Complemento Micro-Manager de código abierto para imágenes de visualización en vivo de dipolos fluorescentes

Summary

Desarrollamos un complemento Micro-Manager de código abierto, que permite la observación en vivo de dipolos fluorescentes en un microscopio de iluminación estructurada. El plugin admite la observación de la orientación del dipolo 2D y 3D.

Abstract

La microscopía de polarización de fluorescencia (FPM) puede obtener imágenes de la posición y la orientación del dipolo de los fluoróforos. A pesar de los logros de la microscopía de polarización de fluorescencia de superresolución, su dependencia de la posterior adquisición dificulta la observación en tiempo real. La microscopía de iluminación estructurada polarizada (pSIM) ofrece imágenes de súper resolución de dipolos fluorescentes con una velocidad de imagen rápida y es adecuada para aplicaciones de células vivas. Desarrollamos una implementación de código abierto para la reconstrucción en tiempo real de imágenes de polarización y visualización de los dipolos fluorescentes. Además, ampliamos el método para lograr el mapeo de orientación 3D (3DOM), ampliando su utilidad para estudios biológicos complejos. Además, hemos presentado una introducción completa a la extensión de un microscopio SIM existente en imágenes de polarización y hemos proporcionado una guía de configuración detallada de Micro-Manager 2.0 para controlar el microscopio, lo que permite una vista previa en tiempo real de las imágenes polarizadas. Además, hemos proporcionado el código de MATLAB para la reconstrucción completa que abarca tanto pSIM como 3DOM. Esta guía completa tiene como objetivo ayudar a los principiantes a dominar rápidamente y comenzar fácilmente con las operaciones.

Introduction

La microscopía de polarización de fluorescencia (FPM) se ha convertido en una técnica potente para obtener imágenes simultáneas de la posición y la orientación dipolar de los fluoróforos, ofreciendo una visión profunda de las imágenes biológicas ^1,2. Al facilitar la observación de la dirección de las orientaciones de las biomoléculas, FPM revela la intrincada disposición de macromoléculas como la actina ^3,4,5, el microtúbulo⁵, la septina⁶

Protocol

1. Ampliación de un microscopio de iluminación estructurada existente para la obtención de imágenes de polarización

1. Prepara un microscopio SIM.
   NOTA: Suponemos que los lectores tienen una cierta base en la configuración del microscopio y ya poseen un microscopio de luz estructurada. Si carece de experiencia relevante, consulte este documento, que proporciona una descripción detallada de cómo construir un microscopio SIM¹⁶. La unidad de control de polarización de "HWP+WQP+LCVR" puede ser sustituida por una placa de onda de vórtice de pizza en nuestro pSIM work⁵

Results

El método pSIM se puede realizar en microscopios SIM en función de la interferencia utilizando rayos láser polarizados s. La interferencia de polarización s es el tipo de SIM más utilizado y genera franjas de iluminación de alto contraste. El prototipo académico de una configuración de microscopio está incluido en el trabajo original de pSIM⁵. Brevemente presentado en la Figura 1, un modulador de luz espacial (SLM) genera el orden ±1 d.......

Discussion

En nuestro estudio, desarrollamos un complemento que permite la vista previa en tiempo real de dos técnicas de imagen de polarización, pSIM y 3DOM. Ambas tecnologías se pueden realizar en un sistema SIM existente con ligeras modificaciones. Hemos proporcionado los pasos detallados para instalar el microscopio pSIM y 3DOM y configurar Micro-Manager para controlar el microscopio y demostrar cómo obtener los resultados de polarización de vista en vivo. Los resultados experimentales incluyen.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 nm Perlas fluorescentes	Invitrogen	F8801
4% Solución de formaldehído	Invitrogen	R37814
Cámara	Tucsen	Dhyana 400BSI V3	https://www.tucsen.com/download-software/
Materiales base para dentaduras postizas (Tipo I Tipo de fraguado térmico, líquido)	New Century Dental	N/A
Dulbecco' s Águila Modificada' s Medio	Gibco	C11995500BT
Eclipse TE2000 Microscopio invertido	Nikon	TE2000 E
Suero fetal bovino	Gibco	10099141C
MATLAB R2019b	MathWorks	Versión R2019b	https://ww2.mathworks.cn/downloads/
MetroCon V4.0	Kopin	Versión 4.0	Software de modulador
de luz espacialMicro-Manager 2.0	μ Μ anager	Versión 2.0	Descargar Micro-Manager Última versión
MS-2000 XYZ Automated Stage	Applied Scientific Instrumentation	MIM3	https://www.asiimaging.com/support/downloads/usb-support-on-ms-2000-wk-controllers/
myDAQ	National Instruments	781325-01	Descargas de software y controladores - NI
OBIS 561 nm LS 20 mW Laser	Coherent	1325777
Phalloidin-AF568	Invitrogen	A12380
Solución salina tamponada con fosfato	Corning	21-040-CV
Poli Metilmetacrilato	Solarbio	M9810
ProLong Diamond	Invitrogen	P36980
Modulador de luz espacial	Kopin	SXGA-12
SYTOX tinción	de ácido nucleico de naranjaInvitrogen	S11368
Triton X-100	Invitrogen	HFH10
Tripsina	Gibco	25200056
λ-DNA	Invitrogen	S11368