Artículo de método

Metodología mejorada para el estudio de la osteogénesis postnatal mediante osificación intramembranosa en un modelo de lesión de médula ósea murina

DOI:

10.3791/67727

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7 de febrero de 2025

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1Department of Orthopedic Surgery, UConn School of Medicine, 2Department of Neuroscience, UConn School of Medicine

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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El modelo de lesión de la médula ósea murina es una herramienta útil para estudiar la osteogénesis postnatal a través de la osificación intramembranosa. Este protocolo quirúrgico simplificado describe el procedimiento de ablación de la médula ósea para la evaluación posterior de la formación de hueso nuevo y las respuestas celulares después de una lesión.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las lesiones de huesos largos se curan a través de vías de formación de hueso endocondral o intramembranoso. A diferencia de la vía endocondral que requiere una plantilla de cartílago, el proceso de osificación intramembranosa implica la conversión directa de células madre y progenitoras esqueléticas (SSPC) en osteoblastos formadores de hueso. Existen métodos quirúrgicos limitados para modelar este proceso en ratones experimentales. Aquí, hemos mejorado un modelo de lesión de la médula ósea en ratones para facilitar el estudio de la reparación ósea a través de la osificación intramembranosa y para evaluar los reguladores postnatales de la osteogénesis. Este método es altamente reproducible y fácil de usar, y permite la evaluación temporal de la formación de hueso nuevo en un corto período (3-7 días después de la lesión) mediante tomografía microcomputarizada (μCT) e histología de corte congelado. Además, las contribuciones de los SSPC y los osteoblastos maduros pueden evaluarse fácilmente utilizando una combinación de ratones reporteros fluorescentes y este modelo de lesión intramembranosa de la médula ósea. En contextos clínicos, la formación de hueso intramembranoso es relevante para la curación de defectos de tamaño crítico, fracturas estabilizadas, defectos corticales, traumatismos por resecciones tumorales y reemplazos articulares.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las lesiones de huesos largos se curan a través de la vía de formación de hueso endocondral o intramembranoso. A diferencia de la vía endocondral, que requiere un paso precursor del cartílago, la reparación ósea mediante osificación intramembranosa implica la conversión directa de células madre y progenitoras esqueléticas (SSPCS) en osteoblastos formadores de hueso1. Clínicamente, este proceso es relevante para la cicatrización ósea en una variedad de contextos, incluyendo defectos críticos de tamaño, fracturas estabilizadas, defectos corticales, osteogénesis por distracción, trauma por resecciones tumorales y osteointegración de implantes de reemplazo articular 2,3. Curiosamente, en estudios de pacientes con fracturas de huesos largos, el 66%-82% presentaba fracturas desplazadas, lo que requirió dispositivos de fijación para estabilizar el hueso 4,5. Estos huesos rígidamente estabilizados sanan principalmente a través de la osificación intramembranosa, ya que los extremos del hueso roto entran en contacto directo entre sí 6,7. Sin embargo, la regulación mecanicista de la regeneración ósea intramembranosa sigue siendo relativamente poco estudiada en comparación con la formación ósea a través de las vías endocondrales. Las terapias aprobadas por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA, por sus siglas en inglés) para aumentar la cicatrización ósea se ven obstaculizadas por la eficacia clínica limitada y los altos costos, y se asocian con efectos adversos significativos8.

La ablación mecánica de la médula ósea proporciona un modelo valioso para estudiar la formación de hueso intramembranoso. Este modelo de lesión simple permite estudiar la regeneración ósea en la médula ósea sin alterar el hueso cortical. Después de la ablación de la orina vaginal, el proceso de curación implica fases distintas pero superpuestas. La fase inicial ocurre en los primeros 1 a 5 días e implica la formación de coágulos e inflamación, donde las células inflamatorias y las citocinas inician la curación. De los días 3 a 14, la segunda fase se caracteriza por la regeneración, que incluye neovascularización, migración y proliferación de células madre mesenquimales (MSC), diferenciación osteoblástica y formación de hueso tejido. La fase final de remodelación comienza aproximadamente 10 días después de la cirugía, con el tejido óseo en maduración y reestructuración hasta que la médula se restaura completamente en el día 569. Este rápido cronograma de curación hace que el modelo de ablación de BM sea ideal para estudiar las respuestas tempranas de reparación ósea, particularmente durante los períodos críticos de inflamación, reclutamiento de células progenitoras y diferenciación osteoblástica. Utilizando técnicas como la histología, la citometría de flujo y el análisis cuantitativo de μCT, se pueden evaluar las respuestas celulares y la formación ósea en etapas tempranas de reparación. Utilizando las técnicas antes mencionadas, el modelo de ablación BM puede proporcionar información sobre los mecanismos de la regeneración ósea intramembranosa y ayudar a identificar objetivos terapéuticos clave para mejorar la cicatrización ósea.

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Protocolo

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Los siguientes procedimientos se realizaron con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Centro de Salud de la Universidad de Connecticut. Todas las cirugías se realizaron en condiciones estériles según lo descrito por las pautas de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). El dolor y el riesgo de infecciones se trataron con analgésicos y antisépticos adecuados para garantizar un resultado exitoso.

1. Preparación del área quirúrgica y del instrumental

  1. Prepare la sala de procedimientos quirúrgicos desinfectando las superficies de trabajo con un limpiador desinfectante de grado clínico.
    NOTA: El cirujano debe usar equipo de protección personal (EPP) adecuado, incluidos guantes desechables estériles, gorro para el cabello, bata y mascarilla.
  2. Prepare una almohadilla térmica cubierta con una almohadilla quirúrgica estéril. Reúna y organice todos los instrumentos y reactivos estériles (Tabla de materiales) con un acceso conveniente.

2. Anestesia preoperatoria

  1. Pesar a todos los ratones antes de la cirugía. Calcular los volúmenes de analgésico a utilizar en función de la formulación disponible de buprenorfina.
  2. Ensamble una unidad de anestesia animal dentro del espacio de trabajo estéril, que incluye una cámara de inducción y un conjunto de nariz y cono. Ajuste la salida de oxígeno a 2 L min-1 y el isoflurano a 1,5-3% (v/v) dependiendo de la edad y el peso del ratón.
  3. Una vez que el ratón esté sedado, retire al animal de la cámara de inducción y colóquelo sobre una almohadilla quirúrgica estéril en posición supina. Aplique lubricante oftálmico en ambos ojos. Coloca el cono de la nariz sobre la cabeza. Compruebe que el ratón está adecuadamente anestesiado pellizcando suavemente el dedo del pie. Asegúrese de que no haya una respuesta refleja de las extremidades posteriores antes de continuar.
  4. Antes de la cirugía, retire brevemente el ratón del cono de la nariz para inyectar la dosis total de buprenorfina de liberación prolongada por vía subcutánea; La dosis total es de 3,25 mg/kg.

3. Descripción del procedimiento quirúrgico

NOTA: Este procedimiento quirúrgico utiliza ratones machos y hembras C57BL/6 de 10 a 24 semanas de edad. El procedimiento se puede realizar en ratones desde las 6 semanas hasta las 33 semanas de edad y en varias cepas endogámicas, como lo demuestran otros10,11. Los ratones más jóvenes pueden requerir longitudes de aguja más cortas, mientras que los ratones mayores o más grandes pueden requerir una aguja más larga.

  1. Llene una jeringa de 3 ml equipada con una aguja de 26 g con solución salina estéril. Colócalo a un lado.
  2. Retire el pelaje de la extremidad posterior en la que se realizará el procedimiento con tijeras eléctricas o que funcionen con baterías (cuchilla # 40) y retire cualquier pelaje suelto del campo quirúrgico. Usando aplicadores estériles con punta de algodón, trate el sitio quirúrgico con un exfoliante a base de yodo (10% de povidona yodada), seguido de alcohol isopropílico al 70%. Frote el sitio quirúrgico comenzando en el centro de la rodilla y haciendo un barrido circular hacia afuera. Deje que el sitio se seque. Repite los pasos de fregado 3 veces.
  3. Coloque el ratón boca arriba y flexione la rodilla de la pierna operativa. Sostenga la pierna del ratón con la mano no dominante de modo que la rodilla esté doblada sobre el dedo medio, el segundo dedo descanse sobre el fémur y el pulgar descanse sobre la tibia.
  4. Haz una incisión horizontal pequeña y poco profunda justo debajo de la rótula con un bisturí.
    NOTA: Este paso mejora la visualización del sitio de inserción. Con la experiencia, este paso se puede omitir.
  5. Localice el espacio articular colocando la aguja horizontalmente a través de la rodilla doblada y palpando el espacio entre el fémur y la tibia. Usando este sitio anatómico como guía, tome una aguja de 25 G y perfore manualmente (girando la aguja y aplicando simultáneamente una presión moderada sobre la aguja) en el fémur distal desde la rodilla hacia el lado proximal. Inserte la aguja a través o alrededor de la rótula.
  6. Radiografiar el ratón para asegurarse de que la aguja se ha colocado correctamente en la cavidad medular, lo más cerca posible del centro (Figura 1).
  7. Retire la aguja de 25 G e inserte inmediatamente una aguja de 26 G en el mismo orificio dentro de la cavidad de la médula. Escariar los lados de la cavidad medular con movimientos circulares al menos 5 veces hasta que se sienta suave. Mantenga el número de movimientos de escariado constante entre cada ratón.
    NOTA: Los pasos 3.5 y 3.7 pueden causar lesiones por pinchazo de aguja al cirujano si no se manejan con cuidado.
  8. Retire la aguja de 26 G y vuelva a colocar la aguja de 26 G conectada a la jeringa de solución salina. Enjuague la cavidad hasta que el reflujo salga limpio. Por lo general, esto requiere de 1,5 a 2 ml de solución salina. Retire la jeringa y la aguja y deséchelas de manera segura en un recipiente afilado.
    NOTA: No debe haber resistencia al empujar el fluido. Si es así, vuelva a insertar la aguja para asegurarse de que esté dentro de la cavidad. Puede ser necesario sacar la aguja hasta la mitad.
  9. Cierre la herida cutánea con una sutura adhesiva tópica.

4. Cuidados postoperatorios

  1. Inmediatamente después de la cirugía, administre la media dosis restante de buprenorfina de liberación prolongada utilizando la dosis del paso 2.4.
    NOTA: La buprenorfina de liberación prolongada proporciona alivio del dolor hasta por 72 horas.
  2. Vigile a los animales en la almohadilla térmica para detectar signos de respiración normal y sin obstrucciones hasta que se despierten de la cirugía. Una vez ambulatorios, regrese a los ratones a su jaula.
  3. Continúe monitoreando a los ratones una vez al día durante 3 días después de la cirugía para asegurarse de que se estén curando adecuadamente y tengan movilidad completa, observando los signos de dolor.

5. Procesamiento de huesos para escaneo y análisis de μCT

  1. Eutanasiar a los ratones de acuerdo con el método de eutanasia humanitaria regulado y aprobado por la IACUC u otra política institucional aplicable. En este caso, se utilizó el método primario de eutanasia de inhalación de CO2 , seguido de un método secundario de luxación cervical.
  2. Extraiga los fémures pelando la piel alrededor de las extremidades traseras y quitando toda la extremidad en la articulación de la cadera.
  3. Coloque cada extremidad entre dos esponjas en un casete de inclusión. Transfiera los huesos de sus casetes a una solución de formalina al 10% y fíjelos a 4 °C durante 5-7 días, teniendo en cuenta la edad y el tamaño del ratón.
    NOTA: Tanto la sobrefijación como la subfijación dan como resultado una mala resolución de la médula.
  4. Después de la fijación, lavar los casetes en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 5 min 3 veces.
  5. Retire las extremidades de los casetes y recorte el músculo con un bisturí según sea necesario.
    NOTA: Dependiendo de las aplicaciones posteriores, el manejo brusco puede alterar la capa perióstica del hueso.
  6. Separe el fémur a la altura de la rodilla cortando cuidadosamente los ligamentos con unas tijeras quirúrgicas pequeñas o un bisturí.
    NOTA: Las tibias se pueden utilizar para otras aplicaciones o desecharlas.
  7. Transfiera los fémures a tubos cónicos de 1,7 mL o 15 mL a una solución de etanol al 70%. Los huesos pueden permanecer en etanol al 70% a 4 °C hasta que estén listos para la exploración por μCT.
  8. Escanee y evalúe los fémures en busca de parámetros trabeculares, produciendo datos cualitativos y cuantitativos.

6. Procesamiento de huesos para corte congelado e histología

NOTA: Los huesos se pueden procesar para la sección congelada y la histología después de someterse a una exploración por μCT. La exploración no afecta al marcaje fluorescente ni a la posterior tinción de anticuerpos.

  1. Transfiera los huesos de etanol al 70% a PBS y lave 3 veces, 5 min por lavado.
  2. Incubar en una serie de soluciones de sacarosa de 10%, 20% a 30% en PBS a 4 °C durante la noche en cada concentración. Almacene los huesos en sacarosa al 30% durante un máximo de 5 días a 4 °C o en esta solución a -20 °C durante 6-12 meses hasta que estén listos para la inclusión.
    NOTA: El uso de un gradiente de sacarosa da como resultado una mejor penetración en el tejido. Después del paso 6.1, los huesos se pueden colocar directamente en una solución de sacarosa al 30% durante la noche.
  3. Incruste huesos en un compuesto de temperatura óptima de corte (OCT) utilizando moldes de crioincrustación. Almacenar a -80 °C hasta que esté listo para seccionar.
  4. Corte los huesos incrustados utilizando el método de cinta de criopelícula con una temperatura de criostato establecida entre -24 °C y -26 °C.
  5. Adherir las secciones de la película criogénica a un portaobjetos adhesivo con adhesivo óptico y curarla hasta que se endurezca con un reticulante ultravioleta (UV).

7. Procesamiento para citometría de flujo

NOTA: Este protocolo es compatible con una variedad de anticuerpos. Para caracterizar las células madre y progenitoras del esqueleto, se recomienda agrupar 3-4 huesos juntos, ya que se trata de poblaciones celulares raras en la médula ósea.

  1. Prepare medios de tinción (FSM) de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Para hacer 1000 mL de solución de FSM, combine: 100 mL de solución salina balanceada de Hanks (HBSS), 10 mL de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanosulfónico (HEPES), 20 mL de suero fetal bovino (FBS), 870 mL de dd H2O. Pase la solución FSM a través de un filtro de 0,2 μm.
  2. Antes de recolectar tejido, llene las placas de Petri con 4-5 mL de PBS estéril sin calcio ni magnesio.
  3. Preparar los medios de digestión
    1. Por cada 4-6 fémures, prepare una mezcla de digestión en 10 mL de PBS que contenga 0,005 g de colagenasa P y 0,02 g de hialuronidasa. Mezclar mediante un suave vórtice y pasar la mezcla a través de un filtro de 0,22 μm.
  4. Extraiga los huesos el día 3 después de la cirugía, como se describe en el paso 5.2. Retire todo el músculo y el tejido conectivo con una hoja de bisturí.
  5. Llene una placa de Petri con 5 mL de medios de digestión. Coloque 4-6 huesos en el medio de digestión. Pica cada hueso finamente, haciendo el primer corte longitudinal y lateralmente.
  6. Transfiera el tejido a un tubo de fondo redondo de 14 mL y selle con parafilm. Cubra los tubos con papel de aluminio.
  7. Agitar a 37 °C durante 20 min manteniendo el tubo horizontalmente sobre el agitador.
  8. Retire el tubo de la agitadora. Las celdas se agruparán en la parte inferior. Recoja suavemente el material digerido sin alterar las células en la parte inferior y pase el digestión a través de un filtro de 70 μm. Recoja el filtrado en un nuevo tubo de 50 mL que contenga 10 mL de FSM frío y manténgalo en hielo.
  9. A las células, agregue los 5 ml restantes de la mezcla de digestión. Selle nuevamente con parafilm y cubra con papel de aluminio. Agite el tubo como se describe anteriormente. Repita los pasos 7.7-7.8.
  10. Después de la incubación de 20 min a 37 °C, transfiera el digesto al mismo tubo que contiene el digesto del paso 7.8, pasando a través de un filtro de 70 μm con otros 10 mL de FSM.
  11. Centrifugar la suspensión a 274 x g a 4 °C. Aspire el sobrenadante y recoja la célula de celda. Desaloje el pellet golpeando suavemente el tubo.
    NOTA: La fuerza centrífuga (g) se basa en un radio de rotor de 170 mm. Compruebe el radio del rotor y ajuste la velocidad en consecuencia.
  12. Para realizar la lisis de glóbulos rojos, agregue 1 mL de tampón de lisado de cloruro de amonio y potasio (ACK). Mantenga todos los reactivos y células en hielo.
  13. Incubar las células en ACK durante unos 5 minutos en RT. No exceda los 5 min para evitar lisar demasiado las células.
  14. Añadir 9 mL de FSM. Centrifugar a 274 x g durante 5 min a 4 °C.
  15. Aspirar el sobrenadante. Rompa el pellet de la celda rastrillando suavemente el tubo en una rejilla de tubos.
  16. Agregue 10 ml de FSM (volumen para 4 huesos, se puede ajustar en función de la cantidad de huesos combinados) y vuelva a suspender.
  17. Tome una alícuota de cada muestra y agregue yoduro de propidio (PI) según las instrucciones del fabricante. Cuente las células vivas y totales con un contador de celdas.
  18. Proceda con la tinción de anticuerpos de las muestras utilizando los marcadores deseados para el análisis de citometría de flujo 12,13,14.

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Resultados

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El éxito del procedimiento de ablación mecánica de médula ósea (MO) se validó mediante imágenes radiográficas, mientras que la aguja de 26G se insertó en la cavidad medular (Figura 2A). Cuando las imágenes de rayos X indicaron que la aguja se insertó en un ángulo incorrecto o penetró a través del hueso, la aguja se volvió a insertar en el ángulo adecuado y se volvió a obtener una imagen para confirmar la ubicación precisa. Cuando no se pudo alcanzar una posición exitosa, el animal fue exclui...

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Discusión

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El objetivo era establecer un método fiable y reproducible para estudiar los procesos moleculares y celulares que gobiernan la reparación ósea, centrándose en la conversión directa de células madre y progenitoras esqueléticas (SSPC) en osteoblastos depositantes de hueso en el espacio/cavidad de la médula ósea. El método de ablación mecánica de la médula ósea descrito aquí es un protocolo optimizado y validado para la ablación de la médula ósea por lesión mecánica, que permite la investig...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen divulgaciones que informar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La financiación fue proporcionada por NIH/NIDCR R01-DE030716-01 y NIH/NIAMS R01-DE030716-01S1 a AS, NIH/NIAMS R01AR080131 a RG, y UConn REP Convergence Grant a RG y AS.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Solución de formalina al 10% Sigma-AldrichHT501128
25 G 0.625 in Air-tite EZ Flo Aguja HipodérmicaAit Tite/ Fisher Scientific14-817-239; ref #NEZ25058
26 G 1/2" Agujas Hidérmicas Desechables ExelInternational/ Fisher Scientific14-840-83; ref #26402Cualquier aguja de 26 G puede ser sustituida, debe ser desmontable de la jeringa 
Jeringa estéril de 3 mLFisherbrand/ Fisher Scientific 14-955-457
AB Almohadilla estérilMcKesson/ Fisher Scientific NC0593755Alternativamente puede usar almohadillas absorbentes esterilizables en autoclave 
Ácido acético,milípore glacial SigmaAX0073Necesita diluirse al 1%
Tampón de lisado de cloruro de amonio y potasio (ACK)Gibco/ Thermo Fisher Scientific A1049201Se utiliza para la lisis de glóbulos rojos en preparación para la citometría de flujo 
Cámara de inducción de anestesia 2 lVetEquip941444
solución de betadine (providona yodada) Penn Veterinary Supply Inc/ Fisher ScientificNC0158124
Buprenorfina HCL Inyección 0.3 mg/mL Genérico / Covetrus59122Debe obtener una licencia estatal y federal de la DEA para comprar sustancias controladas
Calcein-AMSigma Aldrich206700-1MG
Collagenase P Roche11249002001Se utiliza para digerir
hisopos y aplicadores de algodónFisherbrand/ Fisher Scientific 22-363-172
Cryofilm Tipo II C (10), sección de 3,5 cmLab, JapónCFS 105
DAPI Solución de tinción Abcamab228549
Báscula de gramos digitalToprime / AmazonPuede usar cualquier báscula de marca para pesar ratones
Pinzas de disección  Fisherbrand/ Fisher Scientific 08-953E; 08-953F
Tijeras de disección Fisherbrand/ Fisher Scientific 08-940
Endure Cuchillas de criostato/micrótomo de perfil bajoTanner ScientificTNR315LP
Ethiqa XR Buprenorfina de liberación prolongada 1.3 mg/mLEthiqa XR/ Cevetrus72117Debe obtener una licencia estatal y federal de la DEA para comprar sustancias controladas
Fast Green, 0.2%Electrónica Miscroscopy Sciences EMS50-319-57
Calor sérico fetal bovino Gibco inactivado / Thermo Fisher Scientific A5256801utilizado para fabricar la solución de montaje FACS Staining Media (FSM)
Fluoromount-G Biotecnología del Sur 0100-01
GLUSEAL Adhesivo Cutáneo Tópico AD Quirúrgico GLU-550
Cabra anti-Conejo Alexa 647Thermo FisherA21244dilución 1:300
Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS)Gibco/ Thermo Fisher Scientific14065056Se utiliza para fabricar medios de tinción FACS (FSM)
Almohadilla térmica (grande)Boncare/ AmazonB0CLHSWXSXPuede usar cualquier almohadilla térmica de marca, retire la cubierta de tela 
HematoxilinaMilliporeSigma/ Fisher ScientificM1051740500
HialuronidasaMilliporeSigmaHX0514Se utiliza para la digestión ósea
Isoflurano Sistema de anestesia animalVetEquip901810
KUBTEC Parámetro 2D Sistema de rayos X para cabinaOncoMed SolutionsN/ASe puede utilizar cualquier sistema de imágenes para cabina de rayos X
Microcentrífuga TubosCorning/ Thomas Scientific 8600A52
Cubierta de vidrio para microscopio, 18 mm x 18 mm, # 1 espesorGlobe Scientific1414-10
N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etano ácido sulfónico HEPES (1M) Gibco/ Thermo Fisher Scientific156300-80Se utiliza para fabricar medios de tinción FACS (FSM)
Norland optical Adhesive NO61Edmund Optical37-322Se utiliza para adherir secciones de película criogénica a un portaobjetos 
Anticuerpo monoclonal de conejo Osterix Abcamab209484dilución 1:500
Peroxigard Listo para usar Desinfectante de un solo pasoVirox Technologies29101Se puede sustituir con cualquier otro desinfectante de grado clínico/de laboratorio
Yoduro de propidio (PI) Invitrogen/ Thermo Fisher Scientific P1304MPTinción fluorescente nuclear utilizada para detectar células muertas para recuentos de viabilidad
Recortadora eléctrica recargableWahl/ AmazonB001FWXKUESe puede usar cualquier tijera, una recortadora de tamaño más pequeño facilitará el afeitado de animales más pequeños
Cono de nariz para roedoresVetEquip921609
Safranina O, 85% pura, certificadaFisher ScientificAC419211000
Seal'N Freeze Cryotray Moldes cuadrados Cienciasde la Miscroscopia Electrónica EMS62642-01Utilizado para la incrustación, se pueden utilizar otros moldes de incrustación. Este modelo específico tiene un molde más profundo, así como una tapa para sellar el bloque 
Nitrato de plataSigmaAldrich S6506Nitrato de plata para la tinción de von Kossa
Solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS)Gibco/ Thermo Fisher Scientific10010023Alternativamente, se puede utilizar PBS recién preparado que haya sido filtrado y esterilizado en autoclave
Bisturíes estándar estérilesIntegra Miltex/ Fisher Scientific12-460-455
Bisturíesestándar estérilesIntegra Miltex/ Fisher Scientific12-460-455
Sacarosa en polvo 1 KGThermo Fisher Scientific036508-A1
Superfrost Plus Portaobjetos de miscroscopioFisherbrand/ Fisher Scientific 1255015Portaobjetos adhesivos
Sure-Tek Procesamiento de tejidos/ Incrustación de casetesFisherbrand Histosette/ Fisher Scientific22-048-141
Tissue Plus Temperatura de corte óptima O.C.T CompoundFisher Scientific23-730-571
Esponjas de pañuelosEpredia/ Fisher Scientific84-53Las esponjas de pañuelos protegen los tejidos de los sobreprocedimientos 
Toluidina AzulFisher Scientific AC348600050
óseo B06X6LW4V9

Referencias

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