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Artículo de método

Un método QuEChERS-HPLC modificado para la detección de hidrocarburos aromáticos policíclicos en embriones de pez cebra expuestos a partículas finas

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DOI:

10.3791/67757

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13 de junio de 2025

 ,  ,  ,  , 
1Suzhou Industrial Park Center for Disease Control and Prevention, 2Suzhou Medical College of Soochow University, 3MOE Education Key Laboratory of Geriatric Diseases and Immunology

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Desarrollamos un método QuEChERS-HPLC modificado para evaluar los niveles internos de 16 HAPs en embriones de pez cebra.

Resumen

La exposición materna a partículas finas (PM2,5), con un diámetro aerodinámico de 2,5 μm o menos, se ha relacionado con el aborto espontáneo y diversas enfermedades congénitas en humanos. Sin embargo, los mecanismos subyacentes siguen sin estar claros. Los embriones de pez cebra se utilizan ampliamente para estudiar la toxicidad del desarrollo de las PM2,5 , pero la medición de los niveles internos de hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP), los principales constituyentes tóxicos de las PM2,5, plantea un desafío. En este estudio, desarrollamos un método de cromatografía líquida de alto rendimiento rápido, fácil, barato, eficaz, resistente y seguro (QuEChERS-HPLC) para evaluar los niveles internos de los 16 HAP enumerados en la lista de contaminantes prioritarios de la Agencia de Protección Ambiental (EPA) de EE. UU. Los embriones de pez cebra fueron tratados con materia orgánica extraíble (MOE) de PM2.5 durante 2-72 h post fertilización (hpf). Para la preparación de las muestras se empleó el método QuEChERS, y para los análisis cualitativos y cuantitativos de los HAP se empleó HPLC-FLD/DAD (HPLC con detector de fluorescencia y detector de matriz de diodos). Detectamos con éxito seis HAPs (Fenantreno, Antraceno, Flúor, Acenafteno, Fluoranteno y Pirineo) en embriones de pez cebra expuestos a PM2.5. Este método es crucial para investigar los mecanismos de la toxicidad en el desarrollo inducida por PM2.5.

Introducción

Partículas finas (PM2,5), con un diámetro aerodinámico de 2,5 μm o menos. es uno de los principales factores de riesgo ambiental. Debido a su pequeño tamaño, las PM2,5 son capaces de entrar en el sistema circulatorio e impregnar la barrera materno-fetal. Los estudios epidemiológicos han relacionado la exposición materna a PM2,5 con el aborto espontáneo y diversas enfermedades congénitas 1,2,3,4. Sin embargo, los mecanismos subyacentes de la toxicidad embrionaria de PM2.5 no se conocen bien. Los HAP, el principal componente tóxico de las PM2,5, son altamente tóxicos para el ser humano debido a sus propiedades mutagénicas y cancerígenas 5,6. Entre los cientos de HAP, 16 han sido asignados como contaminantes de alta prioridad por la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (EPA).

El pez cebra, Danio rerio, es un poderoso organismo modelo de vertebrado debido a su similitud genética con los humanos, su rápido desarrollo, su alta tasa reproductiva y su fácil mantenimiento. La transparencia de los embriones de pez cebra permite la observación directa de todo el cuerpo bajo un microscopio, lo que permite estudios detallados. Los HAP disueltos pueden entrar en los embriones de pez cebra por difusión7. Muchos estudios han utilizado embriones de pez cebra para explorar los efectos tóxicos y los mecanismos de la materia orgánica extraíble (MOE) de PM2.5 8,9,10,11. Sin embargo, la mayoría de estos estudios solo han caracterizado los 16 HAPs prioritarios en EOM, sin detectar los niveles internos de HAPs en embriones de pez cebra12. Este desafío puede deberse al pequeño tamaño de los embriones de pez cebra y a la complejidad de la matriz embrionaria.

El método Rápido, Fácil, Barato, Efectivo, Robusto y Seguro (QuEChERS) es una técnica innovadora de preparación de muestras utilizada para el análisis de residuos de plaguicidas, medicamentos veterinarios y otros contaminantes en muestras de alimentos y medio ambiente13,14. Cuando se combina con la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), este método se ha utilizado para detectar pesticidas en el pez cebra15. Los HAP, que contienen dos o más anillos de benceno, tienen fuertes propiedades de fluorescencia, lo que los hace especialmente adecuados para la detección mediante detectores de fluorescencia. En este estudio, desarrollamos un método QuEChERS-HPLC modificado para evaluar los niveles de 16 HAPs en embriones de pez cebra expuestos a EOM.

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Protocolo

1. Tratamiento de la muestra

  1. Colección PM2.5
    1. Recoja PM2.5 en filtros de membrana de cuarzo de 47 mm.
      NOTA: PM2.5 se recolectó en la zona urbana de Suzhou, China.
  2. Extracción de EOM
    1. Cortar el filtro en trozos y colocar en un matraz de vidrio cónico con 150 mL de acetonitrilo.
    2. Ultrasónica el matraz a 35 °C durante 1 h y transferir el extracto a cuatro tubos de 50 mL.
    3. Centrifugar a 7.000 × g durante 20 min, luego transferir el sobrenadante a un evaporador rotativo y concentrarlo en aproximadamente 5 mL.
    4. Evaporar hasta la sequedad bajo flujo de nitrógeno en un baño de agua a 35 °C y disolver el residuo en dimetilsulfóxido (DMSO).
  3. Tratamiento con embriones de pez cebra
    1. Mantenga el pez cebra en un sistema de recirculación de agua en un ciclo de 14 h de luz y 10 h de oscuridad a 28 °C16.
    2. Recoger los óvulos fecundados (200 embriones por grupo) y transferirlos a placas de Petri de vidrio (vidrio sodocálcico, 80 x 15 mm) con 30 mL de agua del sistema de recirculación de agua.
    3. Añadir 30 μL de EOM (10 mg/mL) a una placa de Petri de vidrio que contenga 200 embriones a las 2 h después de la fecundación (hpf). Los grupos no tratados sirven como controles en blanco.
      NOTA: La concentración final de EOM es de 10 mg/L, basada en la tasa de malformación cardíaca (Figura suplementaria S1).
    4. Coloque los platos en una incubadora a 28 °C.

2. Preparación de muestras QuEChERS

  1. Retire las placas con embriones a 72 hpf de la incubadora. Lavar los embriones 3 veces con agua pura.
  2. Transfiera los embriones a tubos de 1,5 mL (según diferentes grupos) y elimine el exceso de agua.
  3. Coloque los tubos en un congelador a -80 °C durante 30 minutos para liofilizar los embyros17 y liofilizarlos. Luego, muele los embriones con una varilla de vidrio.
  4. Añada 25 μL de solución estándar mixta de 16 HAP (2,0 μg/mL) al grupo de control DMSO para probar la recuperación de la espiga.
  5. Añadir 1 mL de n-hexano y vórtice durante 30 s, luego ultrasicular a 35 °C durante 30 min.
  6. Centrifugar a 7.000 × g durante 5 min y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo.
  7. Repita los pasos 2.5 y 2.6.
  8. Evapore los sobrenadantes recolectados hasta que se sequen bajo flujo de nitrógeno en un baño de agua a 35 °C.
  9. Añadir 1 mL de acetonitrilo y vórtice durante 30 s.
  10. Agregue 10 mg de amina secundaria primaria (PSA), 45 mg de sulfato de magnesio y 15 mg de empaquetamiento de C18, luego vórtice durante 30 s.
  11. Centrifugar a 7.000 × g durante 5 min y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo.
  12. Repita el paso 2.9 y centrifugue a 7.000 × g durante 5 min. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo.
  13. Evapore el sobrenadante a 0,5 mL bajo nitrógeno.
  14. Filtrar a través de una membrana microporosa de 0,22 μm.

3. Determinación de HAPs mediante HPLC

  1. Preparar una serie de soluciones de trabajo (que van de 1 a 500 ng/mL) para el patrón mixto de 16 HAP con acetonitrilo e inyectarlas en un cromatógrafo de líquidos utilizando acetonitrilo/agua como fase móvil.
    1. Inyectar 20 μL y utilizar el siguiente procedimiento de elución: 0-18,5 min, 40% de acetonitrilo a 100% de acetonitrilo; 18,5-28 min, 100% acetonitrilo; 28-29,5 min, 100% a 40% acetonitrilo; tiempo de parada: 32 min; temperatura de la columna: 25 °C; caudal: 1,8 mL/min. Traza una curva estándar con concentraciones de masa de las soluciones de trabajo estándar en el eje x y las áreas de pico correspondientes en el eje y, cubriendo un rango de 5 ng/mL a 500 ng/mL.
      NOTA: Las longitudes de onda de excitación/emisión de los HAP se pueden encontrar en la Tabla Suplementaria S1.
  2. Inyecte la muestra purificada (del paso 2.14) en el cromatógrafo de líquidos con un detector de fluorescencia (FLD) y un detector de matriz de diodos (DAD).
  3. Identifique la presencia de HAP comparando los tiempos de retención y mida las áreas de pico asociadas.
    NOTA: Las concentraciones másicas de los HAP se determinaron utilizando la curva estándar generada previamente en el paso 3.1.1.
  4. Calcule las concentraciones internas de los 16 HAP en función de las concentraciones de masa medidas de las muestras.

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Resultados

En la Figura 1 se ilustra todo el procedimiento para la exposición a EOM, la preparación de la muestra y la detección de HAP. Para HPLC-FLU/DAD, se consideró aceptable una relación señal-ruido de 3:1, con un rango de detección de 0,3 a 5,0 ng/mL. Los límites del método de detección oscilaron entre 3,0 × 10-4 y 5,0 × 10-3 ng/organismo. Todas las curvas de calibración mostraron una alta linealidad (r2 > 0,999). Los valores de precisión determinados utilizand...

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Discusión

Los embriones de pez cebra son un poderoso modelo de vertebrados para estudios de toxicidad en el desarrollo, pero su pequeño tamaño complica la detección de compuestos orgánicos semivolátiles (SVOC) como los HAP. Durante la preparación de la muestra, es crucial evitar la contaminación de los embriones de pez cebra. La limpieza adecuada de las muestras es un paso clave para evitar el arrastre de compuestos del medio de exposición al extracto de la muestra. El lavado incompleto puede llev...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado financieramente por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (número de subvención: 81972999) y el Plan de Desarrollo Científico y Tecnológico de Suzhou (Investigación Básica sobre Aplicaciones Médicas, SKY2023036 y SKY2023115).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
16 soluciones estándar mixtas de HAP o2si Smart Solutions (Carolina del Sur, EE. UU.)110124-0616 PAHs soluciones estándar mixtas  incluye naftaleno (Nap), acenaftileno (Acy), ace-nafteno (Ace), fluoreno (Flo), fenantreno (Phe), antraceno (Ant), fluoranteno (Flu), pireno (Pyr), benzo [a] antraceno (BaA), criseno (Chr), benzo [b] fluoranteno (BbF), benzo [k] fluoranteno (BkF), benzo [a] pireno (BaP), indeno [1,2,3-cd] pireno (IcdP), dibenz [a, h]antraceno (DahA), benzo [g,h,i] perileno (BghiP).
1260 Infinity II LC SystemAgilent Technologies (Santa Clara, EE. UU.)FLD (G1321A); DAD SL (G1315C)
AcetonitriloScharlab (Barcelona, España)AC03661000disolvente
CNWBOND HC-C18 SPE ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc. (Shanghai, CHINA)El empaque SBEQ-CA0801C18 es un empaque de fase inversa con un buen equilibrio entre hidrófilo e hidrofóbico, que puede adsorber y separar bien los compuestos orgánicos polares y no polares.
Tierra de diatomeasAgilent Technologies, Inc (Santa Clara, EE. UU.)12214013Para la separación, purificación y eliminación de impurezas orgánicas‌
Dispersivo SPE 15 mL, ENAgilent Technologies, Inc (Santa Clara, EE. UU.)5982-5056Filtro de purificación de muestras
ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc. (Shanghai, CHINA)SCAA-104 Filtro deaguja de fase orgánica (nylon), 0.22 µ m
HexaneScharlab (Barcelona, España)HE02481000disolvente
MilliporeMerck (Nueva Jersey, EE. UU.)Preparación de agua ultrapura
Organomación - Evaporadores de nitrógeno N-EVAPOrganomación (Massachusetts, EE. UU)Disolventes de evaporación
Sorvall ST4 PlusThermo Fisher Scientific (Waltham, EE. UU)centrifugación
  Vortex- Genie 2 (G560E)Scientific Industries (Nueva York, EE. UU.)Vortex
ZORBAX Eclipse PAHAgilent Technologies, Inc (Santa Clara, EE. UU.)959990-918Esta columna se usa comúnmente en sistemas HPLC para lograr un análisis preciso y confiable de HAP.

Referencias

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