Los trastornos de la laminopatía a menudo conducen a cambios en la envoltura nuclear, lo que puede causar ampollas y fugas nucleares. Este estudio presenta un método de inmunofluorescencia para visualizar la lámina nuclear junto con el ADN bicatenario (dsDNA), proporcionando un medio para evaluar la estructura nuclear y la integridad en células de mamíferos.
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Artículo de método
Detección de ampollas nucleares y fugas de ADN en células de mamíferos mediante inmunofluorescencia
En este artículo
Resumen
Resumen
La lámina nuclear es una red de filamentos subyacentes a la membrana nuclear, compuesta por láminas y proteínas asociadas a las láminas. Desempeña un papel fundamental en la arquitectura nuclear, el posicionamiento de los poros nucleares, la regulación de la expresión génica, la organización de la cromatina, la replicación del ADN y la reparación del ADN. Las mutaciones en los genes implicados en la expresión o el procesamiento postraduccional de las proteínas laminar dan lugar a trastornos genéticos conocidos como laminopatías. Específicamente, las mutaciones en los genes LMNA o ZMPSTE24 pueden conducir a la acumulación de formas incompletamente procesadas de lamina A que retienen grupos farnesilo y metilo, que están ausentes en la lamina A completamente procesada. Estas proteínas de la lámina A procesadas incompletamente se localizan en la membrana nuclear interna en lugar de en la lámina nuclear, donde reside la lámina A madura. Las proteínas laminar mal localizadas alteran profundamente la función y la estructura nuclear, lo que a menudo resulta en la formación de ampollas nucleares. En casos graves, puede producirse una ruptura nuclear, lo que provoca una pérdida de compartimentación y fuga de ADN genómico en el citosol. La estructura nuclear anormal y la pérdida de compartimentación se pueden identificar a través de inmunofluorescencia indirecta (IF) en células fijas. Este estudio describe un método de este tipo, empleando anticuerpos específicos contra una proteína lamina y el ADN bicatenario (dsDNA) para visualizar simultáneamente la envoltura nuclear y el ADN. Este enfoque permite una evaluación rápida de la integridad estructural nuclear y la posible fuga de ADN nuclear en el citosol.
Introducción
La lámina nuclear es una red de filamentos que subyace a la membrana nuclear y está formada por proteínas llamadas laminas. La lámina nuclear desempeña un papel esencial en la arquitectura nuclear, el posicionamiento de los poros nucleares, la regulación de la expresión génica, la organización de la cromatina, la replicación del ADN y la reparación del ADN 1,2,3. Las mutaciones en los genes que desempeñan un papel en la expresión de las proteínas lamina conducen a trastornos genéticos llamados laminopatías3.
La dermopatía restrictiva (RD) es un trastorno grave de la laminopatía causada principalmente por mutaciones heterocigóticas compuestas que crean codones de terminación prematura en el genZMPSTE24 4, lo que conduce a la ausencia de la metaloproteasa ZMPSTE24. Esta laminopatía se caracteriza por retraso del crecimiento intrauterino, piel tensa y rígida, boca de tamaño pequeño, pelo fino y defectos de mineralización ósea1. Los pacientes con RD generalmente no viven más allá de su primera semana de vida debido a la insuficiencia pulmonar1. Otros dos trastornos de la laminopatía conocidos como síndrome de progeria atípico de Hutchinson-Gilford (AT-HGPS) y displasia mandibuloacral tipo B (MAD-B) implican una expresión ZMPSTE24 reducida y se asocian con una menor esperanza de vida y muestran similitudes con los trastornos del envejecimiento prematuro5. La proteasa ZMPSTE24 que se ve afectada en estas laminopatías es vital en la modificación postraduccional de la lámina A, que es un componente crítico de la lámina nuclear. ZMPSTE24 deficiencia da lugar a la acumulación de una forma farnesilada procesada incompletamente de la lamina A, conocida como prelamina A2.
Figura 1: Procesamiento de Lamin A en normal vs. Células RD. Vía de procesamiento de la lamina A en células normales (izquierda) y procesamiento alterado de la lamina A en células RD, o deficientes en ZMPSTE (derecha). Los grupos farnesilo (Fa) y metilo (Me) están indicados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Como se ve en la Figura 1, en el procesamiento normal de la lamina A, un grupo farnesilo (lípido) se une a un residuo de cisteína cerca del extremo C-terminal, seguido de una escisión proteolítica de tres aminoácidos C-terminales 3,6. A continuación, el residuo de cisteína se metila. Estas dos modificaciones permiten que la prelamina A se dirija a la membrana nuclear interna2. A continuación, ZMPSTE24 lleva a cabo una reacción de escisión en la que los últimos 15 aminoácidos C-terminales, junto con los grupos farnesilo y metilo, se eliminan para producir la proteína Lamin A madura, que se entrega a la lámina nuclear 6,7,8. En RD, AT-HGPS y MAD-B, el paso final del procesamiento no ocurre de manera efectiva ya que la metaloproteinasa ZMPSTE24 está ausente o no es completamente funcional 8,9. Esto da lugar a la acumulación de prelamina A, que permanece permanentemente farnesilada y metilada9. Estos últimos grupos hacen que la prelamina A se adhiera a la membrana nuclear interna en lugar de localizarse en la lámina nuclear, donde debería residir en última instancia la lámina A madura, como se ve en la Figura 1. Por lo tanto, la deficiencia de ZMPSTE tiene efectos profundos en una variedad de funciones nucleares, junto con la estructura nuclear10,11,12,13,14,15. Estas alteraciones de la estructura nuclear pueden incluir la formación de burbujas nucleares e incluso la ruptura nuclear, que puede dar lugar a la fuga de ADN en el citosol, así como a la entrada de citosol en el núcleo. Los núcleos de forma aberrante son, de hecho, un sello distintivo de los trastornos de laminopatía, junto con muchos otros fenotipos que son causados por un procesamiento defectuoso de la prelamina A16,17. Los defectos en la lámina nuclear conducen a una multitud de impactos perjudiciales, incluida la mala localización del control de calidad de las proteínas nucleares y las proteínas de reparación del ADN en el nucleoplasma, lo que, a su vez, da lugar a numerosos defectos en la función nuclear18. Es importante contar con una técnica sencilla que pueda ayudar a identificar y monitorizar estas características distintivas de las laminopatías para facilitar la investigación en el desarrollo de enfoques terapéuticos destinados a mejorar los fenotipos de las laminopatías. En ratones con laminopatías, se ha demostrado que la eliminación de la ampolla nuclear se correlaciona con la eliminación generalizada de los fenotipos de laminopatía16. Una técnica que permite monitorear la integridad nuclear en células humanas podría mejorar el estudio de posibles tratamientos para eliminar o mejorar significativamente los fenotipos de enfermedades.
La inmunofluorescencia indirecta (FI) es una técnica sensible y ampliamente utilizada que utiliza tanto un anticuerpo primario no marcado como un anticuerpo secundario marcado con fluoróforos que reconoce el anticuerpo primario para detectar un objetivo de interés19. Los métodos de FI pueden proporcionar un medio poderoso para visualizar componentes y estructuras intracelulares específicas. También es posible que más de una molécula de anticuerpo secundario pueda interactuar con el anticuerpo primario, lo que resulta en la amplificación de la señal19. La FI indirecta es una técnica versátil que también permite la detección de múltiples anticuerpos primarios con un conjunto relativamente pequeño de anticuerpos secundarios, ya que los anticuerpos secundarios se elevan contra el dominio Fc del anticuerpo primario, que se conserva dentro de la especie19.
En este artículo se describe un método indirecto (IF) para evaluar la formación de burbujas nucleares y la fuga de ADN en células deficientes en ZMPSTE24, utilizando anticuerpos contra el ADN bicatenario (dsDNA) y la lamina B1 para detectar el ADN y la lámina nuclear, respectivamente. Para demostrar la utilidad de este enfoque, el procedimiento se aplicó a una línea celular HeLa con expresión de ZMPSTE24 knock-out, así como a una línea celular HeLa que expresa ZMPSTE24, y se compararon los resultados de las dos líneas celulares.
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Protocolo
Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Preparación de materiales
- Esteriliza en autoclave al menos diez cubreobjetos y pinzas de vidrio cuadrados de 22 mm x 22 mm antes de enchapar las celdas en los cubreobjetos.
2. Preparación de las soluciones
- Medios complementarios: Prepare 500 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) con 10% de suero fetal bovino (FBS), 100 unidades/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina.
- Tampón de dilución de anticuerpos (ADB): Disuelva 2 g de albúmina sérica bovina (BSA) y 1 g de gelatina de pescado en 80 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x. Lleve a 100 ml con PBS una vez que se hayan disuelto el BSA y la gelatina de pescado.
- 1x PBS-Tween (PBS-T): Prepare 500 mL de PBS y 0.5 mL de Tween. Coloque en un baño de agua a 37 °C hasta que Tween pueda mezclarse fácilmente con la solución.
3. Crecimiento de las células deseadas
NOTA: Las células HeLa se cultivaron en este protocolo hasta la confluencia dentro de un matraz T75.
- Rocíe seis cubreobjetos con etanol al 70% y déjelos secar al aire en una toallita sin pelusa. Coloque los cubreobjetos en una placa estéril de 6 pocillos con pinzas, un cubreobjetos por pocillo.
- Agregue 2 mL de DMEM suplementado a cada pocillo en la placa de 6 pocillos.
- Aspire los medios de las células y lave las células añadiendo 15 ml de PBS al matraz, girando suavemente. Aspirar el PBS y añadir 2 mL de tripsina-EDTA (tripsina).
- Cubra las celdas con tripsina y vuelva a colocar el matraz en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2 durante 2 minutos para permitir que las células se desprendan del matraz.
- Añada 8 mL de DMEM suplementado al matraz para recoger las células tripsinizadas. Pipetea hacia arriba y hacia abajo varias veces para separar las células aglomerantes. Recoja la suspensión celular en el matraz y colóquela en un tubo de poliestireno de 15 mL.
- Cuente las células con un hemocitómetro.
- Agregue 500,000 celdas, gota a gota, directamente en cada uno de los cubreobjetos en la placa de 6 pocillos. Deje que las células crezcan durante la noche a 37 °C y 5% de CO2 en una incubadora humidificada.
4. Fijación y permeabilización celular
- Prepare la solución de formaldehído al 4% fresca antes de usarla: Agregue 2 mL de solución de formaldehído al 37.5% en 18 mL de PBS. Homogeneizar.
- Prepare la solución de permeabilización fresca antes de usarla: Agregue 100 μL de Triton-X en 20 mL de PBS. Dejar incubar en un baño de agua a 37 °C durante unos minutos hasta que el Triton-X se disuelva en la solución. Homogeneizar.
- Aspire el medio en los pocillos de la placa. Lave las celdas una vez con 2 mL de PBS. Aspire todos los PBS de los pozos.
- Agregue 2 mL de solución de formaldehído al 4% a cada pocillo. Deje reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT). Aspire el 4% de formaldehído completamente de los pocillos.
- Lave las celdas 3 veces con 2 mL de PBS. Retire el PBS por completo de los pocillos después de cada lavado.
- Agregue 2 mL de solución de permeabilización a cada pocillo. Deje reposar durante 10 minutos en RT. Aspire completamente la solución de permeabilización.
- Lave las celdas 3 veces con 2 mL de PBS. Aspire el PBS completamente después de los dos primeros lavados, dejando el PBS en los pocillos después del tercer lavado.
NOTA: Las celdas se pueden almacenar en el último lavado de PBS a 4 °C durante unas semanas después de este paso, asegurándose de que la placa esté sellada con una película de parafina para evitar la evaporación del líquido. Si el procedimiento se puede continuar, se puede omitir este paso.
5. Tinción de inmunofluorescencia
- Retire todos los PBS de los pozos. Bloquee las células añadiendo 2 mL de ADB a cada pocillo e incube en RT, meciendo durante 30 min.
- Hacia el final del tiempo de bloqueo de 30 minutos, mezcle la dilución del anticuerpo primario en ADB (dilución 1:1.000 para los anticuerpos Lamin B1 y dsDNA, Tabla 1). Se necesitan 75 μL para cada cubreobjetos, por lo tanto, se deben mezclar 600 μL de ADB, 0,6 μL de anticuerpo primario de Lamin B y 0,6 μL de anticuerpo dsDNA para seis cubreobjetos. Vórtice a fondo.
- Retire el ADB de los pozos. En una superficie plana, pegue con cinta adhesiva un pedazo de película de parafina que sea lo suficientemente grande en área como para colocar todos los cubreobjetos que se están procesando.
- Para cada cubreobjetos, agregue 75 μL de dilución de anticuerpos primarios en la película de parafina, asegurándose de que no se pipeteen burbujas en el ADB. A continuación, coloque los cubreobjetos con la célula hacia abajo sobre la gota de ADB con unas pinzas.
- Cubra los cubreobjetos de incubación con la tapa de la placa de pocillos y deje incubar durante 1 h a RT.
- Retire los cubreobjetos de la película de parafina con pinzas y vuelva a colocarlos en la placa de 6 pocillos, con el lado de la celda hacia arriba.
- Lave los cubreobjetos 3 veces con 2 mL de PBS-T, meciendo durante 3-5 minutos cada vez. Retire todo el PBS-T de los pocillos después de cada lavado.
- Durante el último lavado, prepare la dilución del anticuerpo secundario (1:1.000 para ambos anticuerpos secundarios respectivos, Tabla 1). Se necesitan 75 μL para cada cubreobjetos, por lo tanto, se deben mezclar 600 μL de ADB y 0,6 μL de ambos anticuerpos secundarios marcados con Alexa Fluor para seis cubreobjetos. Vórtice a fondo. Cubra la dilución del anticuerpo secundario de la luz tanto como sea posible.
| Anticuerpo | Fuente | Compañía | Referencia | ||
| Anticuerpo marcador de dsDNA (HYB331-01) | Monoclonal de ratón | Santa Cruz | SC-58749 | ||
| Anticuerpo secundario anti-ratón IgG (H+L) de cabra con alta adsorción cruzada, Alexa Fluor Plus 488 | Cabra | ThermoFisher | A32723 | ||
| Anticuerpo secundario anti-ratón de cabra IgG (H+L) altamente adsorbido por cruz, Alexa Fluor Plus 405 | Cabra | Invitrogen | A31553 | ||
| Anticuerpo policlonal lamina B1 | Conejo | Tecnología de proteínas | 12987-1-AP | ||
| Anticuerpo secundario anti-conejo IgG (H+L) altamente adsorbido por cabras, Alexa Fluor 594 | Cabra | Invitrogen | A11037 | ||
Tabla 1: Anticuerpos. Lista de todos los anticuerpos utilizados en este protocolo.
- Retire todos los PBS-T del último lavado. Incubar los cubreobjetos en la dilución secundaria de anticuerpos en una película de parafina, como en el paso 5, durante 30 min en RT. Proteger de la luz para este paso y todos los pasos restantes. Se puede utilizar una pequeña caja para proteger la luz. Asegúrese de trabajar rápidamente cuando sea necesario para agregar o eliminar soluciones de los pozos.
- Retire los cubreobjetos de la película de parafina con pinzas y vuelva a colocarlos en la placa de 6 pocillos, con la celda hacia arriba.
- Lave los cubreobjetos 3 veces con 2 mL de PBS-T. Retire todo el PBS-T de los pocillos después de cada lavado.
- Deshidratar los portaobjetos con una serie de etanol (70%, 90%, 100%). Comience agregando 2 mL de etanol al 70% a cada pocillo. Deje reposar durante 1-2 minutos y retire todo el etanol de los pocillos. Repita con los porcentajes de etanol restantes.
- Retire los cubreobjetos de los pocillos con pinzas y déjelos secar al aire, protegidos de la luz, en una toallita sin pelusa.
- Monte el cubreobjetos con el lado de la célula hacia abajo en portaobjetos de microscopio de vidrio utilizando 20 μL de medio de montaje por cubreobjetos. Dejar secar toda la noche, protegido de la luz.
6. Adquisición de imágenes
- Antes de tomar imágenes, cubra los bordes de los cubreobjetos con una capa delgada de esmalte de uñas transparente (cualquier marca o tipo será suficiente). Dejar secar al aire, protegido de la luz.
NOTA: Las instrucciones para usar un microscopio para obtener imágenes variarán según el microscopio utilizado. La resolución de la cámara en el microscopio utilizado aquí es de 1280 x 960 píxeles. Una resolución similar o mejor será suficiente. - Antes de colocar un portaobjetos en la platina del microscopio, se debe ajustar la configuración de guardado de archivos. Encienda el microscopio e inserte una unidad USB. Ajuste la configuración de guardado dentro de la configuración del microscopio y asegúrese de que todos los canales (GFP y RFP) se guarden por separado y que las imágenes vayan a la ubicación correcta en la unidad USB.
NOTA: Cree una carpeta en la unidad USB y asigne a cada cubreobjetos su propio nombre para futuras referencias. - Antes de tomar imágenes, rocíe una toallita sin pelusa con etanol al 70% y limpie suavemente la parte posterior de los portaobjetos. Limpie suavemente la parte delantera de las correderas, asegurándose de ejercer una presión mínima.
- Coloque un portaobjetos limpio en el microscopio, con los cubreobjetos hacia abajo. Cubra con la caja de protección de luz.
- Usando una lente de objetivo de 40x, use el canal apropiado (RFP para el anticuerpo de lamina B1 empleado aquí) para ubicar los núcleos en la pantalla del microscopio. Ajuste la intensidad de la luz a alrededor del 50% para comenzar.
- Para comprobar si hay áreas sobresaturadas, seleccione la opción Color desactivado y asegúrese de que ninguna zona del cubreobjetos tenga una señal roja en la configuración de blanco y negro. Si hay mucha señal roja, baje la intensidad de la luz hasta que se muestre la señal roja mínima.
NOTA: Una señal roja indica sobresaturación. Si los núcleos parecen apenas visibles, aumente la intensidad en incrementos del 10% hasta lograr una intensidad adecuada sin sobresaturación. - Revise todos los demás cubreobjetos con la misma intensidad para asegurarse de que no estén sobresaturados. Compruebe todos los cubreobjetos con el otro canal utilizando el mismo proceso que el anterior (GFP para el anticuerpo dsDNA utilizado aquí).
- Registre las intensidades de luz para cada canal. Asegúrese de que todas las intensidades de luz de cada canal se mantengan constantes durante todo el proceso de obtención de imágenes.
- Visualice cada cubreobjetos individualmente. Comience con el primer canal, enfoque los núcleos y capture la imagen.
- Cambie de canal con cuidado y vuelva a enfocar las celdas. Cuando esté enfocado, capture la imagen.
- Después de capturar imágenes en los canales necesarios (GFP y RFP), seleccione Superposición para observar la imagen combinada y asegurarse de que la diapositiva no se movió al tomar la imagen. Si los canales no se superponen, repita el canal necesario hasta que las imágenes se alineen.
- Guarde la imagen haciendo clic en el icono de la unidad flash . Muévase a un lugar diferente en el cubreobjetos para continuar con la toma de imágenes.
NOTA: Asegúrese de que se muestre una imagen de un área diferente del cubreobjetos cada vez para evitar capturar la misma región repetidamente. Se recomienda comenzar la toma de imágenes en la esquina superior izquierda del cubreobjetos y moverlo en forma de "S" para garantizar una cobertura completa sin duplicación.
7. Análisis de datos
- Los datos obtenidos con este método son visuales. Examine las imágenes en busca de signos de fuga de ADN o ampollas nucleares. En la sección de resultados representativos se muestran ejemplos de ampollas y fugas.
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Resultados
Este estudio presenta un método de FI para visualizar la lámina nuclear en conjunción con el ADN bicatenario (dsDNA). Una vez que se realiza la FI, las imágenes capturadas se pueden examinar en busca de signos de ampollas nucleares y fugas de ADN.
Figura 2: Ampolla nuclear en células HeLa CT y <...
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Discusión
El protocolo presentado contiene varios pasos críticos, siendo el más importante el tratamiento de las células fijadas con anticuerpos primarios y secundarios. Asegurar el uso de un anticuerpo primario de buena calidad contra el objetivo de interés con un anticuerpo secundario correspondiente correcto con fluoróforos dentro del rango del microscopio utilizado producirá resultados óptimos19. La calidad del anticuerpo puede tener un gran impacto en los resultados de...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la subvención del Instituto Nacional sobre el Envejecimiento R03AG064525 a ASW. Nos gustaría agradecer al Dr. Jason A. Stewart por su ayuda en la tutoría técnica y al laboratorio Hui Chen por proporcionar el microscopio utilizado. También nos gustaría agradecer a Fabio Martinon por las líneas celulares HeLa utilizadas en estos experimentos.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cubreobjetos de vidrio cuadrados de 22 mm | Propper Manufacturing Company | M8710 | Se puede usar cualquier tamaño o forma, siempre que se puedan fijar a un portaobjetos de microscopio estándar. |
| 36.5% Formaldehído | Sigma Aldrich | F8775 | Reactivo de fijación. |
| 75 cm 2 Matraces | Corning | 430725U | Para cultivo celular. |
| Suero bovino Albinum (BSA) | Fisher Scientific | 9048-46-8 | Tampón de dilución de anticuerpos. |
| DMEM con 1 g/L de glucosa, L-glutamina y piruvato de sodio | Corning | 10-014-CV | Para cultivo celular. |
| Etanol (200 Proof) | Decon Laboratories | 2701 | Para la deshidratación de muestras antes del montaje, diluidas para hacer múltiples concentraciones. |
| Microscopio digital de fluorescencia invertida EVOS FL | Fisher Scientific | 12-563-460 | Imaging. |
| Gelatina de pescado | Sigma Aldrich | G7041 | Tampón de dilución de anticuerpos. |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Medio de montaje para evitar el fotoblanqueo. |
| Parafilm (4 pulgadas) | Fisher Scientific | 13-374-12 | Se puede sustituir cualquier tamaño, siempre y cuando quepan los cubreobjetos que se utilizan. |
| Penicilina-estreptomicina | Gibco | 15-140-122 | Para cultivo celular. |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | N/A | N/A | Fabricada y esterilizada en el laboratorio para cultivo de tejidos y soluciones. |
| Suero fetal bovino de primera calidad (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | Para cultivo celular. |
| Portaobjetos de microscopio Superfrost Premium | Fisher Scientific | 12-544-7 | Se puede utilizar cualquier portaobjetos de microscopio estándar. |
| Placas de fondo plano de 6 pocillos tratadas con cultivo de tejidos | Falcon | 353046 | para cultivo celular. |
| TritonX-100 | Thermofisher Scientific | A16046. AP | Para lavar. |
| Tripsina-EDTA (0,5%) | Gibco | 15-400-054 | Para cultivo celular. |
| Tween 20 | Fisher Scientific | 9005-64-5 | Reactivo de permeación celular. |
Referencias
- Navarro, C. L., et al. New ZMPSTE24 (FACE1) mutations in patients affected with restrictive dermopathy or related progeroid syndromes and mutation update. Eur J Hum Genet. 22 (8), 1002-1011 (2014).
- Dittmer, T. A., Misteli, T. The lamin protein family. Genome Biol. 12 (222), 1-16 (2011).
- Gruenbaum, Y., Margalit, A., Goldman, R. D., Shumaker, D. K., Wilson, K. L. The nuclear lamina comes of age. Nat Rev Mol Cell Biol. 6, 21-31 (2005).
- Navarro, C. L., et al. Lamin A and ZMPSTE24 (FACE-1) defects cause nuclear disorganization and identify restrictive dermopathy as a lethal neonatal laminopathy. Hum Mol Genet. 13 (20), 2493-2503 (2004).
- Barrowman, J., Wiley, P. A., Hudon-Miller, S. E., Hrycyna, C. A., Michaelis, S. Human ZMPSTE24 disease mutations: Residual proteolytic activity correlates with disease severity. Hum Mol Genet. 21 (18), 4084-4093 (2012).
- Richards, S., Muter, J., Ritchie, P., Lattanzi, G., Hutchison, C. The accumulation of un-repairable DNA damage in laminopathy progeria fibroblasts is caused by ROS generation and is prevented by treatment with N-acetyl cysteine. Hum Mol Genet. 20 (20), 3997-4004 (2011).
- Davies, B. S., Fong, L. G., Yang, S. H., Coffinier, C., Young, S. G. The post-translational processing of prelamin A and disease. Annu Rev Genomics Hum Genet. 10, 153-174 (2009).
- Barrowman, J., Hamblet, C., George, C. M., Michaelis, S. Analysis of prelamin A biogenesis reveals the nucleus to be a CaaX processing compartment. Mol Biol Cell. 19, 5398-5408 (2008).
- Young, S., Meta, M., Yang, S. H., Fong, L. G. Prelamin A farnesylation and progeroid syndromes. J Biol Chem. 281 (52), 39741-39745 (2006).
- Houthaeve, G., Robijns, J., Braeckmans, K., De Vos, W. H. Bypassing border control: Nuclear envelope rupture in disease. Physiol. 33 (1), 39-49 (2017).
- Schreiber, K. H., Kennedy, B. K. When lamins go bad: Nuclear structure and disease. Cell. 152 (6), 1365-1375 (2013).
- Fong, L. G., et al. Heterozygosity for Lmna deficiency eliminates the progeria-like phenotypes in Zmpste24-deficient mice. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (52), 18111-18116 (2004).
- Pendas, A. M., et al. Defective prelamin A processing and muscular and adipocyte alterations in Zmpste24 metalloproteinase-deficient mice. Nat Genet. 31, 94-99 (2002).
- Goldman, R. D., et al. Accumulation of mutant lamin A causes progressive changes in nuclear architecture in Hutchinson-Gilford progeria syndrome. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 8963-8968 (2004).
- Eriksson, M., et al. Recurrent de novo point mutations in lamin A cause Hutchinson–Gilford progeria syndrome. Nature. 423, 293-298 (2003).
- Young, S. G., Fong, L. G., Michaelis, S. Thematic review series: Lipid post-translational modifications. Prelamin A, Zmpste24, misshapen cell nuclei, and progeria—new evidence suggesting that protein farnesylation could be important for disease pathogenesis. J Lipid Res. 46 (12), 2531-2558 (2005).
- Worman, H. J., Michaelis, S. Prelamin A and ZMPSTE24 in premature and physiological aging. Nucleus. 14 (1), 1-17 (2023).
- Pande, S., Ghosh, D. K. Nuclear proteostasis imbalance in laminopathy-associated premature aging diseases. FASEB J. 37 (8), 1025-1035 (2023).
- Odell, I. D., Cook, D. Immunofluorescence techniques. J Invest Dermatol. 133 (4), 1-12 (2013).
- Kumar, V. Immunofluorescence and enzyme immunomicroscopy methods. J Immunoassay Immunochem. 21 (2-3), 235-253 (2000).
- Tjaden, A., Giessmann, R. T., Knapp, S., Schroder, M., Muller, S. High-content live-cell multiplex screen for chemogenomic compound annotation based on nuclear morphology. STAR Protoc. 3 (101791), 1-15 (2022).
- Gunn, A. L., Yashchenko, A. I., Dubrulle, J., Johnson, J., Hatch, E. M. A high-content screen reveals new regulators of nuclear membrane stability. Sci Rep. 14, 6013(2024).
- Yu, L., Liu, P. Cytosolic DNA sensing by cGAS: Regulation, function, and human diseases. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (170), 1-14 (2021).
- Odinammadu, K. O., et al. The farnesyl transferase inhibitor (FTI) lonafarnib improves nuclear morphology in ZMPSTE24-deficient fibroblasts from patients with the progeroid disorder MAD-B. Nucleus. 14 (1), 1-14 (2023).
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