Typha latifolia, que se propaga principalmente asexualmente a través de rizomas, plantea desafíos de recolección debido a su extenso sistema de raíces. Este artículo presenta un método para cultivar T. latifolia a partir de semillas, lo que facilita el cultivo en laboratorio y ofrece el potencial para el crecimiento estéril de plantas y la bioaumentación microbiana temprana.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Método optimizado para el cultivo y la bioaumentación microbiana de Typha latifolia (totora)
En este artículo
Resumen
Resumen
Typha latifolia, más comúnmente conocida como espadaña de hoja ancha o junco común, tiene un rango de alcance global y domina los ecosistemas de humedales en América del Norte. Si bien las diferentes especies de totora a menudo se consideran invasoras en América del Norte, T. latifolia se considera la especie nativa de la región y se encuentra en todo el continente como la especie dominante de Typha . Históricamente, Typha ha cumplido varias funciones, desde fuentes de alimentos hasta materiales de construcción. Más recientemente, T. latifolia se ha convertido en una especie prominente para ayudar a los esfuerzos de biorremediación. Con el creciente interés en el desarrollo de sistemas de tratamiento de humedales construidos (CWTS) para la remediación de contaminantes, se necesitan técnicas reproducibles para cultivar totora en un entorno de laboratorio. El trabajo presentado aquí examinó y probó varios parámetros de crecimiento para el cultivo exitoso de T. latifolia a partir de semillas. La germinación exitosa de las especies de Typha implica la escarificación (ruptura de la cubierta de la semilla), que se logró utilizando técnicas mecánicas para la producción a gran escala. Se demostró que el establecimiento temprano de semillas favorece condiciones de bajo crecimiento de nutrientes durante la primera semana, seguido de la introducción de fertilizantes en las semanas posteriores para mejorar la supervivencia posterior al trasplante. Para la bioaumentación microbiana del sistema vegetal, los resultados mostraron que remojar las semillas en inóculo conduce a una colonización más extensa del tejido radicular y a la persistencia bacteriana a largo plazo. Se utilizó una técnica optimizada de esterilización de semillas utilizando una combinación de lejía y detergente para mejorar el éxito de la colonización de microorganismos. Los vasos de crecimiento, tanto estériles como no estériles, diseñados en este estudio apoyan el crecimiento a largo plazo de T. latifolia en diversas condiciones.
Introducción
Como tecnología rentable y energéticamente eficiente, los sistemas de tratamiento de humedales construidos (CWTS) han ganado una popularidad significativa para la remediación de contaminantes ambientales 1,2,3. CWTS utiliza procesos físicos, químicos y biológicos para eliminar, transformar o estabilizar contaminantes. Si bien los procesos físicos y químicos involucrados en el recambio químico se han caracterizado bien desde la génesis de CWTS, el impacto de la vegetación siguió siendo en gran medida enigmático2. En los últimos años, ha habido un mayor enfoque en la comprensión de los mecanismos por los cuales las plantas transforman contaminantes orgánicos e inorgánicos de posible preocupación en las aguas residuales 2,4,5. Sin embargo, estudios mecanicistas como estos se basan en la capacidad de cultivar un gran número de macrófitos y favorecer el crecimiento a partir de semillas para garantizar que cada planta se encuentre en la misma etapa de crecimiento y desarrollo.
Los CWTS en América del Norte se establecen con frecuencia utilizando vegetación nativa de humedales naturales de la región, como las especies Typha, Scirpus, Juncus y Phragmites 6,7. La elección de la vegetación también depende del humedal construido que se emplee, que puede variar en profundidad, flujo de agua, abastecimiento de sustrato y abastecimiento de agua (con o sin recirculación)2. Finalmente, el clima también influye en la vegetación de los humedales, siendo los climas más fríos los que favorecen a las plantas sumergidas debido a su mayor adaptabilidad8. Las especies de Typha son de particular interés en humedales profundos construidos de flujo superficial debido a su capacidad para colonizar rápidamente un ambiente y adaptarse a diversas condiciones ambientales 9,10.
Una revisión reciente de los resultados informó que, de 87 pruebas de fitotoxicidad con especies de Typha , solo 15 estudios iniciaron las plantas de prueba a partir de semillas, y de ellos, solo un estudio examinó el crecimiento en plantas maduras11. Esta subrepresentación de la experimentación de totora a partir de semillas indica una brecha en la literatura sobre protocolos destinados a describir el cultivo de totora para estudios de laboratorio. Los protocolos descritos aquí tienen como objetivo cerrar esta brecha presentando un protocolo en profundidad para el crecimiento de Typha latifolia desde la semilla hasta la planta madura en condiciones estériles y no estériles. Además, este artículo analiza una técnica para la bioaumentación bacteriana de especies de totora en la etapa de semilla donde la inoculación temprana puede ayudar a mantener la persistencia a largo plazo de los microbios rizofíticos y endófitos introducidos.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Escarificación de semillas
- Las semillas de totora se obtuvieron de un humedal en Calgary, AB, Canadá, en el otoño de 2023 (51.11312 ° N, 114.39381 ° W). Recoja la inflorescencia de totora en el otoño y guárdela en una bolsa de papel en la oscuridad hasta su uso. Si todavía está en el tallo, recolecte la inflorescencia en la primavera, pero la recuperación de semillas disminuirá.
- Con unas tijeras de jardín, corte el tallo de la planta ~ 2 cm de la base de la inflorescencia. Retire las semillas de la inflorescencia y colóquelas en una licuadora de laboratorio hasta que el volumen de la licuadora esté aproximadamente un cuarto lleno. Esto es aproximadamente 250 mL de semillas no compactadas.
- Llene la licuadora con 500 ml de agua del grifo. Mantenga un espacio libre de 10 cm en la licuadora. Triturar a velocidad media-baja durante 20 s y pasar inmediatamente a un vaso grande de 1 L. La solución resultante debe ser viscosa.
- Transfiera aproximadamente 100 ml de este lodo de agua de semillas nuevamente a la licuadora y llénela con 400-600 ml de agua fresca del grifo. Licue a velocidad media-alta durante 20 s e inmediatamente transfiera a un vaso de precipitados fresco de 1 L.
- Llene el vaso de precipitados con agua del grifo hasta 800 ml y déjelo reposar durante al menos 60 segundos. Las semillas de totora escarificadas y viables se hundirán hasta el fondo del vaso de precipitados, y la pluma y el pico (consulte la Figura 1 para obtener una descripción de la estructura de la semilla de totora) flotarán hacia la parte superior. Saque el lodo en la parte superior del vaso de precipitados y vierta lentamente el agua del vaso de precipitados sin alterar las semillas en la parte inferior. Transfiera las semillas a un vaso de precipitados de 100 ml.
- Repita el proceso de mezcla en el resto del lodo de totora del paso 1.5.
- Coloque el vaso de precipitados que contiene las semillas en un plato revuelto y gire a velocidad media durante 1 h. Después de 1 h, retire cualquier material vegetal que flote en la parte superior del vaso de precipitados.
- Vierta las semillas en un embudo Büchner con papel de filtro conectado a una aspiradora para secar las semillas durante la noche. Las semillas secas se pueden almacenar a -20 °C en tubos cónicos de polipropileno de 15 ml.
2. Germinación mediante técnica no estéril
- Prepare placas de medios Murashige y Skoog (MS) de concentración media con fitoagar12 al 1%.
- Coloque aproximadamente 1 ml de semillas secas en un tubo cónico de polipropileno de 15 ml y llénelo con 10 ml de agua del grifo. Gire sobre un agitador orbital a baja velocidad durante 24 h para inducir la germinación.
- Elimine el exceso de agua de modo que queden 3 ml en el tubo cónico de polipropileno de 15 ml.
- Corte la punta de una punta de pipeta de plástico de 1000 μL para aumentar el tamaño del orificio y pipetee la solución de semillas vigorosamente para suspender las semillas dentro de la punta de la pipeta.
- Coloque las semillas y el agua en las placas de agar MS de concentración media. Agite el plato para distribuir las semillas de manera uniforme.
- Envuelva las placas en una película de sellado de laboratorio y colóquelas en una cámara de crecimiento con un ciclo de luz-oscuridad de 16 h / 8 h a 23 ° C y 70% de humedad. Incube las placas durante 1 semana (hasta 2 semanas) para inducir la germinación de las semillas.
3. Germinación mediante técnica estéril
NOTA: Se probaron y compararon diferentes protocolos de esterilización de semillas. La técnica que produjo las tasas de germinación más altas mientras producía semillas completamente esterilizadas fue modificada de un protocolo anterior13 y se describe aquí.
- Prepare placas de medios MS de concentración media con fitoagaral 1% 12.
- Coloque un volumen de aproximadamente 1 mL de semillas en un tubo cónico de polipropileno de 15 mL y llénelo con 10 mL de ddH2O estéril. Coloque en un agitador orbital a velocidad media-alta durante 10 min.
- Retire el agua y agregue 5 ml de una solución de polisorbato 20 al 0,1% (preparada en ddH2O estéril) al tubo cónico de polipropileno de 15 ml. Colocar en un agitador orbital a velocidad media-alta durante 10 min.
- Retire la solución y agregue 5 ml de una solución de lejía comercial al 30% y una solución de polisorbato 20 al 0,025% (preparada en ddH2O estéril) al tubo cónico de polipropileno de 15 ml. Agitar a velocidad media-alta durante 30 min.
- Retire la solución y reemplácela con ddH2O. estéril Agitar a velocidad media-alta durante 5 min. Repita para un total de 3 enjuagues con agua.
- Llene el tubo cónico de polipropileno de 15 ml con ddH2O estéril y gírelo a baja velocidad durante 24 h para inducir la germinación. Después de 24 h, retire el exceso de agua para que queden 3 ml en el tubo de plástico.
- Corte asépticamente la punta de una punta de pipeta de plástico de 1000 μL y pipetee vigorosamente para suspender las semillas dentro de la punta.
- Colocar semillas y líquido en placas de agar MS de concentración media. Gire el plato para distribuir uniformemente las semillas.
- Envuelva las placas en una película de sellado de laboratorio y colóquelas en una cámara de crecimiento con un ciclo de luz-oscuridad de 16 h / 8 h a 23 ° C y 70% de humedad. Deje las placas durante 1 semana (hasta 2 semanas) para permitir que ocurra la germinación.
4. Inoculación de semillas con bacterias seleccionadas
- Para inocular semillas de totora, primero siga el protocolo de germinación de semillas estériles anterior hasta el paso 3.6 para producir semillas estériles. Retire el enjuague final con agua del tubo cónico de polipropileno de 15 ml como se describe en el paso 3.6 anterior.
- Utilizando cultivos microbianos cultivados durante la noche inoculados a partir de un solo aislado o comunidad, mida el OD600 y normalice a un valor de absorbancia de 1,0 diluyendo en medio de cultivo. Incube los cultivos durante un período de tiempo más largo si no se logra una OD600 de 1.0.
NOTA: Aquí, se establecieron cultivos a partir de una Luteimonas sp. aislada de raíces de plantas en el norte de Alberta y conjugada para expresar una proteína fluorescente DsRed para visualización microscópica. - Centrifugar 1 mL de cultivo a 9300 x g durante 2 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato. Centrifugar a 9300 x g durante 2 min.
- Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento bacteriano en 1 ml de ddH2O estéril.
- En un tubo cónico de polipropileno de 15 mL, agitar aproximadamente 1 mL de semillas a baja velocidad durante 24 h en 10 mL de una dilución 1:10 del inóculo preparado con tensioactivo organosiliconado al 0,025%.
- Siga el resto del protocolo de germinación de semillas estériles a partir del paso 3.8.
5. Crecimiento de totora no estéril en el suelo
- Llene las macetas con tierra baja en materia orgánica de su elección, dejando 1 cm de espacio desde la parte superior de la maceta. Humedezca previamente el suelo con agua del grifo y haga agujeros de 1 cm en el suelo.
- Con unas pinzas, retire suavemente las plántulas germinadas durante 1 semana de las placas de agar MS cultivadas como se describe en el paso 3 anterior, teniendo cuidado de no dañar las raíces. Coloque suavemente una plántula en cada hoyo del suelo y cúbrala con tierra.
- Coloque las macetas en una bandeja y llénelas con agua del grifo hasta el nivel del suelo. Por cada 10 macetas, agregue 100 ml de fertilizante NPK al 0,5% 20/20/20.
- A cada juego de diez macetas, agregue fertilizante de la siguiente manera: semana 2 - 100 ml de fertilizante al 0,5%, semana 3 - 100 ml de fertilizante al 1,0%, semana 4 - 100 ml de fertilizante al 1,0%.
- Después de 4 semanas, detenga la fertilización semanal y fertilice solo una vez al mes con 100 ml de solución fertilizante al 1.0%. A las 4 semanas, trasplante a macetas más grandes, si es necesario. Las plantas son menos sensibles al tipo de suelo en este punto, así que use cualquier mezcla.
- Continúe trasplantando espadañas a medida que superan su contenedor. Retire el follaje muerto con tijeras. Fertilice las espadañas una vez al mes.
- Para experimentos, trasplante las plántulas a una maceta pequeña que, cuando se coloca en el fondo de una caja de puntas de pipeta vacía, se ancla por los lados de la caja. Esto permite una inundación adecuada del suelo, imitando así las condiciones de los humedales. Si realiza experimentos en espadañas más viejas, modifique de manera similar para que la maceta pueda sumergirse casi por completo en agua.
6. Crecimiento estéril de plántulas
- Diseño de la cámara de crecimiento de plántulas
NOTA: El montaje de cada unidad de cámara de crecimiento de plántulas requiere dos cajas de cultivo, una jeringa con punta luer lock, un filtro estéril desechable de 0,2 μm y silicona resistente al calor. Consulte la Figura 2 para obtener una representación visual de la configuración de la cámara.- Retire las tapas de las cajas de cultivo y use un taladro de mano para crear orificios de 3,5 cm de diámetro en el centro de las tapas. Use silicona resistente al calor para pegar la parte superior de las dos tapas.
- Taladre un orificio del tamaño de la punta de la jeringa (~ 1 cm de diámetro) en la esquina inferior de una de las cajas de cultivo. Corta la punta de una jeringa y desecha el cuerpo de la jeringa.
- Use silicona resistente al calor para fijar la punta de la jeringa en la caja de cultivo con la rosca Luer lock en el exterior de la caja.
- Deje que la silicona se cure al menos 24 h antes de su uso.
- Crecimiento estéril en el suelo
- Siga el protocolo de germinación de semillas estériles descrito en el paso 3 para obtener semillas estériles.
- Llene la unidad de la cámara de crecimiento estéril con tierra de su elección, humedecida con agua del grifo.
- Autoclave en un ciclo líquido de 20 min, cubriendo la punta de bloqueo del señuelo con papel de aluminio. Después de 24 h, vuelva a esterilizar el sistema en autoclave en un ciclo líquido de 20 min. Realice todos los pasos posteriores en una campana de flujo laminar.
- Conecte una unidad de filtro de 0,2 μm al accesorio Luer lock en la cámara de crecimiento (Figura 2). Abra la cámara de crecimiento y agregue 500 μL de fertilizante 1% 20/20/20 esterilizado por filtro al suelo. Mezcle la tierra con una espátula estéril. Mientras mezcla la tierra, agregue ddH2O estéril para asegurarse de que esté adecuadamente hidratada sin sobresaturación.
- Use una cuchilla de afeitar estéril para cortar el agar MS de las placas que contienen plántulas de 1 semana en cuartos. Use una espátula estéril para colocar la pieza de agar en el suelo.
- Coloque la unidad de cámara de crecimiento en una incubadora de crecimiento de plantas en un ciclo día-noche de 16 h / 8 h a 23 ° C y 70% de humedad.
- Crecimiento estéril en solución hidropónica
- Siga el protocolo de germinación estéril descrito en el paso 3 para obtener semillas estériles.
- Autoclave una caja de puntas de pipeta y agar MS de concentración media en un ciclo líquido de 20 min. En una campana de flujo laminar, envuelva la parte inferior del inserto de la punta con una película de sellado de laboratorio estéril. Llene cada abertura de la punta de la pipeta con agar casi hasta arriba.
- Vuelva a añadir el inserto de la punta a la caja de la punta, llenando el fondo de la caja con la solución de crecimiento hidropónico de Hoagland de concentración media (0,5 mM NH4H2PO4, 3 mM KNO3, 2 mM Ca(NO3)2, 1mM MgSO4, 0,023 mM H3BO3, 0,005 mM MnCl2·4H2O, 0,0004 mM ZnSO4·7H2O, 0,0002 mM CuSO4,5H 2O, 0,00007 mM H2MoO4,1H 2O, y 0,045 mM FeSO4,7H 2O, ajustado a pH 7,0).
- Retire con cuidado las plántulas de las placas de agar MS y colóquelas en el agar MS encima del agar en la abertura de la pipeta en el inserto de la caja de puntas.
- Cierre la tapa de la caja de puntas y colóquela en una cámara de crecimiento en un ciclo día-noche de 16 h / 8 h a 23 ° C y 70% de humedad.
- Cuando las plantas sean demasiado grandes para la caja de puntas, transplante a la cámara de crecimiento de cultivo descrita en el paso 5.1. Para transferir, retire todo el tapón de agar con la planta y muévalo a un tapón de espuma con un corte radial. El tapón de espuma se puede colocar entre las dos cajas de cultivo, y la caja de cultivo inferior se puede llenar con Hoagland's de resistencia media.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
La Figura 1 muestra una representación de una semilla de Typha que ha pasado por el proceso de escarificación, junto con una semilla escarificada incompleta sin pico y una semilla no escarificada. Asegúrese de que el tiempo de mezcla sea suficiente para producir principalmente semillas completamente escarificadas.
Después de escarificar y secar las semillas, se debe probar la viabilidad de las semillas utilizando la técnica de germinación no estéril. Al f...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
El protocolo presentado aquí proporciona una guía detallada para el crecimiento de especies de totora a partir de semillas para aplicaciones de laboratorio. Si bien la espadaña se puede propagar fácilmente a partir de esquejes de rizoma, comenzar plantas a partir de semillas permite la variación genética dentro de un conjunto de muestras, asegura que las plantas estén en las mismas etapas de crecimiento y brinda la oportunidad de una colonización temprana para experimentos de bioaumentac...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
AZ fue financiado por un Premio de Posgrado CGS-M del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC). La investigación sobre CWTS en el laboratorio de Muench cuenta con el apoyo de Genome Canada a través de una subvención del Proyecto de Investigación Aplicada a Gran Escala (LSARP) (# 18207) en asociación con Genome Alberta y Genome Quebec.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0.2 & micro; Filtro estéril M | VWR | 514-4126 | |
| 3′,5′-Dimetoxi-4′-hidroxiacetofenona | Laboratorios PhytoTech | S7777 | |
| Cajas de cultivo con tapas (77 mm y tiempos 77 mm y veces 97 mm) | Millipore Sigma | V8505 | |
| Sellador de silicona resistente al calor para altas temperaturas | Grupo Imperial de Fabricación | KK0205 | |
| Película de sellado de laboratorio | Millipore Sigma | P7793 | |
| Murashige y Skoog media | Laboratorios PhytoTech | M401 | |
| Tensioactivo organosiliciano | Laboratorios PhytoTech | S7777 | |
| Phytoagar | GoldBiotechnology | P1003 | |
| Polisorbato 20 | Roche | 11332465001 |
Referencias
- Ciria, M. P., Solano, M. L., Soriano, P. Role of Macrophyte Typha latifolia in a Constructed Wetland for Wastewater Treatment and Assessment of Its Potential as a Biomass Fuel. Biosys Eng. 92 (4), 535-544 (2005).
- Shelef, O., Gross, A., Rachmilevitch, S. Role of Plants in a Constructed Wetland: Current and New Perspectives. Water. 5 (2), 405-419 (2013).
- Parde, D., et al. A review of constructed wetland on type, treatment and technology of wastewater. Environ Tech Innovation. 21, 101261(2021).
- Abdullah, S. R. S., et al. Plant-assisted remediation of hydrocarbons in water and soil: Application, mechanisms, challenges and opportunities. Chemosphere. 247, 125932(2020).
- Noor, I., et al. Heavy metal and metalloid toxicity in horticultural plants: Tolerance mechanism and remediation strategies. Chemosphere. 303, 135196(2022).
- Vymazal, J. Plants used in constructed wetlands with horizontal subsurface flow: A review. Hydrobiologia. 674 (1), 133-156 (2011).
- Sandoval, L., Zamora-Castro, S. A., Vidal-Álvarez, M., Marín-Muñiz, J. L. Role of Wetland Plants and Use of Ornamental Flowering Plants in Constructed Wetlands for Wastewater Treatment: A Review. Appl Sci. 9 (4), 685(2019).
- Wu, H., et al. Constructed wetlands for pollution control. Nat Rev Earth Environ. 4, 218-234 (2023).
- Yang, Y., Shen, Q. Phytoremediation of cadmium-contaminated wetland soil with Typha latifolia L. and the underlying mechanisms involved in the heavy-metal uptake and removal. Environ Sci Pollution Res. 27 (5), 4905-4916 (2020).
- Leto, C., Tuttolomondo, T., La Bella, S., Leone, R., Licata, M. Effects of plant species in a horizontal subsurface flow constructed wetland - phytoremediation of treated urban wastewater with Cyperus alternifolius L. and Typha latifolia L. in the West of Sicily (Italy). Ecol Eng. 61, 282-291 (2013).
- Sesin, V., Davy, C. M., Freeland, J. R. Review of Typha spp. (cattails) as toxicity test species for the risk assessment of environmental contaminants on emergent macrophytes. Environ Pollution. 284, 117105(2021).
- Murashige, T., Skoog, F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures. Physiol Plantarum. 15 (3), 473-497 (1962).
- Rogers, S., Beech, J., Sarma, K. S. Shoot regeneration and plant acclimatization of the wetland monocot cattail (Typha latifolia). Plant Cell Rep. 18 (1), 71-75 (1998).
- Tangen, B. A., et al. Distributions of native and invasive Typha (cattail) throughout the Prairie Pothole Region of North America. Wetlands Ecol Management. 30 (1), 1-17 (2022).
- Pieper, S. J., Nicholls, A. A., Freeland, J. R., Dorken, M. E. Asymmetric Hybridization in Cattails (Typha spp.) and Its Implications for the Evolutionary Maintenance of Native Typha latifolia. J Heredity. 108 (5), 479-487 (2017).
- Lansdown, R. V. Typha latifolia. The IUCN Red List of Threatened Species 2017. , (2017).
- Bedish, J. W. Cattail Moisture Requirements and their Significance to Marsh Management. Am Midland Naturalist. 78 (2), 288(1967).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
