.000 x g a 4 °C durante 30 min para eliminar los restos celulares.
  3. Recolecte el sobrenadante y precipite los vectores AAV en el sobrenadante agregando polietilenglicol 8000 (PEG, concentración final del 8%) y cloruro de sodio (concentración final de 500 mM).
  4. Incubar en hielo durante 3 h.
  5. Centrifugar a 10.000 x g a 4 °C durante 30 min para obtener los pellets que contienen AAV.
  6. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender los gránulos con 10 ml de tampón de resuspensión que contiene Sarkosyl (50 mM HEPES, 150 mM de NaCl, 1% de Sarkosyl, pH 8,0).
  7. Transfiera la suspensión de gránulos a un tubo de polipropileno de 15 ml y manténgalo a 4 °C durante la noche.
  8. Al día siguiente, tratar la suspensión de pellets con endonucleasa Serratia marcescens (concentración final de 200 unidades/mL) y MgCl2 (concentración final de 2 mM).
  9. Incubar a 37 °C durante 1h.
  10. Centrifugar a 10.000 x g a 4 °C durante 30 min.
  11. Recoger el sobrenadante y añadir cloruro de cesio (CsCl, concentración final de índice de refracción (IR) = 1,3710 +/- 0,0005) y EDTA (concentración final de 20 mM).
  12. Cargue la muestra en un tubo de ultracentrífuga de 29,9 ml y agregue la solución de cobertura (HEPES 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 20 mM, CsCl (RI = 1,3710 +/- 0,0005), pH 8,0) hasta que esté llena.
  13. Centrifugar a 41.000 x g a 12 °C durante 22 h.
  14. Haga agujeros en la parte inferior y lateral del tubo de ultracentrífuga para recolectar un total de 15 fracciones de 2 ml cada una.
  15. Utilice 10 μL de cada fracción para verificar RI y realizar el ensayo de transferencia de puntosde ADN 46.
  16. Con base en los resultados del ensayo de transferencia de puntos de ADN y RI, determine las 5 mejores fracciones que contienen vectores AAV.
  17. Combine las 5 mejores fracciones (total de aproximadamente 10 ml) y ajuste el RI a 1.3710 +/- 0.0005.
  18. Cargue la muestra en un tubo de ultracentrífuga de 11,2 ml y agregue la solución de cobertura hasta que esté llena.
  19. Centrifugar a 65.000 x g a 12 °C durante 12 h.
  20. Haga agujeros en la parte inferior y lateral del tubo de ultracentrífuga de 11,2 ml para recolectar un total de 18 fracciones de 0,5 ml cada una.
  21. Utilice 10 μL de cada fracción para verificar RI y realizar el ensayo de transferencia de puntosde ADN 46.
  22. Con base en los resultados del ensayo de transferencia de puntos de RI y ADN, determine las mejores 6 fracciones que contienen vectores AAV.
  23. Combine las mejores 6 fracciones (un total de aproximadamente 3 ml) y cárguelas en un casete de diálisis.
  24. Flote el casete de diálisis en 1,3 L de tampón de diálisis (tampón PBS suplementado con tensioactivo no iónico al 0,001%) con una barra de agitación durante 2 h para eliminar el CsCl.
  25. Repita el paso 3.24 dos veces (total 6 h de diálisis).
  26. Transfiera el casete a 500 ml de sorbitol al 5% en tampón PBS suplementado con tensioactivo al 0,001% durante 2 h para el intercambio de tampón.
  27. Recoja la muestra del casete de diálisis con una jeringa y filtre la muestra recolectada con un filtro de jeringa de PVDF de 0,22 μm.
  28. Se determinaron los títulos de AAV mediante un ensayo cuantitativo de transferencia de puntos46.

4. Evaluación de la calidad de las preparaciones de vectores AAV mediante SDS-PAGE seguida de tinción de plata

  1. Mezclar preparaciones vectoriales, 1 x 1010 vg para vectores CsCl AAV, y 1 x 109 y 1 x 1010 vg para vectores CU AAV, con 6x tampón Laemmli en un total de 18 μL (preparación vectorial: 6x Laemmli = 15:3) y calentarlos a 100 °C durante 5 min.
  2. Cargue las preparaciones del vector AAV tratadas térmicamente en un gel SDS-PAGE al 7,5% y electroforese las muestras a 20 mA utilizando un tampón de ejecución de gel Tris-glicina-SDS.
  3. Retire el gel del casete de gel, enjuáguelo con agua ultrapura y tíñelo con un kit de tinción de plata de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  4. Incube el gel cargado con vectores AAV CsCl en la solución reveladora durante 7 min, mientras incube el gel cargado con vectores CU AAV durante 2 min para evitar la saturación de la señal.
    NOTA: Las preparaciones de vectores CU AAV contienen niveles más altos de impurezas proteicas en comparación con los vectores CsCl AAV. Por lo tanto, los geles cargados con vectores CsCl AAV y CU AAV se separaron después de la ejecución del gel y se tiñeron con plata por separado para evitar la saturación de la señal debido a la alta sensibilidad del método de tinción.

5. Identificación de proteínas AAV VP en preparaciones de vectores CU AAV por western blot

  1. Mezclar 1 x 109 vg de preparaciones vectoriales CU AAV con 6x tampón Laemmli en un total de 18 μL (preparación vectorial: 6x Laemmli = 15:3) y calentarlas a 100 °C durante 5 min.
  2. Cargue las preparaciones del vector AAV tratadas térmicamente en un gel SDS-PAGE al 7,5% y electroforese las muestras a 20 mA utilizando un tampón de ejecución de gel Tris-glicina-SDS.
  3. Proteínas de electrotransferencia en el gel sobre una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF), activadas en metanol, utilizando un sistema de transferencia semiseco.
  4. Bloquear la membrana con leche desnatada al 5% en 1x solución salina tamponada con Tris con Tween 20 (TBST) a temperatura ambiente durante 1 h.
  5. Incubar la membrana bloqueada con solución de anticuerpos primarios (anticuerpo anti-VP policlonal de conejo, diluido a 1:1000 con leche desnatada al 5% en 1x TBST) a 4 °C durante la noche.
  6. Lave la membrana con 1x TBST durante 10 min, 3 veces.
  7. Incubar la membrana con solución de anticuerpos secundarios (anticuerpo IgG anti-conejo de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante, diluido a 1:5000 con leche desnatada al 5% en 1x TBST) a temperatura ambiente durante 1 h.
  8. Lave la membrana con 1x TBST durante 10 min, 3 veces.
  9. Visualice las señales en la membrana utilizando un sistema de imágenes de Western blot.

6. Inyección de pelvis renal (RP)

  1. Configuración preoperatoria y anestesia
    1. Mida el peso corporal de cada ratón en un vaso de precipitados de plástico en una escala de peso que tenga una precisión de 0,1 g.
    2. Administrar meloxicam (5 mg/kg) por vía subcutánea en función del peso corporal para proporcionar analgesia prequirúrgica.
    3. Diluya la solución vectorial AAV a una concentración de 6,0 x10 12 vg/ml con sorbitol al 5% en PBS y manténgala en hielo.
      NOTA: Prepare 40 μL más de solución AAV que el volumen total de inyección (50 μL x número de ratones a inyectar) para tener en cuenta el espacio muerto en una jeringa de vidrio hermética al gas y un tubo de polietileno PE-10.
    4. Doble y rompa solo la punta de la aguja de una aguja de 30 G con un portaagujas.
    5. Bajo un microscopio estereoscópico, conecte la punta de la aguja de 30 G, 15 cm de tubo PE-10, una aguja de 30 G y una jeringa de vidrio hermética al gas en este orden desde la punta (Figura 1D).
    6. Coloque la jeringa de vidrio hermética al gas conectada en una bomba de jeringa de infusión.
    7. Aspire 90 μl de solución vectorial AAV preparada en el paso 6.1.3 en la jeringa de vidrio hermética al gas utilizando una bomba de jeringa de infusión.
    8. Configure el modo de infusión de la bomba de jeringa de la siguiente manera: el volumen objetivo de 50 μL y un caudal de 50 μL/min.
    9. Coloque un ratón en una cámara de plástico llena de isoflurano al 4% administrado en oxígeno al 100% a un caudal de 1,5 a 3,0 L / min hasta que esté completamente anestesiado.
    10. Coloque el hocico del ratón en un cono nasal con un flujo de isoflurano de 1.5% a 3.0%. Controle la profundidad de la anestesia mediante el reflejo de pellizco del dedo del pie durante todo el procedimiento quirúrgico.
    11. Cubra los ojos con ungüento oftálmico con un aplicador con punta de algodón para prevenir la desecación de la córnea.
    12. Retire el pelaje de la parte posterior izquierda del ratón con un depilatorio con un aplicador con punta de algodón.
      NOTA: La crema depilatoria debe eliminarse por completo mediante enjuague para evitar la irritación de la piel.
    13. Coloque el ratón en posición lateral sobre una almohadilla térmica de circuito cerrado conectada a una bomba de terapia de calor para mantener la temperatura corporal a 37 °C (no es necesario asegurarlo con cinta adhesiva).
    14. Desinfecte el área afeitada con tres aplicaciones alternas de povidona yodada y etanol al 70% con un aplicador con punta de algodón con un movimiento circular que comience en el sitio de la incisión.
    15. Cubra el ratón con un paño quirúrgico estéril.
  2. Inyección de RP en el riñón izquierdo
    1. Pellizque la piel con pinzas de tejido y haga una incisión de aproximadamente 1 cm en la capa de la piel con unas tijeras quirúrgicas a nivel del ángulo costovertebral en la ubicación del riñón izquierdo.
    2. Después de hacer una incisión en la piel, corte la capa muscular a la misma longitud.
      NOTA: Si la longitud de la incisión es demasiado corta, el riñón no puede quedar expuesto y, en cambio, el bazo, que es de menor tamaño, puede quedar expuesto accidentalmente. Por otro lado, si la longitud de la incisión es demasiado larga, el riñón no se mantendrá en su lugar por la incisión en sí y se deslizará continuamente hacia el abdomen a través de la incisión.
    3. Presione suavemente el abdomen con los dedos, sin tocar directamente el riñón, de modo que el riñón quede expuesto a través del sitio de la incisión (Figura 1A).
    4. Elimine mínimamente la grasa circundante para que la pelvis renal sea visible como una pequeña área blanca.
    5. Primero, pinzar el uréter con un clip de microvasos de tipo recto, y luego la arteria renal y la vena renal junto con un clip de microvasos de tipo curvo.
      NOTA: El color del riñón se vuelve rojo oscuro, lo que confirma el bloqueo exitoso del flujo sanguíneo dentro y fuera del riñón (Figura 1B).
    6. Inserte la aguja de 30 G conectada a la bomba de jeringa aproximadamente 3 mm en la cavidad pélvica con pinzas curvas e inicie una inyección de 50 μL de solución vectorial AAV utilizando una bomba de jeringa de infusión a un caudal de 50 μL/min durante 1 min (Figura 1C).
    7. Mantenga la aguja y la pinza durante 5 minutos para aumentar la exposición del riñón inyectado al vector AAV.
      NOTA: El tiempo de permanencia apropiado puede variar y depender de las cápsidas de AAV. Se ha demostrado que un tiempo de permanencia de 5 min es suficiente para la transducción con el vector AAV-KP1 o AAV-KP3.
    8. Una vez que se complete la incubación de 5 minutos, retire las pinzas.
      NOTA: El color del riñón cambia inmediatamente de rojo oscuro a rojo sangre, lo que confirma la restauración del flujo sanguíneo en el riñón.
    9. Retire la aguja de inyección con cuidado y lentamente, colocando simultáneamente un aplicador con punta de algodón sobre el lugar de la inyección con presión. Asegúrese de que no haya sangrado en el lugar de la inyección. No es necesario aplicar un parche hemostático.
    10. Vuelva a colocar suavemente el riñón en la cavidad peritoneal.
    11. Sutura la capa muscular con sutura absorbible 6-0 y la piel con sutura monofilamento 5-0.
    12. Administre 1 ml de solución salina por vía subcutánea en la espalda de los ratones para la sujeción de líquidos.
    13. Reemplace la punta de la aguja de 30 G usada por una recién preparada, deseche la aguja de 30 G usada de acuerdo con las pautas de la institución para el manejo de desechos químicos peligrosos y cargue 50 μL de la solución vectorial AAV usando una bomba de jeringa de infusión para administrarla al siguiente ratón.
    14. Repita los pasos 6.2.12-6.2.13 para todos los ratones del grupo, excepto para el último, para el cual no se requiere el paso 6.2.13.
    15. Después de completar todas las inyecciones planificadas, deseche las agujas y los tubos de polietileno contaminados de acuerdo con las pautas de la institución para el manejo de desechos químicos peligrosos.
  3. Seguimiento y cuidados postoperatorios
    1. Administrar meloxicam (5 mg/kg) por vía subcutánea en la espalda de ratones para la analgesia posquirúrgica 24 h y 48 h después de la inyección de RP.
    2. Administrar 1 ml de solución salina por vía subcutánea en la espalda de los ratones para soporte de líquidos 24 h después de la inyección de RP.
    3. Controle el peso corporal y la apariencia general de los ratones inyectados diariamente durante 1 semana después de la operación. Si se produce una pérdida de peso corporal del 10%, administre 1 ml de solución salina por vía subcutánea en la espalda de ratones tres veces por semana durante una semana. Si no se observa mejoría, los ratones afectados son sacrificados.

7. Recolección de tejidos y criosección

  1. Preparación de la solución de fijación y crioprotección.
    1. Tampón de fosfato 0,2 M (total 1 L)
      1. Prepare 800 ml de agua ultrapura en un vaso de precipitados de vidrio de 1 l.
      2. Añadir 6,4 g de fosfato sódico monobásico (NaH2PO4) y 21,8 g de fosfato sódico dibásico (Na2HPO4) a la solución.
      3. Ajuste el pH a 7.4 con ácido clorhídrico.
      4. Llenar con agua ultrapura hasta 1 L.
      5. Conservar a 4 °C hasta su uso.
    2. Solución de paraformaldehído (PFA) al 4% (total 40 ml)
      1. Mezcle 10 ml de PFA al 16%, 20 ml de tampón de fosfato 0,2M preparado en el paso 7.1.1 y 10 ml de agua ultrapura.
      2. Alícuota de 10 ml en un tubo de polipropileno de 15 ml.
        NOTA: Prepare una solución de PFA al 4% justo antes de usarla para la fijación por perfusión.
    3. Solución de sacarosa al 30% (total 40 mL).
      1. Mezclar 30 ml de PBS con 12 g de sacarosa.
      2. Después de disolverlo por completo, llénelo con PBS a 40 ml.
  2. Fijación de perfusión y recolección de tejidos.
    PRECAUCIÓN: La fijación por perfusión debe realizarse en una campana extractora, ya que la solución de PFA al 4% es un potente producto químico nocivo si se inhala.
    1. Anestesiar al ratón con isoflurano, colocarlo en posición supina y confirmar la ausencia total de capacidad de respuesta pellizcando suavemente las extremidades.
    2. Una vez anestesiado el ratón, realizar una incisión con unas tijeras quirúrgicas desde la caudal del abdomen hasta el xifoides. Luego, haga dos incisiones laterales a cada lado del esternón y retraiga la pared torácica anteriormente para exponer el corazón y los vasos principales.
    3. Abra la aurícula derecha mediante una disección aguda para descomprimir el sistema circulatorio. Inserte una aguja de mariposa de 25 G en el ventrículo izquierdo e infunda 50 ml de PBS a una velocidad de aproximadamente 10 ml / min, dirigiendo el flujo hacia la aorta ascendente.
      NOTA: La desangración es importante para obtener imágenes de inmunofluorescencia (IF) de alta calidad porque la sangre exhibe autofluorescencia. Para garantizar la extracción completa de sangre, se utilizaron 50 ml de PBS en este estudio, aunque comúnmente se usan 20-30 ml.
    4. Infundir 20 ml de solución de PFA al 4% preparada en el paso 7.1.2 a la misma velocidad, asegurando que no se introduzca aire durante el cambio de soluciones.
    5. Recoja los tejidos y manténgalos a 4 °C durante la noche en un tubo de polipropileno de 15 ml lleno de solución de PFA al 4% para la fijación posterior. Cuando la proteína fluorescente se exprese en el tejido recolectado, cubra el tubo con papel de aluminio para protegerlo de la luz.
  3. Crioincrustación
    1. Transfiera el tejido a un tubo de polipropileno de 15 ml lleno de solución de sacarosa al 30% preparado en el paso 7.1.3 para crioprotección.
    2. Mantener a 4 °C hasta que los tejidos se hundan completamente hasta el fondo de los tubos.
    3. Transfiera el tejido a un criomold de plástico con fórceps de patrón estándar.
    4. Coloque el compuesto OCT sobre el tejido asegurándose de que el tejido esté correctamente orientado y al ras con la parte inferior del criomolde.
    5. Rellena la parte superior con compuesto OCT. Elimine las burbujas con una punta de pipeta.
    6. Coloque el criopol de plástico en un baño criogénico que contenga 2-metilbutano, enfriado con hielo seco picado en un cubo de hielo, hasta que el compuesto OCT esté completamente congelado (el compuesto OCT se volverá blanco).
    7. Guarde los bloques de tejido a -80 °C hasta su uso.
  4. Criosección
    1. Transfiera los bloques de tejido congelado a un micrótomo de criostato a -20 °C antes del corte y deje que la temperatura de los bloques de tejido congelados se equilibre.
    2. Secciona cada bloque de tejido congelado en el grosor deseado (normalmente 5 μm) utilizando el micrótomo criostato. Coloque las secciones de tejido en un portaobjetos de vidrio de microscopio para la tinción de inmunofluorescencia.
    3. Las secciones se pueden almacenar a -80 °C para su uso posterior.

8. Tinción de inmunofluorescencia

  1. Seque los portaobjetos congelados a temperatura ambiente durante 30 min.
  2. Aísle la sección con un bolígrafo bloqueador de líquidos y séquela a temperatura ambiente durante 5 min.
  3. Rehidratar secciones con 150 μL de PBS durante 10 min.
  4. Coloque los portaobjetos sobre una superficie plana y agregue 150 μL de albúmina sérica bovina (BSA) al 1% diluida con PBS por sección en los portaobjetos. Incubar a temperatura ambiente durante 45 min para bloquear.
  5. Añadir 150 μL de solución de anticuerpo primario (anticuerpo anti-Wilms Tumor 1 (WT1), diluido a 1:100 con BSA al 1%; anticuerpo anti-Na-K-2Cl cotransportador 2 (NKCC2), diluido a 1:100 con BSA al 1%; o anticuerpo anti-acuaporina 2 (AQP2), diluido a 1:100 con BSA al 1%) e incubar a 4 °C durante la noche en una cámara húmeda.
  6. Lave las secciones con PBS a temperatura ambiente durante 5 min, 3 veces.
  7. Agregue 150 μL de anticuerpo secundario (anticuerpo anti-conejo IgG Alexa Fluor 647, diluido a 1:500 con BSA al 1%) y Lectina de Lotus tetragonolobus (LTL)-fluoresceína (diluida a 1:200 con BSA al 1%), e incube a temperatura ambiente durante 60 min.
  8. Lave las secciones con PBS a temperatura ambiente durante 5 min.
  9. Coloque los portaobjetos sobre una superficie plana y agregue 150 μL de Hoechst 33342 (diluido a 1:10,000 con PBS) para tinción nuclear. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min, protegido de la luz.
  10. Lave las secciones con PBS a temperatura ambiente durante 5 min.
  11. Monte las guías con 20 μL del medio de montaje y una cubierta de vidrio. Mantenga los portaobjetos en la oscuridad a 4 °C hasta que se realicen las imágenes.

9. Extracción de ADN del tejido

  1. Extracción de ADN de tejidos utilizando un kit disponible comercialmente (ver Tabla de materiales).
    1. Transfiera el tejido a un tubo de perlas de cerámica y agregue 400 μL de tampón de extracción de ADN (100 mM de NaCl, 20 mM de EDTA, 1% de SDS y 50 mM de Tris-HCl, pH 8.0).
    2. Homogeneizar el tejido a una velocidad de 5 m/s durante 20 s en 3 ciclos utilizando un homogeneizador.
    3. Centrifugar a 2.000 x g a temperatura ambiente durante 2 min.
    4. Recoja 200 μl del sobrenadante con una pipeta P200 y agregue 10 μl de solución de proteinasa K (concentración final de 1 mg / ml).
    5. Mezclar por vórtice durante 15 s e incubar a 55 °C durante 1 h.
    6. Agregue 200 μL de tampón de lisis del kit de extracción de ADN.
    7. Mezclar en vórtice durante 15 s e incubar a 55 °C durante 15 min.
    8. Añadir 250 μL de etanol al 100%.
    9. Mezclar en vórtice durante 15 s e incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
    10. Aplique el lisado en la columna de centrifugación de extracción de ADN.
    11. Centrifugar a 6.000 x g a temperatura ambiente durante 1 min.
    12. Coloque la columna de centrifugado en un nuevo tubo de recolección de 2 ml. Agregue 500 μL del primer tampón de lavado del kit de extracción de ADN.
    13. Centrifugar a 6.000 x g a temperatura ambiente durante 1 min.
    14. Coloque la columna de centrifugado en un nuevo tubo de recolección. Agregue 500 μL del segundo tampón de lavado del kit de extracción de ADN.
    15. Centrifugar a 6.000 x g a temperatura ambiente durante 1 min.
    16. Coloque la columna de centrifugado en un nuevo tubo de recolección de 2 ml. Añadir 500 μL de etanol al 100%.
    17. Centrifugar a 6.000 x g a temperatura ambiente durante 1 min.
    18. Coloque la columna de centrifugado en un nuevo tubo de recolección de 2 ml y centrifugue a 20,000 x g a temperatura ambiente durante 3 min.
      NOTA: Este paso asegura el secado completo de la membrana de la columna de centrifugación, ya que el arrastre de etanol al eluido puede interferir con las aplicaciones posteriores.
    19. Coloque la columna de centrifugación en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Agregue 35 μL de tampón de elución del kit de extracción de ADN a la columna de centrifugación.
      NOTA: El volumen de eluido recuperado suele ser aproximadamente 5 μL menor que el volumen de tampón de elución aplicado inicialmente a la columna.
    20. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
    21. Centrifugar a 20.000 x g a temperatura ambiente durante 1 min.
    22. Mida la concentración de ADN.
  2. Cuantificación del número de copias del genoma vectorial mediante PCR cuantitativa (qPCR)
    1. Diluir el ADN extraído preparado en el paso 9.1 a una concentración de 25 ng/μL con agua de grado molecular.
    2. Diseñar un par de cebadores qPCR para la cuantificación del genoma del vector (tdTomato se utilizó en este estudio) y un par de cebadores qPCR para el gen de referencia del ratón que se utilizará para cuantificar los genomas diploides en las muestras de ADN extraídas (en este estudio se utilizó el gen agutí del ratón).
      NOTA: Las secuencias de cebadores utilizadas en este estudio son las siguientes;
      tdTomate delantero: 5'-TATGAACGGAGAGGAGGGGAG-3'
      tdTomate reverso: 5'-TTCCACTAGACCCTGAGCCG-3'
      ratón agutí hacia adelante: 5'-GGCGTGGTCAGTGGTTGTG-3'
      ratón agutí reverso: 5'-TTTAGCTTCCACTAGGTTTCCTAGAAA-3'
    3. Para una reacción de qPCR de 25 μl, mezcle 4 μl de muestra de ADN diluido en el paso 9.2.1 (un total de 100 ng de ADN en una mezcla de reacción de 25 μl), 12,5 μl de tampón de reacción qPCR 2x, 0,5 μl de cebes directos e inversos de 20 μM preparados en el paso 9.2.2 (concentración final de 400 nM de cada cebador), y 7,5 μL de agua de grado molecular.
    4. Mida la concentración de ADN de los estándares plasmídicos para qPCR cuatro veces y determine el valor promedio de la concentración de ADN.
      NOTA: El plásmido pAAV-CAG-tdTomato circular superenrollado y un plásmido circular superenrollado que contiene la secuencia diana de PCR derivada del gen agutí de ratón se utilizaron para la cuantificación y normalización del genoma del vector, respectivamente, en este estudio.
    5. Prepare una serie de diluciones en serie 1:10 de estándares de ADN plasmídico que cubran un rango dinámico de 106.
      NOTA: Cada muestra y estándar debe analizarse al menos por duplicado.
    6. Realice qPCR utilizando las siguientes condiciones de ciclo térmico: un paso inicial de activación por calor a 95 °C durante 10 min, seguido de 35 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 15 s, y recocido/extensión a 60 °C durante 30 s.
    7. Después de completar la reacción de qPCR y obtener los valores del número de copias bicatenarias (ds) de los genomas vectoriales y el gen de referencia del ratón en las muestras, determine el número de copias del genoma del vector ds por equivalente genómico diploide (ds-vg/dge) normalizando el número de copias del genoma del vector ds al número de copias del gen de referencia en cada muestra en función de las curvas estándar generadas a partir de concentraciones conocidas tanto del genoma del vector como del gen de referencia.
      NOTA: Ds-vg / dge se puede determinar en función de la siguiente aproximación de que 100 ng de ADN genómico de ratón representan 16,900 células de ratón diploides (2N) (es decir, 5.92 pg de ADN por célula de ratón diploide).

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Resultados

Un estudio reciente ha identificado un pequeño subconjunto de cápsidas de AAV que exhibe una mejora notable de la transducción renal en comparación con AAV9 después de la inyección de RP38. El subconjunto identificado incluye AAV-KP3, una cápside quimérica de AAV generada por la mezcla de ADN41. Por lo tanto, AAV-KP3 fue elegido para la inyección de RP en este estudio, junto con AAV9 como punto de referencia. El vector AAV9-CAG-tdTomato (AA...

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Discusión

Este informe ha detallado la inyección retrógrada lenta de vectores AAV como método de administración local para la administración de genes al riñón del ratón. Un paso crítico para realizar la inyección de RP de manera segura es el ajuste de la tasa de inyección de los vectores AAV para evitar daños parenquimatosos en los riñones inyectados. En un informe anterior sobre la inyección hidrodinámica de pelvis renal, se inyectaron 100 μL de solución de ADN plasmídico en el riñón del ratón en...

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Divulgaciones

H.N. recibe una regalía de tecnologías relacionadas con AAV con licencia de Takara Bio Inc. y Capsigen Inc., se desempeña como consultor para empresas de biotecnología, es cofundador de Capsigen Inc. y posee acciones de Capsigen Inc. y Sphere Gene Therapeutics.

Agradecimientos

Agradecemos a Guangping Gao y James M. Wilson por proporcionarnos el plásmido auxiliar de AAV9 y a Katja Pekrun y Mark A. Kay por el plásmido auxiliar de AAV-KP3.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0.45 μm PVDF syringe filterMilliporeSigmaSLHVR33RS
1.5 mL microcentrifuge tube Fisher Scientific05-408-129
15 mL polypropylene tubeCorning352097
16% paraformaldehyde (PFA)Electron Microscopy Sciences15710
250 mL centrifuge bottleFisher Scientific055641S24
2F Silicone tubingSai Infusion TechnologiesSIL-2-50 
25G butterfly needleMedex Supply26708
2-methylbutaneMilliporeSigmaMX0760
2x qPCR reaction bufferFisher Scientific43-676-59Power SYBR Green PCR Master Mix
30G needleBecton-Dickinson & Co305106
50 mL polypropylene tubeCorning430291
5-0 monofilament sutureEthiconY463G
5 M NaClLonza51202
6-0 absorbable sutureEthiconJ489G
7.5% Mini-PROTEAN TGX Precast
Protein Gels, 10-well, 30 µL		Bio-Rad4561023
Amersham ImageQuant 800 Western
Blot Imaging System (Cytiva)		Cytiva29459405
Amicon 100 kDa MWCO, 15 mL tubeMillipore SigmaUFC910024
Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibodyAbcamab199975Un marcador para las células de los conductos colectores
Anti-Na-K-2Cl cotransporter 2
(NKCC2) antibody		StressMarq BiosciencesSPC-401Un marcador para las células del asa ascendente gruesa
Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647
antibody		Jackson ImmunoResearch111-605-144
Anti-Wilms Tumor 1 (WT1) antibodyAbcamab89901Un marcador para los podocitos
Beckman Coulter OptiSeal Tube,
Polypropylene, 29.9 mL		Fisher ScientificNC9691210
Beckman Coulter OPTISEAL TUBESFisher ScientificNC9611575
BenzonaseSigma-Aldrich1016970001
Bovine serum albumin (BSA)Sigma-Aldrich5470
Centrifugal ultrafiltration tubeMilliporeSigmaUFC9100Amicon 100 kDa MWCO, 15 mL
Ceramic bead tubeFisher Scientific15-340-154
Cesium chlorideSigma-AldrichC3032-1KG
Clamp applying forcepsFine Science Tools00071-14
Closed-loop heat padStryker Medical8002-062-012
Cotton-tipped applicatorPuritan806-WC
Cover glassFisher Scientific12-541B
Cryostat microtomeTanner ScientificTN50
Curved forcepsFine Science Tools11052-10
Curved-type micro vessel clipKleinert-Kutz65145Pinza para la arteria renal y la vena
renal
Dialysis cassetteFisher ScientificPIA52976
DNA extraction kitQiagen57704QIAamp MinElute Virus Spin Kit
D-SorbitolSigma-AldrichS6021-1KG
Dulbecco's Modified Eagle Medium-
high glucose		Corning15-013-CVDMEM-high glucose (4.5 g/L)
EDTAFisher Scientific15-575-020
EthanolDecon Laboratories2716GEA
Fetal bovine serum (FBS)VWR89510-186
Gas-tight glass syringeHamilton1710 TLL
Glutaraldehyde solutionSigma-AldrichG6257
Heat therapy pumpKent ScientificHTP-1500
HEPESSigma AldrichH4034-100G
Hoechst 33342InvitrogenH3570
HomogenizerFisher Scientific15-340-163
Human embryonic kidney (HEK) 293
cells		Agilent240073
Ice bucketFisher Scientific07-210-104
Infusion syringe pumpHarvard Apparatus70-4507
IsofluranePiramal Critical CareNDC 66794-017-10
L-glutamineFisher Scientific25030-081
Liquid blocker penTed Pella22309
Lotus tetragonolobus lectin (LTL)-
Fluorescein		Vector LaboratoriesFL-1321-2Un marcador para los túbulos proximales
Magnesium chloride (MgCl2)MilliporeSigmaM1028
MeloxicamVetOneNDC 86136-012-10Analgésico
Microscope glass slideFisher Scientific12-550-15
Mounting mediumSouthernBiotech0100-01
Needle holderFine Science Tools12501-13
OCT compoundSakura Finetek4583
Ophthalmic ointmentBausch & LombNDC 24208-313-34
PE-10 polyethylene tubeBD427401Diámetro interior: 0,28 mm
Penicillin & Streptomycin MixFisher Scientific15140-122
Phosphate-buffered saline (PBS)Fisher Scientific10010-049
Plastic cryomoldSakura Finetek4566
Poloxamer 188 Non-ionic Surfactant
(10%)		Fisher Scientific24-04

Referencias

  1. Groopman, E. E., et al. Diagnostic utility of exome sequencing for kidney disease. N Engl J Med. 380 (2), 142-151 (2019).
  2. Hussien, H., Apetrii, M., Covic, A. Health-related quality of life in patients with chronic kidney disease. Expert Rev Pharmacoecon Outcomes Res. 21 (1), 43-54 (2021).
  3. Peek, J. L., Wilson, M. H. Cell and gene therapy for kidney disease. Nat Rev Nephrol. 19 (7), 451-462 (2023).
  4. Khare, V., Cherqui, S. Targeted gene therapy for rare genetic kidney diseases. Kidney Int. 106 (6), 1051-1061 (2024).
  5. Medaer, L., Veys, K., Gijsbers, R. Current status and prospects of viral vector-based gene therapy to treat kidney diseases. Hum Gene Ther. 35 (5-6), 139-150 (2024).
  6. Tavakolidakhrabadi, N., Ding, W. Y., Saleem, M. A., Welsh, G. I., May, C. Gene therapy and kidney diseases. Mol Ther Methods Clin Dev. 32 (4), 101333(2024).
  7. Miyazaki, M., Yamashita, T., Miyazaki, T., Taira, H., Suzuki, A. Gene delivery to renal tubular epithelial cells using adeno-associated virus vector in domestic cats. Res Vet Sci. 87 (3), 408-412 (2009).
  8. Qi, Y. F., et al. Comparison of the transduction efficiency of tyrosine-mutant adeno-associated virus serotype vectors in kidney. Clin Exp Pharmacol Physiol. 40 (1), 53-55 (2013).
  9. Takeda, S., et al. Successful gene transfer using adeno-associated virus vectors into the kidney: Comparison among adeno-associated virus serotype 1-5 vectors in vitro and in vivo. Nephron Exp Nephrol. 96 (4), e119-e126 (2004).
  10. Zhong, F., et al. Protein S Protects against Podocyte Injury in Diabetic Nephropathy. J Am Soc Nephrol. 29 (5), 1397-1410 (2018).
  11. Chen, S., et al. Gene delivery in renal tubular epithelial cells using recombinant adeno-associated viral vectors. J Am Soc Nephrol. 14 (4), 947-958 (2003).
  12. Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: Conclusion of a comparative study. Gene Ther. 21 (6), 618-628 (2014).
  13. Wang, P., et al. Long noncoding RNA lnc-TSI inhibits renal fibrogenesis by negatively regulating the TGF-β/Smad3 pathway. Sci Transl Med. 10 (462), eaat2039(2018).
  14. Haddad, G., et al. Renal AAV2-mediated overexpression of long non-coding RNA H19 attenuates ischemic acute kidney injury through sponging of microRNA-30a-5p. J Am Soc Nephrol. 32 (2), 323-341 (2021).
  15. Asico, L. D., et al. Nephron segment-specific gene expression using AAV vectors. Biochem Biophys Res Commun. 497 (1), 19-24 (2018).
  16. Chung, D. C., et al. Adeno-associated virus-mediated gene transfer to renal tubule cells via a retrograde ureteral approach. Nephron Extra. 1 (1), 217-223 (2011).
  17. Ito, K., et al. Adeno-associated viral vector transduction of green fluorescent protein in kidney: Effect of unilateral ureteric obstruction. BJU Int. 101 (3), 376-381 (2008).
  18. Konkalmatt, P. R., et al. Renal rescue of dopamine D2 receptor function reverses renal injury and high blood pressure. JCI Insight. 1 (8), e85888(2016).
  19. Rubin, J. D., Nguyen, T. V., Allen, K. L., Ayasoufi, K., Barry, M. A. Comparison of gene delivery to the kidney by adenovirus, adeno-associated virus, and lentiviral vectors after intravenous and direct kidney injections. Hum Gene Ther. 30 (12), 1559-1571 (2019).
  20. Saito, S., et al. rAAV6-mediated miR-29b delivery suppresses renal fibrosis. Clin Exp Nephrol. 23 (12), 1345-1356 (2019).
  21. Shen, X., et al. Transparenchymal renal pelvis injection of recombinant adeno-associated virus serotype 9 vectors is a practical approach for gene delivery in the kidney. Hum Gene Ther Methods. 29 (6), 251-258 (2018).
  22. Wang, J. N., et al. Inhibition of METTL3 attenuates renal injury and inflammation by alleviating TAB3 m6A modifications via IGF2BP2-dependent mechanisms. Sci Transl Med. 14 (640), eabk2709(2022).
  23. Woodard, L. E., et al. Kidney-specific transposon-mediated gene transfer in vivo. Sci Rep. 7, 44904(2017).
  24. Woodard, L. E., et al. Hydrodynamic renal pelvis injection for non-viral expression of proteins in the kidney. J Vis Exp. (131), e56324(2018).
  25. Yadav, M. K., Yoo, K. W., Atala, A., Lu, B. Lentiviral vector mediated gene therapy for type Dent disease ameliorates Dent disease-like phenotypes for three months in CIC-5 null mice. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 149-166 (2022).
  26. Hillestad, M. L., Guenzel, A. J., Nath, K. A., Barry, M. A. A vector-host system to fingerprint virus tropism. Hum Gene Ther. 23 (10), 1116-1126 (2012).
  27. Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Mol Ther. 16 (6), 1073-1080 (2008).
  28. Ikeda, Y., Sun, Z., Ru, X., Vandenberghe, L. H., Humphreys, B. D. Efficient gene transfer to kidney mesenchymal cells using a synthetic adeno-associated viral vector. J Am Soc Nephrol. 29 (9), 2287-2297 (2018).
  29. Williams, R. M., et al. Mesoscale nanoparticles selectively target the renal proximal tubule epithelium. Nano Lett. 15 (4), 2358-2364 (2015).
  30. Lang, J. F., Toulmin, S. A., Brida, K. L., Eisenlohr, L. C., Davidson, B. L. Standard screening methods underreport AAV-mediated transduction and gene editing. Nat Commun. 10 (1), 3415(2019).
  31. Koike, H., et al. An efficient gene transfer method mediated by ultrasound and microbubbles into the kidney. J Gene Med. 7 (1), 108-116 (2005).
  32. Ishida, R., et al. Kidney-specific sonoporation-mediated gene transfer. Mol Ther. 24 (1), 125-134 (2016).
  33. Davis, L., Park, F. Gene therapy research for kidney diseases. Physiol Genomics. 51 (9), 449-461 (2019).
  34. Rubin, J. D., Barry, M. A. Improving molecular therapy in the kidney. Mol Diagn Ther. 24 (4), 375-396 (2020).
  35. Huang, S., et al. Application of ultrasound-targeted microbubble destruction-mediated exogenous gene transfer in treating various renal diseases. Hum Gene Ther. 30 (2), 127-138 (2019).
  36. Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nat Rev Drug Discov. 18 (5), 358-378 (2019).
  37. Wang, J. H., Gessler, D. J., Zhan, W., Gallagher, T. L., Gao, G. Adeno-associated virus as a delivery vector for gene therapy of human diseases. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 78(2024).
  38. Furusho, T., et al. Enhancing gene transfer to renal tubules and podocytes by context-dependent selection of AAV capsids. Nat Commun. 15 (1), 10728(2024).
  39. Ding, W. Y., et al. Adeno-associated virus gene therapy prevents progression of kidney disease in genetic models of nephrotic syndrome. Sci Transl Med. 15 (708), eabc8226(2023).
  40. Wu, G., et al. Adeno-associated virus-based gene therapy treats inflammatory kidney disease in mice. J Clin Invest. 134 (17), e174722(2024).
  41. Pekrun, K., et al. Using a barcoded AAV capsid library to select for clinically relevant gene therapy vectors. JCI Insight. 4 (22), e131610(2019).
  42. Grimm, D., et al. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. J Virol. 82 (12), 5887-5911 (2008).
  43. Shen, S., et al. Engraftment of a galactose receptor footprint onto adeno-associated viral capsids improves transduction efficiency. J Biol Chem. 288 (40), 28814-28823 (2013).
  44. Dalkara, D., et al. In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous. Sci Transl Med. 5 (189), 189ra176(2013).
  45. Gomes, M. M., Wang, L., Jiang, H., Kahl, C. A., Brigande, J. V. A rapid, cost-effective method to prepare recombinant adeno-associated virus for efficient gene transfer to the developing mouse inner ear. Methods Mol Biol. 1427, 43-57 (2016).
  46. Powers, J. M., Chang, X. L., Song, Z., Nakai, H. A Quantitative dot blot assay for AAV titration and its use for functional assessment of the adeno-associated virus assembly-activating proteins. J Vis Exp. (136), e56766(2018).
  47. Adachi, K., Enoki, T., Kawano, Y., Veraz, M., Nakai, H. Drawing a high-resolution functional map of adeno-associated virus capsid by massively parallel sequencing. Nat Commun. 5, 3075(2014).
  48. Lu, Z. Y., et al. Constitutive and conditional gene knock-out mice for the study of intervertebral disc degeneration: Current status, decision considerations, and future possibilities. JOR Spine. 6 (1), e1242(2023).
  49. Kaspar, B. K., et al. Adeno-associated virus effectively mediates conditional gene modification in the brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (4), 2320-2325 (2002).
  50. Werfel, S., et al. Rapid and highly efficient inducible cardiac gene knock-out in adult mice using AAV-mediated expression of Cre recombinase. Cardiovasc Res. 104 (1), 15-23 (2014).
  51. Jinek, M., et al. A Programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  52. Wang, X., Huang, X., Fang, X., Zhang, Y., Wang, W. CRISPR-Cas9 system as a versatile tool for genome engineering in human cells. Mol Ther Nucleic Acids. 5 (11), e388(2016).
  53. Ueki, K., et al. Establishment of pancreatic -cell-specific gene knock-out system based on CRISPR-Cas9 technology with AAV8-mediated gRNA delivery. Diabetes. 72 (11), 1609-1620 (2023).
  54. Marichal-Gallardo, P., et al. Single-use capture purification of adeno-associated viral gene transfer vectors by membrane-based steric exclusion chromatography. Hum Gene Ther. 32 (17-18), 959-974 (2021).
  55. Guo, P., et al. Rapid and simplified purification of recombinant adeno-associated virus. J Virol Methods. 183 (2), 139-146 (2012).
  56. Chen, S. H., et al. A simple, two-step, small-scale purification of recombinant adeno-associated viruses. J Virol Methods. 281, 113863(2020).

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