El modelo de lesión de la médula ósea murina es una herramienta útil para estudiar la osteogénesis postnatal a través de la osificación intramembranosa. Este protocolo quirúrgico simplificado describe el procedimiento de ablación de la médula ósea para la evaluación posterior de la formación de hueso nuevo y las respuestas celulares después de una lesión.
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Artículo de método
Metodología mejorada para el estudio de la osteogénesis postnatal mediante osificación intramembranosa en un modelo de lesión de médula ósea murina
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Resumen
Resumen
Las lesiones de huesos largos se curan a través de vías de formación de hueso endocondral o intramembranoso. A diferencia de la vía endocondral que requiere una plantilla de cartílago, el proceso de osificación intramembranosa implica la conversión directa de células madre y progenitoras esqueléticas (SSPC) en osteoblastos formadores de hueso. Existen métodos quirúrgicos limitados para modelar este proceso en ratones experimentales. Aquí, hemos mejorado un modelo de lesión de la médula ósea en ratones para facilitar el estudio de la reparación ósea a través de la osificación intramembranosa y para evaluar los reguladores postnatales de la osteogénesis. Este método es altamente reproducible y fácil de usar, y permite la evaluación temporal de la formación de hueso nuevo en un corto período (3-7 días después de la lesión) mediante tomografía microcomputarizada (μCT) e histología de corte congelado. Además, las contribuciones de los SSPC y los osteoblastos maduros pueden evaluarse fácilmente utilizando una combinación de ratones reporteros fluorescentes y este modelo de lesión intramembranosa de la médula ósea. En contextos clínicos, la formación de hueso intramembranoso es relevante para la curación de defectos de tamaño crítico, fracturas estabilizadas, defectos corticales, traumatismos por resecciones tumorales y reemplazos articulares.
Introducción
Las lesiones de huesos largos se curan a través de la vía de formación de hueso endocondral o intramembranoso. A diferencia de la vía endocondral, que requiere un paso precursor del cartílago, la reparación ósea mediante osificación intramembranosa implica la conversión directa de células madre y progenitoras esqueléticas (SSPCS) en osteoblastos formadores de hueso1. Clínicamente, este proceso es relevante para la cicatrización ósea en una variedad de contextos, incluyendo defectos críticos de tamaño, fracturas estabilizadas, defectos corticales, osteogénesis por distracción, trauma por resecciones tumorales y ....
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Protocolo
Los siguientes procedimientos se realizaron con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Centro de Salud de la Universidad de Connecticut. Todas las cirugías se realizaron en condiciones estériles según lo descrito por las pautas de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). El dolor y el riesgo de infecciones se trataron con analgésicos y antisépticos adecuados para garantizar un resultado exitoso.
1. Preparación del área quirúrgica y del instrumental
- Prepare la sala de procedimientos quirúrgicos desinfectando las superficies de trabajo con....
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Resultados
El éxito del procedimiento de ablación mecánica de médula ósea (MO) se validó mediante imágenes radiográficas, mientras que la aguja de 26G se insertó en la cavidad medular (Figura 2A). Cuando las imágenes de rayos X indicaron que la aguja se insertó en un ángulo incorrecto o penetró a través del hueso, la aguja se volvió a insertar en el ángulo adecuado y se volvió a obtener una imagen para confirmar la ubicación precisa. Cuando no se pudo alcanzar una posición exitosa, el animal fue exclui.......
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Discusión
El objetivo era establecer un método fiable y reproducible para estudiar los procesos moleculares y celulares que gobiernan la reparación ósea, centrándose en la conversión directa de células madre y progenitoras esqueléticas (SSPC) en osteoblastos depositantes de hueso en el espacio/cavidad de la médula ósea. El método de ablación mecánica de la médula ósea descrito aquí es un protocolo optimizado y validado para la ablación de la médula ósea por lesión mecánica, que permite la investig.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen divulgaciones que informar.
Agradecimientos
La financiación fue proporcionada por NIH/NIDCR R01-DE030716-01 y NIH/NIAMS R01-DE030716-01S1 a AS, NIH/NIAMS R01AR080131 a RG, y UConn REP Convergence Grant a RG y AS.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Solución de formalina al 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| 25 G 0.625 in Air-tite EZ Flo Aguja Hipodérmica | Ait Tite/ Fisher Scientific | 14-817-239; ref #NEZ25058 | |
| 26 G 1/2" Agujas Hidérmicas Desechables Exel | International/ Fisher Scientific | 14-840-83; ref #26402 | Cualquier aguja de 26 G puede ser sustituida, debe ser desmontable de la jeringa |
| Jeringa estéril de 3 mL | Fisherbrand/ Fisher Scientific | 14-955-457 | |
| AB Almohadilla estéril | McKesson/ Fisher Scientific NC0593755 | Alternativamente puede usar almohadillas absorbentes esterilizables en autoclave | |
| Ácido acético, | milípore glacial Sigma | AX0073 | Necesita diluirse al 1% |
| Tampón de lisado de cloruro de amonio y potasio (ACK) | Gibco/ Thermo Fisher Scientific | A1049201 | Se utiliza para la lisis de glóbulos rojos en preparación para la citometría de flujo |
| Cámara de inducción de anestesia 2 l | VetEquip | 941444 | |
| solución de betadine (providona yodada) | Penn Veterinary Supply Inc/ Fisher Scientific | NC0158124 | |
| Buprenorfina HCL Inyección 0.3 mg/mL | Genérico / Covetrus | 59122 | Debe obtener una licencia estatal y federal de la DEA para comprar sustancias controladas |
| Calcein-AM | Sigma Aldrich | 206700-1MG | |
| Collagenase P | Roche | 11249002001 | Se utiliza para digerir |
| hisopos y aplicadores de algodón | Fisherbrand/ Fisher Scientific | 22-363-172 | |
| Cryofilm Tipo II C (10), sección de 3,5 cm | Lab, Japón | CFS 105 | |
| DAPI Solución de tinción | Abcam | ab228549 | |
| Báscula de gramos digital | Toprime / Amazon | Puede usar cualquier báscula de marca para pesar ratones | |
| Pinzas de disección | Fisherbrand/ Fisher Scientific | 08-953E; 08-953F | |
| Tijeras de disección | Fisherbrand/ Fisher Scientific | 08-940 | |
| Endure Cuchillas de criostato/micrótomo de perfil bajo | Tanner Scientific | TNR315LP | |
| Ethiqa XR Buprenorfina de liberación prolongada 1.3 mg/mL | Ethiqa XR/ Cevetrus | 72117 | Debe obtener una licencia estatal y federal de la DEA para comprar sustancias controladas |
| Fast Green, 0.2% | Electrónica Miscroscopy Sciences EMS | 50-319-57 | |
| Calor sérico fetal bovino | Gibco inactivado / Thermo Fisher Scientific | A5256801 | utilizado para fabricar la solución de montaje FACS Staining Media (FSM) |
| Fluoromount-G | Biotecnología del Sur | 0100-01 | |
| GLUSEAL Adhesivo Cutáneo Tópico | AD Quirúrgico | GLU-550 | |
| Cabra anti-Conejo Alexa 647 | Thermo Fisher | A21244 | dilución 1:300 |
| Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) | Gibco/ Thermo Fisher Scientific | 14065056 | Se utiliza para fabricar medios de tinción FACS (FSM) |
| Almohadilla térmica (grande) | Boncare/ Amazon | B0CLHSWXSX | Puede usar cualquier almohadilla térmica de marca, retire la cubierta de tela |
| Hematoxilina | MilliporeSigma/ Fisher Scientific | M1051740500 | |
| Hialuronidasa | MilliporeSigma | HX0514 | Se utiliza para la digestión ósea |
| Isoflurano Sistema de anestesia animal | VetEquip | 901810 | |
| KUBTEC Parámetro 2D Sistema de rayos X para cabina | OncoMed Solutions | N/A | Se puede utilizar cualquier sistema de imágenes para cabina de rayos X |
| Microcentrífuga Tubos | Corning/ Thomas Scientific | 8600A52 | |
| Cubierta de vidrio para microscopio, 18 mm x 18 mm, # 1 espesor | Globe Scientific | 1414-10 | |
| N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etano ácido sulfónico HEPES (1M) | Gibco/ Thermo Fisher Scientific | 156300-80 | Se utiliza para fabricar medios de tinción FACS (FSM) |
| Norland optical Adhesive NO61 | Edmund Optical | 37-322 | Se utiliza para adherir secciones de película criogénica a un portaobjetos |
| Anticuerpo monoclonal de conejo Osterix | Abcam | ab209484 | dilución 1:500 |
| Peroxigard Listo para usar Desinfectante de un solo paso | Virox Technologies | 29101 | Se puede sustituir con cualquier otro desinfectante de grado clínico/de laboratorio |
| Yoduro de propidio (PI) | Invitrogen/ Thermo Fisher Scientific | P1304MP | Tinción fluorescente nuclear utilizada para detectar células muertas para recuentos de viabilidad |
| Recortadora eléctrica recargable | Wahl/ Amazon | B001FWXKUE | Se puede usar cualquier tijera, una recortadora de tamaño más pequeño facilitará el afeitado de animales más pequeños |
| Cono de nariz para roedores | VetEquip | 921609 | |
| Safranina O, 85% pura, certificada | Fisher Scientific | AC419211000 | |
| Seal'N Freeze Cryotray Moldes cuadrados Ciencias | de la Miscroscopia Electrónica EMS | 62642-01 | Utilizado para la incrustación, se pueden utilizar otros moldes de incrustación. Este modelo específico tiene un molde más profundo, así como una tapa para sellar el bloque |
| Nitrato de plata | Sigma | Aldrich S6506 | Nitrato de plata para la tinción de von Kossa |
| Solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) | Gibco/ Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Alternativamente, se puede utilizar PBS recién preparado que haya sido filtrado y esterilizado en autoclave |
| Bisturíes estándar estériles | Integra Miltex/ Fisher Scientific | 12-460-455 | |
| Bisturíes | estándar estérilesIntegra Miltex/ Fisher Scientific | 12-460-455 | |
| Sacarosa en polvo 1 KG | Thermo Fisher Scientific | 036508-A1 | |
| Superfrost Plus Portaobjetos de miscroscopio | Fisherbrand/ Fisher Scientific | 1255015 | Portaobjetos adhesivos |
| Sure-Tek Procesamiento de tejidos/ Incrustación de casetes | Fisherbrand Histosette/ Fisher Scientific | 22-048-141 | |
| Tissue Plus Temperatura de corte óptima O.C.T Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Esponjas de pañuelos | Epredia/ Fisher Scientific | 84-53 | Las esponjas de pañuelos protegen los tejidos de los sobreprocedimientos |
| Toluidina Azul | Fisher Scientific AC348600050 |
Referencias
- Bahney, C. S., et al. Cellular biology of fracture healing. J Orthop Res. 37 (1), 35-50 (2019).
- Ko, F. C., Sumner, D. R. How faithfully does intramembranous bone regeneration recapitulate embryonic skeletal development. Dev Dyn. 250 (3), 377-392 (202....
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Reimpresiones y permisos
