Artículo de método

Un método eficiente para extraer epitelios de trompas de Falopio humanas para análisis de células individuales

DOI:

10.3791/67753

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28 de marzo de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 2Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research, University of California, Los Angeles, 3Molecular Biology Institute, University of California, Los Angeles, 4Department of Bioengineering, University of California, Los Angeles, 5Department of Microbiology, Immunology and Molecular Genetics, University of California, Los Angeles, 6Parker Institute for Cancer Immunotherapy, University of California, Los Angeles, 7The Jonsson Comprehensive Cancer Center, University of California Los Angeles, 8The VA Greater Los Angeles Healthcare System, 9Department of Medical and Molecular Pharmacology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

En este artículo

Resumen

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Este protocolo describe un método de un día para el aislamiento de células epiteliales de trompas de Falopio humanas. Las células epiteliales aisladas se pueden sembrar en cultivo bidimensional (2D) o disociarse en suspensiones unicelulares y utilizarse en experimentos posteriores, incluida la citometría de flujo y la secuenciación de ARN unicelular.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las trompas de Falopio humanas son intrínsecas a la reproducción. El propósito de las trompas de Falopio es permitir el tránsito de los espermatozoides, el óvulo y, si la fertilización es exitosa, el embrión. Las células epiteliales que recubren la superficie interna de las trompas de Falopio son parte integral de los procesos normales y anormales de las trompas de Falopio, incluido el inicio de la enfermedad. Después de la menopausia, las trompas de Falopio dejan de tener un papel importante en el cuerpo y la composición de las células intraepiteliales cambia. Describimos un método en el que estas células epiteliales se pueden aislar de trompas de Falopio frescas con una contaminación mínima de células estromales en una suspensión de una sola célula. Estas células pueden cultivarse o utilizarse para análisis posteriores, como la citometría de flujo y la secuenciación de ARN unicelular. Este protocolo de aislamiento se puede lograr en 4-6 h y produce celdas viables que se pueden usar para el análisis posterior inmediato. Este protocolo eficiente facilita el aislamiento de las células epiteliales de las trompas de Falopio con una población epitelial enriquecida.

Introducción

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Las trompas de Falopio están construidas por múltiples partes. Desde el ovario hasta el útero, la trompa de Falopio está compuesta por las fimbrias, la ampolla, el istmo y la porción intramural. Las fimbrias se extienden desde el extremo de la trompa de Falopio, donde agarran el óvulo liberado por el ovario. Luego, el óvulo viaja a través de la ampolla, donde es más probable que sea fertilizado, hasta el istmo y finalmente se transfiere al útero a través de la porción intramural1. La mucosa más interna de la trompa de Falopio que facilita el transporte del óvulo está formada por una capa de epitelio luminal, que incluye células ciliadas y secretoras. Las células ciliadas tienden a estar más concentradas en las fimbrias2. Desempeñan un papel integral en el movimiento físico del óvulo a través de la trompa de Falopio desde el ovario hasta el útero. Sus apéndices permiten que las células ciliadas no solo muevan el óvulo, sino que también eliminen el estrés genotóxicodespués de la ovulación.

Las células epiteliales secretoras de las trompas de Falopio secretan un líquido que ayuda en la nutrición y el ensamblaje de gametos4. La proporción de células ciliadas y secretoras a lo largo del epitelio de la trompa de Falopio difiere en el estado posmenopáusico, con una disminución de las células ciliadas, ya que la trompa de Falopio ya no cumple una función crítica en el transporte5. Además, en ausencia de estrógenos, se cree que las trompas de Falopio se vuelven vestigiales 1,6. Se ha postulado que esta pérdida de células ciliadas en la trompa de Falopio aumenta el riesgo de desarrollar carcinomas serosos7. Además, se cree que las células epiteliales secretoras de las trompas de Falopio dan lugar a lesiones de carcinoma intraepitelial intraepitelial (STIC) serápico tubárico, un precursor bien conocido del subtipo más agresivo de cánceres de ovario tubular, el carcinoma seroso de alto grado 7,8.

El propósito de este protocolo es aislar células epiteliales de las trompas de Falopio humanas y disociarlas en suspensiones unicelulares. Este protocolo produce una población epitelial unicelular enriquecida que se puede utilizar para muchos análisis. Como se muestra en este manuscrito, hemos realizado análisis de citometría de flujo y células plateadas en 2D después del aislamiento. El análisis de citometría de flujo demuestra la presencia de células individuales, que en su mayoría son viables y de naturaleza epitelial. En estos análisis, incluimos cuatro marcadores, e506 para viabilidad, EpCAM para células epiteliales, CD45 para células inmunitarias y CD10 para células estromales. Las células muertas se excluyeron mediante el marcador de viabilidad e506 y las células inmunitarias se excluyeron mediante CD45. Es posible que la suspensión tenga una población de células inmunitarias; sin embargo, para lograr una población relativamente pura de células epiteliales, las células CD45 positivas se pueden agotar utilizando un kit de depleción de CD45. Además, cuando se siembran en cultivo, las células CD45 positivas a menudo no proliferan. Las células aisladas mediante este método y cultivadas en 2D muestran poblaciones epiteliales adherentes similares a adoquines. Este método se puede utilizar para generar preparaciones celulares, que se pueden desarrollar en bibliotecas de ARN de una sola célula.

La investigación para definir el linaje celular de los epitelios de las trompas de Falopio, las alteraciones en estos linajes durante las diferentes fases de la vida reproductiva y los eventos incitadores que conducen a la transformación y génesis maligna se han vuelto más prominentes en los últimos cuatro años 6,9,10,11,12 . Este protocolo beneficiará significativamente la investigación en este campo al proporcionar una forma eficiente de aislar los epitelios de las trompas de Falopio y procesarlos en células individuales.

Protocolo

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Este protocolo fue adaptado de un método de aislamiento de células epiteliales uterinas descrito anteriormente13,14. Se recolectaron muestras frescas de trompas de Falopio no identificadas a través de nuestro protocolo # 10-0727 aprobado por el IRB de la Universidad de California, Los Ángeles (UCLA) y se digirieron en una suspensión de una sola célula en aproximadamente 4 a 6 h.

1. Recolección y preparación de las trompas de Falopio

  1. Recolectar trompas de Falopio humanas frescas (Figura 1A) en medios de disociación (DMEM [4,5 g/L de D-glucosa] que contienen 10% de suero fetal bovino (FBS), 5 mL de L-glutamina y 5 mL de penicilina/estreptomicina) en tubos de 15 mL o 50 mL y transportarlos en hielo al laboratorio.
  2. Transfiera las trompas de Falopio a una placa de Petri estéril que contenga medios de disociación frescos.
  3. Bajo un microscopio de disección, diseccione la grasa, el tejido conectivo y cualquier vaso que rodee los tubos con pinzas de punta fina y tijeras Vannas Tubingen (Figura 1B).
  4. Bajo el microscopio de disección, corte a través del plano coronal de las trompas de Falopio con tijeras para formar pequeños cilindros, de ~3-5 mm cada uno de diámetro (Figura 1C), utilizando las pinzas de punta fina para estabilizar el tejido.

2. Aislamiento y disociación de las células epiteliales

  1. Aspire con cuidado el medio de disociación de la placa.
  2. Lave las piezas de tejido 2 veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) fría pipeteando suavemente ~ 2 ml para cubrir las piezas y girando ligeramente la placa.
  3. Aspire el lavado final de PBS 1x, incube las piezas de tejido durante 5 min en ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) frío de 5 mM a temperatura ambiente y repita durante un total de dos incubaciones. Aspire el EDTA de 5 mM después de cada incubación.
  4. Suspender los fragmentos de tejido en una solución salina balanceada fría de tripsina al 1% y hornear a 4 °C durante 40 min (Figura 1D).
  5. Aspirar la tripsina/HBSS al 1% y lavar las piezas de tejido 2 veces en medios de disociación fríos para inactivar la tripsina.
  6. Incubar los fragmentos de tejido en 2 mL de medio de disociación con 0,4 mg de DNasa durante al menos 30 min a temperatura ambiente.
    NOTA: Puede ser necesario un período de incubación más largo, pero no exceda los 45 minutos antes de comenzar el paso 2.7.
  7. Bajo un microscopio de disección, mientras aún está en el medio con DNasa, sostenga un fragmento de la trompa de Falopio, el lumen paralelo al fondo de la placa, en su lugar con pinzas. Con la otra mano, presione repetidamente la pieza de la trompa de Falopio con pinzas para expulsar las células epiteliales de la luz de la trompa. Confirmar que se observa un halo de células alrededor del tejido a medida que las células se liberan de la luz del tubo. Repita para cada fragmento de trompa de Falopio en el plato (Figura 1E).
  8. Transfiera el medio que contiene células a un tubo estéril de 15 ml, lave la placa de Petri con medio de disociación al menos 2 veces y combine los lavados en el tubo de 15 ml. Deseche los fragmentos del tubo estromal.
  9. Recolectar células por centrifugación a 500 × g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 mL de medio de disociación.
  10. Cuente las células alícuotas 10 μL de la suspensión celular y mezcle 1:1 con azul de tripán. Pipetear 10 μL de la mezcla en un portaobjetos de conteo de cámara e insertarlo en un contador de celdas (Figura 1F).

3. Digestión a suspensión unicelular

  1. Resuspender las células en 9 mL de medio de disociación, 1 mL de 8 mg/mL de colagenasa (tipo 1) y 0,4 mg de DNasa. Incubar a 37 °C durante 30-45 min en un agitador orbital a 200 rpm (Figura 1G).
  2. Recolectar las células por centrifugación a 500 × g durante 5 min. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 5 mL de medio de disociación para lavar la colagenasa.
  3. Pase la suspensión celular a través de un filtro celular de 100 μm a un tubo de 50 mL (Figura 1H).
  4. Recolectar las células por centrifugación a 500 × g durante 5 min.
  5. Si la gránula celular aparece roja, lleve a cabo la lisis de glóbulos rojos (RBC) como se describe en los pasos 3.6-3.8. Si el pellet de la celda no es rojo, vaya al paso 3.9.
  6. Diluir 500 μL de tampón de lisis RBC en 4,5 mL de agua ultrapura.
  7. Aspire el medio, agregue 5 ml del tampón de lisis de glóbulos rojos diluido e incube en hielo durante 3 minutos.
  8. Para detener la lisis de glóbulos rojos, agregue 45 ml de 1x PBS al tubo de 50 ml.
  9. Recolectar las células por centrifugación a 500 × g durante 5 min.
  10. Cuente las células alícuotas 10 μL de la suspensión celular y mezclándola 1:1 con azul de tripán. Pipetear 10 μL de la mezcla en un portaobjetos de conteo de cámara e insertarlo en el contador de células (Figura 1I).

4. Tinción por citometría de flujo

  1. Alícuota de 250.000 células en dos tubos separados de poliestireno de 5 mL de fondo redondo para el control primario de anticuerpos conjugados e isotipos para su uso en la citometría de flujo de marcadores de superficie.
    NOTA: Se pueden utilizar menos celdas para acomodar el recuento de celdas y el número de celdas necesarias para el análisis posterior. Para lograr resultados de flujo óptimos, se debe incluir un mínimo de 50.000 células en el análisis.
  2. Diluya el anticuerpo (p. ej., EpCAM antihumano y CD10) y el isotipo de acuerdo con la dilución recomendada por el fabricante en 1x PBS. Incluye un colorante de viabilidad fijable (e506) y un anticuerpo conjugado anti-CD45 humano para eliminar las células inmunitarias humanas vivas. Prepare suficiente mezcla de anticuerpos para al menos 50 μL por tubo. Dejar en la oscuridad sobre hielo hasta el paso 4.4.
  3. Lave las células con 1 mL de 1x PBS. Recolectar las células por centrifugación a 500 × g durante 5 min a 4 °C.
  4. Aspire el 1x PBS. Vuelva a suspender el pellet en el panel de anticuerpos o isotipo e incube a 4 °C durante 15 min en la oscuridad.
  5. Después de la incubación, diluir en 1 mL de 1x PBS y recolectar las células por centrifugación a 500 × g durante 5 min a 4 °C.
  6. Aspire el 1x PBS y vuelva a suspender el pellet de celda en 200 μL de 1x PBS.

5. Recopilación de datos de citometría de flujo

  1. Inicie sesión en la máquina FACS.
    NOTA: Presentamos el protocolo utilizando el citómetro de flujo al que se hace referencia (consulte la Tabla de Materiales). Para otros citómetros de flujo, siga las instrucciones del fabricante. El ajuste de voltaje del citómetro de flujo se ha preconfigurado para un rendimiento óptimo con PBMC humanos, lo que elimina la necesidad de ajustes de voltaje antes de cada ejecución de FACS.
  2. Si la máquina está en modo de adquisición , vaya al paso 5.3. Si la máquina está en modo de análisis de datos , cambie al modo de adquisición presionando el botón de encendido en la parte superior derecha. Cuando aparezca una ventana emergente, presione el botón que dice modo de adquisición.
  3. En la parte inferior izquierda, si la máquina dice Calibración requerida, continúe con el paso 5.3.1. Si la máquina dice Calibración correctamente, vaya al paso 5.4.
    1. Para calibrar la máquina, saque las perlas de calibración de la nevera y el vórtice a 4 °C.
    2. Coloque 1 gota de perlas de calibración en un tubo de poliestireno de 5 ml de fondo redondo y coloque el tubo en el soporte de tubo individual.
    3. Presione el botón de código de barras en la parte superior derecha y escanee el frasco de cuentas de calibración. Aparecerá una ventana emergente. Si todo está configurado, haga clic en Sí | OK y deje que se ejecute la calibración.
    4. Si la calibración se realiza correctamente, cierre la sesión y vuelva a iniciarla en el modo de adquisición . Continúe con el paso 5.4.
  4. Haga clic en abrir | nuevo espacio de trabajo en la parte superior izquierda.
  5. Seleccione la rejilla chill 5; Seleccione tres de los pozos. Seleccione el primer pozo y dele una descripción (por ejemplo, FTX Ab). Seleccione el siguiente pozo y asígnele una descripción única (por ejemplo, FTX Iso). Selecciona el último pocillo y dale la descripción blanqueador.
    NOTA: Incluya siempre una muestra de lejía después de cada 4-5 muestras experimentales para garantizar la limpieza oportuna de las muestras de células.
  6. Seleccione todos los pozos y configure las condiciones experimentales de la siguiente manera: configuración del instrumento: PBMC humanos; Caudal: alto; Muestra de mezcla: mezcla suave; Modo: estándar; Volumen total de la muestra: 200 μL; Absorción de la muestra: 150 μL; Nota de indización: anticuerpos de entrada y su marcaje de fluoróforos.
  7. Seleccione editar | opciones y asigne un nombre al archivo en descripción| aplicar | aceptar.
  8. Saque la rejilla de la nevera y colóquela en la bandeja con el código de barras mirando hacia la máquina. Coloque los tubos de muestra en la gradilla para reflejar el orden de las muestras en la pantalla y presione el botón de reproducción para iniciar el experimento.
  9. Una vez finalizado el experimento, conecte el USB, seleccione Archivo | copiar, expanda la carpeta privada, seleccione el experimento y haga clic en copiar y expulsar.
  10. Después de la recopilación de datos, utilice un software para analizar la hoja de datos.
  11. Comience con el control de isotipo. Utilice la herramienta Polígono para seleccionar celdas en el diagrama de dispersión directa (FSC) frente a dispersión lateral (SSC).
  12. Cierre las celdas muertas cambiando el eje Y a e506 y el eje X a FSC. Utilice la herramienta polígono para seleccionar la población de células vivas e506 negativas.
  13. Haga doble clic en la población seleccionada. Cambie el eje Y a CD45 humano. Utilice la herramienta polígono para seleccionar la población de celdas. Esta es la población humana de células CD45 negativas.
  14. Haga doble clic en la población de células CD45 negativas. Cambie el eje Y a histograma y el eje X a EpCAM humano. Utilice la herramienta de selección de rango para hacer clic en el final del histograma y seleccionar el espacio vacío hasta el final del gráfico. Esto representa la población EpCAM positiva. Repita el procedimiento para la tinción de CD10 humana.
  15. Arrastre la activación de isotipos debajo del espacio de trabajo de anticuerpos. Se aislarán las células CD45 positivas y se seleccionarán las poblaciones EpCAM positivas y CD10 positivas.
  16. Para crear histogramas representativos, seleccione Editor de diseño. Arrastre los histogramas deseados a la página de diseño. Para comparar la tinción de isotipos y anticuerpos, superponga el histograma de isotipos con el histograma de anticuerpos. Cierre las celdas positivas en función del control de isotipo.

6. Inmunocitoquímica

  1. Las células de cultivo después del paso final de aislamiento en la cámara deseada se deslizan hasta que confluyan.
  2. Para fijar las células, agregue 500 μL de paraformaldehído (PFA) frío al 4% Incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
  3. Aspire el PFA al 4% y lave 3 veces con 1x PBS.
  4. Para permeabilizar las células, añadir al menos 200 μL de Triton-X al 0,25% en PBS e incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
  5. Durante la permeabilización, prepare el tampón de bloqueo (4% de suero de cabra normal [NGS] para anticuerpos no producidos en cabra).
  6. Aspire el Triton-X al 0,25% y lave 3 veces con 1x PBS.
  7. Añadir al menos 200 μL de tampón de bloqueo (4% de NGS en PBS). Bloquear durante 1 h a temperatura ambiente.
  8. Prepare diluciones de anticuerpos primarios en NGS al 1% en 1x PBS de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
  9. Después del bloqueo, agregue al menos 200 μL de la solución de anticuerpo primario. Incubar a temperatura ambiente durante 2 h.
    NOTA: Algunos anticuerpos primarios pueden preferir una incubación nocturna de 4 °C; Consultar ficha técnica de anticuerpos.
  10. Prepare soluciones de anticuerpos secundarios en NGS al 1% en PBS 1x. Envuelva los tubos en papel de aluminio y prepare las soluciones en la oscuridad, ya que los anticuerpos secundarios son sensibles a la luz. Almacene en la oscuridad hasta que esté listo.
  11. Después de la incubación primaria de anticuerpos, lavar 3 veces con 1x PBS.
  12. Añadir al menos 200 μL de la solución de anticuerpos secundarios. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1 h.
    NOTA: Durante los siguientes pasos, intente mantener la diapositiva en la oscuridad tanto como sea posible.
  13. Después de la incubación secundaria de anticuerpos, lavar 3 veces con 1x PBS.
  14. Retire las cámaras, ya sea simplemente retirándolas a mano o usando la herramienta que viene con las correderas. Siga las instrucciones impresas en el empaque de la corredera de la cámara para su extracción.
  15. Agregue una gota de suero de montaje 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y coloque un cubreobjetos en la parte superior. Limite el número de burbujas y asegúrese de que todas las celdas estén cubiertas. Paso opcional: use esmalte de uñas alrededor de los bordes para sellar el cubreobjetos.
  16. Coloque el portaobjetos plano en una caja de portaobjetos para que se seque y colóquelo a 4 °C hasta obtener la imagen.
  17. Imagen en un microscopio equipado con fluorescencia correcta basada en la conjugación secundaria de anticuerpos para garantizar una imagen limpia.

Resultados

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Hemos incluido siete colecciones de trompas de Falopio en las que hemos aislado una población de células epiteliales enriquecidas (Figura 2A y Figura Suplementaria S1A). Para evaluar la viabilidad y el enriquecimiento de células epiteliales de este método de suspensión unicelular, se realizó citometría de flujo. Para medir la viabilidad celular, las células se tiñeron con el marcador de viabilidad, e506. Esto también permitió eliminar todos los desechos y células muertas cuando se analizaron.

Para determinar la composición de las células aisladas mediante este método, las muestras se tiñeron con un marcador de células epiteliales (EpCAM), un marcador de células estromales (CD10) y un marcador de células inmunitarias (CD45). Como se observa en la Figura 2B, aislamos una población de células epiteliales viables y enriquecidas a partir de tejido de trompa de Falopio. La viabilidad de la muestra se situó en un promedio del 82%. Para todas las muestras, después de eliminar las células CD45 positivas, observamos una población de células epiteliales enriquecidas con células EpCAM positivas con un promedio del 80% de la muestra. Hubo algo de contaminación de células estromalas, pero solo un 7,8% en promedio. La Figura 2C muestra células aisladas en 2D 4-6 días después de la siembra. Es evidente que las células epiteliales fueron aisladas a medida que formaban grupos adherentes consistentes con aspecto de adoquín. En la figura suplementaria S1B, las células se sembraron después del aislamiento y se cultivaron durante 2-6 días. Se utilizó inmunocitoquímica para caracterizar las células que crecían en cultivo. La mayoría de las células del cultivo dieron positivo para EpCAM y para el marcador de células secretoras, PAX8. Solo unas pocas células se identificaron como vimentina positiva. Las células ciliadas se observaron en cultivo como se captura en video, como se muestra en el Video Suplementario S1.

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Figura 1: Esquema experimental. (A) Se adquieren trompas de Falopio. (B) Se elimina el exceso de grasa y tejido conectivo. (C) Los tubos se cortan en trozos de ~ 3-5 mm. (D) Las piezas se lavan en PBS, luego se incuban en EDTA 2x durante 5 min y se incuban en tripsina al 1% durante 40 min a 4 °C. (E) Usando dos pares de pinzas, una para sostener y otra para empujar, expulsar las células epiteliales de las piezas de la trompa de Falopio. (F) Transfiera las células a un tubo de 15 ml, centrifugue y cuente. (G) Resuspender en DMEM, colagenasa y DNasa. Digiere durante 30-45 min. (H) Colar con un colador de 100 μm. (I) Cosecha por centrifugación y recuento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Caracterización de células epiteliales aisladas. (A) Tabla de información clínica del paciente y resultados de citometría de flujo. (B) Se realizó citometría de flujo después del aislamiento para mostrar que se había aislado una población enriquecida de células epiteliales (EpCAM positivas). El control negativo del isotipo se indica en negro y el resultado experimental se indica en rosa. (C) Las células se sembraron después del aislamiento. Las fotos se tomaron de 4 a 6 días después del enchapado. Barras de escala = 100 μm. Abreviaturas: AUB = Sangrado uterino anormal; EIN = Neoplasia intraepitelial endometrial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria S1: Caracterización adicional de células epiteliales aisladas en cultivo. (A) Tabla de información clínica del paciente. (B) Las células aisladas se cultivaron y se tiñeron para EpCAM, un marcador de células secretoras (PAX8) y un marcador de células estromales (Vimentin) 2-6 días después de la siembra para caracterizar el tipo de célula en cultivo. Barras de escala = 50 μm. Abreviaturas: EIN: Neoplasia intraepitelial endometrial; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Video Suplementario S1: Se tomó un video de las células ciliadas golpeando con un aumento de 30x para demostrar las células ciliadas en cultivo. Haga clic aquí para descargar este video.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Existe un interés considerable en el estudio del epitelio de las trompas de Falopio, ya que las trompas de Falopio desempeñan un papel importante en la reproducción y son el sitio de origen de la mayoría de los HGSOC. Con ese fin, muchos investigadores han descrito protocolos para aislar células de trompas de Falopio en modelos humanos y de ratón 10,11,12,15,16,17,18,19,20,21. El método que describimos para extraer y enriquecer las células epiteliales de las trompas de Falopio se suma a los protocolos de aislamiento de células de trompas de Falopio existentes. Aunque existen superposiciones dentro de estos protocolos, hay dos tipos generales de métodos reportados en ratones y humanos. La primera consiste en picar y digerir enzimáticamente toda la trompa de Falopio que da una suspensión celular total 10,12,15,16,17. El segundo consiste en el desprendimiento con agitación o raspado, lo que da como resultado láminas de tejido 11,18,19,20,21. Ambos métodos permiten analizar las células epiteliales a través de experimentos posteriores como la citometría de flujo, la secuenciación y el cultivo in vitro. Una ventaja importante de nuestro método es que el protocolo produce una población de células de trompas de Falopio que ya están enriquecidas para células epiteliales a través de la digestión enzimática y pasos de empuje mecánico. Esta población enriquecida para los epitelios se puede digerir aún más, lo que da como resultado una suspensión unicelular que se puede utilizar para muchas aplicaciones, como la citometría de flujo, el cultivo 2D, la inmunocitoquímica y la secuenciación de ARN de una sola célula.

Los pasos clave que encontramos para afectar la producción celular incluyen la duración durante la cual los fragmentos de trompas de Falopio se incuban en tripsina/HBSS y DMEM/DNasa al 1%. La sobreincubación en cualquiera de las soluciones degradará las células y disminuirá significativamente la viabilidad de las mismas. Sin embargo, un tiempo de incubación insuficiente inhibirá la capacidad del investigador para expulsar muchas células epiteliales durante el paso 2.6 del protocolo, ya que continuarán adhiriéndose entre sí. También es importante utilizar una solución de tripsina al 1%, ya que tanto las concentraciones más bajas como las más altas de soluciones de tripsina redujeron la producción de células epiteliales viables de las trompas de Falopio. Al combinar el aislamiento químico y mecánico y una etapa de digestión (paso del protocolo 3.1), podemos acortar exponencialmente el período que se tarda en pasar de la suspensión tisular a la unicelular. Esto garantiza una buena viabilidad y tiempo para realizar análisis posteriores el mismo día.

En el paso 1.4 del protocolo, es fundamental asegurarse de que las piezas de corte de la trompa de Falopio tengan un grosor de 3 a 5 mm. Si las piezas son demasiado grandes, será difícil realizar el paso 2.7 del protocolo y, en última instancia, disminuir el rendimiento celular, ya que será necesario un tiempo de incubación más largo en DMEM/DNasa.

Aunque la suspensión celular está enriquecida para las células epiteliales, la contaminación de las células estromales es inevitable. Si la preparación debe ser puramente de células epiteliales, se puede realizar una clasificación mediante citometría de flujo y los marcadores que describimos para aislar las células epiteliales y depletar las células estromales.

En este estudio se utilizaron trompas de Falopio posmenopáusicas. Sin embargo, este método se ha utilizado con éxito en nuestro laboratorio en trompas de Falopio premenopáusicas. La principal diferencia entre las trompas de Falopio premenopáusicas y postmenopáusicas es la composición de las células epiteliales ciliadas y secretoras1. Este protocolo funciona para todas las etapas reproductivas.

Este protocolo eficiente facilitará la investigación de los tipos de células del epitelio de las trompas de Falopio, incluida la delineación de linajes celulares, sus cambios dinámicos durante los ciclos reproductivos, así como después de la menopausia, y su papel en el inicio del cáncer de ovario seroso de alto grado.

Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores Ruegg L, James-Allan LB y DiBernardo G cuentan con el apoyo parcial de los proyectos de la Asociación de Veteranos del Área Metropolitana de Los Ángeles 1I01BX006019-01A2 y I01BX006411-01 a Memarzadeh S. El autor Ochoa C cuenta con el apoyo de UCLA Eli y Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research Rose Hills Foundation Graduate Scholarship Training Program. Queremos agradecer al Laboratorio Central de Patología Traslacional de UCLA y específicamente a Ko Kiehle y Chloe Yin por su asistencia en la obtención de tejidos. También queremos agradecer a Ken Yamauchi y al núcleo de microscopía del BSCRC por su ayuda en la obtención de imágenes. La Figura 1 se creó con BioRender.com (número de acuerdo JL27QWDYNT). Por último, nos gustaría agradecer a Felicia Cordea y al núcleo de citometría de flujo del BSCRC por su ayuda en la citometría de flujo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1% de tripsinaThermo Scientific J63993.09
100 µ m Filtro celularCorning431752
4% ParaformaldehídoCiencias de la microscopía electrónica15710-S
5 mL tubos de fondo redondo Corning352008
placa de cultivo celular de 60 mmCorning CLS430589-500EA
Corning353046
Anti-CD10BioLegend312212
Anti-CD326 (Ep-CAM)BioLegend324218
Anti-CD45 BioLegend304026
Anti-EpCAMAbcamab223582
Anti-IgG2a PerCP BioLegend400250
Anti-PAX8Sigma-Aldrich363M-15
Anti-VimentinAgilent TechnologiesM072501-2
Thermo Scientific 154917PK
ColgenasaThermo Scientific 
DMEMThermo Scientific 10569-010
DNasa ISigma10104159001
EDTASigma3690
eFluor 506Invitrogen65-0866-14
FBSSigmaF2442
Pinzas de punta finaVWR102091-526Cualquier pinza de punta fina de su elección funcionará
Tinte de viabilidad fijable eFluor 506Invitrogen65-0866-14
FlowJo versión de software 9 BD Biosciences Software de análisis dedatos
GlutaMAXGibco35050-061
HBSSThermo Scientific 14175-095
MACSConcitómetro de flujo Analizador de flujo 10 Miltenyi Biotec
MACSAlas de calibración de refrigeranteMiltenyi Biotec130-093-607
Mammocult Stemcell Technologies5620
Fisher ScientificPI31873
PBS Thermo Scientific 14190-144
Penicilina-EstreptomiocinaGibco15140-122
PerCP Conjugado CD45BioLegend304026
Tampón de lisis de glóbulos rojos Tonbo BiosciencesTNB-4300-L100 
Triton X-100Thermo Scientific BP151-100
Tijeras de resorte Vannas-Tubingen Herramientas de ciencia fina15003-08
VECTASHIELD con DAPIFisher ScientificNC9524612
Placa de cultivo celular de 6 pocillos Sistema de deslizamiento de cámara 17100017Suero de cabra normal

Referencias

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