Method Article

Entrega efectiva y segura de genes al riñón de ratón mediante inyección lenta retrógrada en la pelvis renal de vectores de virus adenoasociados

DOI:

10.3791/67716

⸱

August 1st, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Medical Genetics, Oregon Health & Science University, 2Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health & Science University, 3Division of Neuroscience, Oregon National Primate Research Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este informe detalla el método de inyección localizada de vectores AAV a través de la pelvis renal para una transferencia de genes efectiva y segura al riñón del ratón.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El desarrollo de herramientas y métodos in vivo eficaces para la administración de genes al riñón es crucial para avanzar en la investigación renal básica y la terapia génica para las enfermedades renales. Además, la creciente conciencia sobre las enfermedades renales monogénicas, impulsada por pruebas genéticas avanzadas, subraya el potencial de la terapia génica para tratar e incluso curar enfermedades renales genéticas difíciles de tratar. En este sentido, los vectores de virus adenoasociados (AAV) han atraído una atención cada vez mayor como una plataforma sólida para la administración de genes in vivo ; sin embargo, aún no se ha establecido completamente el método más eficaz y seguro para la administración de genes mediada por vectores AAV a cada tipo de célula terapéuticamente relevante en el riñón. Aquí, se detalla el método de inyección lenta de pelvis renal retrógrada (RP) de vectores AAV, y se demuestra su alto potencial para transducir riñones de ratón cuando se usa con cápsidas AAV seleccionadas adecuadamente. Además, se ha demostrado que este método es eficaz no solo con los vectores AAV (CsCl AAV) purificados por ultracentrifugación de cloruro de cesio estándar, sino también con minipreparados vectoriales AAV (CU AAV) ultrafiltrados centrífugamente, que se pueden preparar de forma rápida y sencilla utilizando técnicas que no requieren experiencia especializada en vectores AAV. Como ejemplo, este estudio demuestra que la inyección lenta de RP de los vectores CsCl y CU AAV-KP3 da como resultado una transducción robusta de túbulos proximales en el riñón del ratón sin daño tisular aparente, a diferencia de los enfoques hidrodinámicos informados anteriormente que inevitablemente conducen al daño tisular. Por lo tanto, este estudio destaca que la inyección lenta de RP retrógrada de vectores seleccionados derivados de la cápside de AAV es un método eficaz y seguro para la administración de genes al riñón. Este método será aplicable a un amplio espectro de investigación renal, incluidos los estudios de terapia génica. El uso de minipreparados vectoriales CU AAV aumentará significativamente el rendimiento y mejorará la eficiencia de tiempo y costos necesarios para generar datos preliminares y obtener información crucial.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los métodos eficaces y seguros para la administración de genes al riñón en animales experimentales pequeños y grandes brindan oportunidades cruciales para avanzar en la investigación renal básica y explorar enfoques terapéuticos innovadores. El establecimiento de tales métodos es particularmente relevante para la terapia génica para diversas enfermedades renales. Los avances recientes en las pruebas genéticas clínicas han revelado una mayor prevalencia de trastornos renales monogénicos de lo estimado anteriormente, afectando aproximadamente al 30% de los pacientes con enfermedades renales crónicas (ERC)1. La ER....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los experimentos con animales descritos aquí fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Salud y Ciencias de Oregón (OHSU) y se realizaron de acuerdo con las pautas para el cuidado de animales en OHSU. En este estudio, se utilizaron ratones machos C57BL / 6J de ocho semanas de edad. Los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Producción de vectores AAV mediante una transfección de plásmido libre de adenovirus

  1. Cultivo de 293 células de riñón embrionario huma....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un estudio reciente ha identificado un pequeño subconjunto de cápsidas de AAV que exhibe una mejora notable de la transducción renal en comparación con AAV9 después de la inyección de RP38. El subconjunto identificado incluye AAV-KP3, una cápside quimérica de AAV generada por la mezcla de ADN41. Por lo tanto, AAV-KP3 fue elegido para la inyección de RP en este estudio, junto con AAV9 como punto de referencia. El vector AAV9-CAG-tdTomato (AA.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este informe ha detallado la inyección retrógrada lenta de vectores AAV como método de administración local para la administración de genes al riñón del ratón. Un paso crítico para realizar la inyección de RP de manera segura es el ajuste de la tasa de inyección de los vectores AAV para evitar daños parenquimatosos en los riñones inyectados. En un informe anterior sobre la inyección hidrodinámica de pelvis renal, se inyectaron 100 μL de solución de ADN plasmídico en el riñón del ratón en.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

H.N. recibe una regalía de tecnologías relacionadas con AAV con licencia de Takara Bio Inc. y Capsigen Inc., se desempeña como consultor para empresas de biotecnología, es cofundador de Capsigen Inc. y posee acciones de Capsigen Inc. y Sphere Gene Therapeutics.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Guangping Gao y James M. Wilson por proporcionarnos el plásmido auxiliar de AAV9 y a Katja Pekrun y Mark A. Kay por el plásmido auxiliar de AAV-KP3.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,45 & mu; Filtro de jeringuilla m PVDFMilliporeSigmaSLHVR33RS
Tubo microcentrífuga de 1,5 mL  Fisher Scientific05-408-129
Tubo de polipropileno de 15 mLCorning352097
16% de paraformaldehído (PFA)Ciencias de la Microscopía Electrónica15710
Bote centrífuga de 250 mLFisher Scientific055641S24
Tubo de silicona 2FTecnologías de infusión SaiSIL-2-50 
Aguja mariposa de 25GMedex Supply26708
2-metilbutanoMilliporeSigmaMX0760
2x buffer de reacción qPCRFisher Scientific43-676-59Power SYBR Green PCR Master Mix
Aguja de 30GBecton-Dickinson & Co305106
Tubo de polipropileno de 50 mLCorning430291
Sutura monofilamento 5-0EthiconY463G
5 M NaClLonza51202
Sutura absorbible 6-0EthiconJ489G
7,5% Mini-PROTEAN TGX Precast
Geles proteicos, 10-pozos, 30 y micro; L		Bio-Rad4561023
Sistema de imagen de manchas Amersham ImageQuant 800 Western
(Cytiva)		Cytiva29459405
Amicon 100 kDa MWCO, tubo de 15 mLMillipore SigmaUFC910024
Anticuerpo antiacuporina 2 (AQP2)Abcamab199975Un marcador para la recogida de celdas de conducto
Anticuerpo cotransportador anti-Na-K-2Cl 2
(NKCC2)		EstrésMarq BiocienciasSPC-401Un marcador para células gruesas ascendentes de la extremidad
Anticuerpo anticonejo IgG Alexa Fluor 647
Jackson ImmunoResearch111-605-144
Anticuerpo Anti-Wilms Tumor 1 (WT1)Abcamab89901Un marcador para podocitos
Beckman Coulter OptiSeal Tube,
polipropileno, 29,9 mL		Fisher ScientificNC9691210
TUBOS OPTISARIOS Beckman CoulterFisher ScientificNC9611575
BenzonaseSigma-Aldrich1016970001
Albúmina sérica bovina (BSA)Sigma-Aldrich5470
Tubo de ultrafiltración centrífugaMilliporeSigmaUFC9100Amicon 100 kDa MWCO, 15 mL
Tubo de cuentas cerámicasFisher Scientific15-340-154
Cloruro de cesioSigma-AldrichC3032-1KG
Pinza aplicando pinzasHerramientas Científicas Fines00071-14
Almohadilla térmica de circuito cerradoStryker Medical8002-062-012
Aplicador con punta de algodónPuritano806-WC
Vidrio de cubiertaFisher Scientific12-541B
Microtomo criostatoTanner ScientificTN50
Pinzas curvasHerramientas Científicas Fines11052-10
Clip curvo para microrecipientesKleinert-Kutz65145Pinza para la arteria renal y la vena renal
Casete de diálisisFisher ScientificPIA52976
Kit de extracción de ADNQiagen57704Kit de spinado del virus QIAamp MinElute
D-SorbitolSigma-AldrichS6021-1KG
Dulbecco's Modified Eagle Medium-
glucosa alta		Corning15-013-CVDMEM-glucosa alta (4,5 g/L)
EDTAFisher Scientific15-575-020
EtanolLaboratorios de Descontaminación2716GEA
Suero fetal bovino (FBS)VWR89510-186
Jeringuilla de vidrio hermética a gasHamilton1710 TLL
Solución de glutaraldehídoSigma-AldrichG6257
Bomba de terapia de calorKent ScientificHTP-1500
HEPESSigma AldrichH4034-100G
Hoechst 33342InvitrogenH3570
HomogeneizadorFisher Scientific15-340-163
Células de riñón embrionario humano (HEK) 293
Agilent240073
Cubo de hieloFisher Scientific07-210-104
Bomba de jeringuilla de infusiónAparato de Harvard70-4507
IsofluranoCuidados Críticos Piramal.NDC 66794-017-10
L-glutaminaFisher Scientific25030-081
Bolígrafo bloqueador de líquidosTed Pella22309
Lotus tetragonolobus lectina (LTL)-
Fluoresceína		Laboratorios VectorFL-1321-2Un marcador para los túbulos proximales
Cloruro de magnesio (MgCl2)MilliporeSigmaM1028
MeloxicamVetOneNDC 86136-012-10Analgésicos
Portaobjetos de microscopioFisher Scientific12-550-15
Medio de montajeSouthernBiotech0100-01
PortaagujasHerramientas Científicas Fines12501-13
Compuesto OCTSakura Finetek4583
Pomada oftálmicaBausch & LombNDC 24208-313-34
Tubo de polietileno PE-10BD427401Diámetro interior: 0,28 mm
Penicilina y Mezcla de estreptomicinaFisher Scientific15140-122
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Fisher Scientific10010-049
Criomold de plásticoSakura Finetek4566
Tensioactivo no iónico
Poloxamer 188 (10%)		Fisher Scientific24-040-032
Polietileno Glicol 8000Fisher ScientificBP233-1
Polietilenimina (PEI)Policiencias23966
Yodo de povidonaCompañía Química Ricca395516
Filtro de Poder Limitado y guiño; Sistema de transferencia semiseco
Fisher ScientificPB0010
Solución de proteinasa KFisher Scientific25530049
Rabbit anti-Anti-Anti-Adeno-Asociado
Virus (AAV), VP1, VP2, VP3		Productos de Investigación Americanos03-61084
SarkosylFisher ScientificBP234-500
Tubo de 2 mL con tapón de roscaAxígeno de CorningSCT-200-SS-O-S
Kit de tinte de plataSigma-AldrichPROTSIL1-1KT
Cloruro de sodio (NaCl)Fisher ScientificS271
Fosfato sódico dibásico
(Na2HPO4)		MilliporeSigmaS0876
Fosfato de sodio mono
(NaH2PO4)		MilliporeSigmaS0751
SorbitolMilliporeSigmaS6021
Pinzas de patrón estándarHerramientas Científicas Fines11000-12
Cortina quirúrgica estérilTecnologías de Infusión SAIPSS5-1519
Clip micro para recipientes de tipo rectoHerramientas Científicas Fines00396-01Pinza para el uréter
SacarosaFisher ScientificS5
Tijeras quirúrgicasHerramientas Científicas Fines14058-09
Matraz T225Corning431082
Bisturí Technocut #11Myco Medical Supplies Inc.6008T-11
Pinzas tisularesInstrumento Quirúrgico RobozRS-5155

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Groopman, E. E., et al. Diagnostic utility of exome sequencing for kidney disease. N Engl J Med. 380 (2), 142-151 (2019).
  2. Hussien, H., Apetrii, M., Covic, A. Health-related quality of life in patients with chronic kidney disease. Expert Rev Pharmaco....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Gene DeliveryMouse KidneyAAV VectorsRetrograde Renal InjectionKidney Gene TherapyProximal Tubule TransductionCsCl AAVCU AAVKidney Disease ModelsIn Vivo Transduction
Video Coming Soon

Related Articles