Method Article

Método de alto rendimiento para observar fenotipos de motilidad en Pseudomonas aeruginosa

DOI:

10.3791/67761

⸱

June 20th, 2025

 , 
1Département de biologie, Faculté des sciences, Université de Sherbrooke

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo presenta un método rápido y eficiente para identificar los factores genéticos involucrados en varios tipos de motilidades en Pseudomonas aeruginosa.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los comportamientos de motilidad a menudo juegan un papel importante en la capacidad de una bacteria para explotar los recursos disponibles en su entorno. Esto es particularmente cierto para el patógeno versátil Pseudomonas aeruginosa, que puede exhibir diversos tipos de motilidades, incluyendo enjambre y espasmos, que son rasgos patógenos importantes que contribuyen a la colonización de la superficie, la formación de biopelículas y la evasión de las defensas del huésped. Este manuscrito presenta un protocolo de motilidad de alto rendimiento para estudiar los comportamientos de motilidad de P. aeruginosa. El protocolo permite, por ejemplo, realizar pruebas simultáneas de múltiples cepas de P. aeruginosa a partir de una biblioteca de mutantes de todo el genoma, para identificar y analizar los factores genéticos implicados en su motilidad. El enfoque ofrece la posibilidad de estudiar la motilidad de manera integral y conocer los mecanismos moleculares que subyacen a la motilidad de P. aeruginosa . El protocolo descrito aquí también puede modificarse para adaptarse a diferentes tipos de ensayos de motilidad, así como a otras especies bacterianas, proporcionando así una poderosa plataforma para avanzar en la comprensión del comportamiento bacteriano en diversos contextos.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pseudomonas aeruginosa es un patógeno oportunista que puede colonizar diversos ambientes debido a su notable versatilidad metabólica 1,2. Esta versatilidad es crucial para la transición de un modo de crecimiento planctónico a biopelículas, lo que contribuye a su capacidad para prosperar en una amplia gama de nichos que van desde el agua hasta el cuerpo humano 3,4,5. La transición entre estos modos de crecimiento se ve favorecida por una amplia capacidad para moverse a través de estos entornos utilizando varios tipos de motilidad, incluyendo la natación, el enjambre y los espasmos 1,6. Cada tipo de motilidad está mediada por distintos mecanismos y estructuras celulares y permite a P. aeruginosa responder a las señales ambientales 7,8. La motilidad natatoria es impulsada por un solo flagelo polar y se utiliza para moverse a través de medios líquidos hacia los nutrientes, por ejemplo9. La motilidad del enjambre es un movimiento coordinado facilitado por la producción de flagelos y biosurfactantes y permite que las colonias se extiendan a través de superficies semisólidas10,11. Por último, la motilidad espasmódica es independiente de los flagelos. En cambio, los espasmos están mediados por pili tipo IV (T4P) y se utilizan para moverse sobre superficies12,13. La motilidad espasmódica también contribuye a los primeros pasos de la formación de biopelículas de P. aeruginosa al proporcionar una adhesión inicial a la superficie. Después de la unión inicial, los espasmos permiten que las bacterias se muevan a través de las superficies y creen microcolonias, que luego pueden convertirse en biopelículas maduras 1,4,13.

Tradicionalmente, los ensayos de motilidad bacteriana se realizan individualmente, una cepa a la vez, en una placa de agar blanda o utilizando métodos de microscopía 6,14,15. Los medios semisólidos se han utilizado durante muchos años en el estudio de la motilidad bacteriana. Hoy en día, estas técnicas se siguen utilizando para identificar los fenotipos de motilidad en las bacterias. Por ejemplo, tradicionalmente, la motilidad del enjambre se observa inoculando 2,5 μL de un cultivo de P. aeruginosa en el centro de una placa de Petri que contiene medios M9 a una concentración de agar de 0,5%-0,8%16. La motilidad de los espasmos se mide generalmente observando la propagación de las bacterias en la superficie de la interfaz entre el agar (al 1%) y la base de una placa de Petri después de que una puñalada inocula P. aeruginosa a través de los medios de cultivo. A las 48 h de incubación se obtiene un gran halo de expansión de colonias intersticiales, mientras que las cepas no espasmódicas no producen dicha zona de expansión de colonias 1,17,18.

Más recientemente, los enfoques de mutagénesis por transposones han descubierto nuevos genes implicados en la motilidad o formación de biopelículas en P. aeruginosa 19,20,21. Por ejemplo, se encontraron nuevos genes implicados en la motilidad de los espasmos utilizando una biblioteca de mutantes de transposones de alta densidad en P. aeruginosa19. Otra herramienta útil en genómica funcional es el uso de colecciones ordenadas de mutantes22,23. La colecciónKeio 24, que contiene deleciones de un solo gen para todos los genes no esenciales en Escherichia coli, es probablemente la colección más conocida de mutantes y se ha utilizado para definir genes que afectan a varios fenotipos, desde el crecimiento en diferentes medios25 hasta la morfología celular26 y más. Tales colecciones también están disponibles para Salmonella enterica serovar, Typhimurium27, Bacillus subtilis28, P. aeruginosa29, así como muchas otras especies. Estas colecciones también son adecuadas para estudiar la motilidad en todo el genoma, lo que lleva al desarrollo de un método de alto rendimiento para estudiar la motilidad de P. aeruginosa. Aquí, el método se ha probado evaluando la contribución de los mutantes de P. aeruginosa a la motilidad tanto de espasmos como de enjambre en placas de alta densidad. Este método de alto rendimiento se puede utilizar para varios fenotipos de motilidad y también es adecuado para estudiar la motilidad de otras bacterias.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: El flujo de trabajo general de este procedimiento se describe en la Figura 1.

figure-protocol-1
Figura 1: Flujo de trabajo experimental. (1) Prepare la cantidad necesaria de medios de motilidad en función del tipo de motilidad de interés en los experimentos. (2) Utilizando un sistema de replicación manual o automatizado, prepare las placas madre para la biblioteca de mutantes de inserción de transposones de P. aeruginosa de la colección mutante a la densidad adecuada, haciendo hincapié en la inoculación precisa y uniforme en todos los pocillos de las placas. (3) Transfiera muestras de las placas de origen de la colección de mutantes a las placas de motilidad. (4) Después de la incubación, observar y analizar los fenotipos de motilidad e identificar los genes implicados en la motilidad de interés utilizando imágenes de alta calidad. (5) Realizar ensayos de motilidad tradicionales para validar los resultados identificados a través de experimentos de motilidad de alto rendimiento. Creado con BioRender. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Placas de enjambre - Medios M9Placas de contracción - Medios LBPlacas de origen - Medios LB
200 mL de una solución de 5 sales M910 g de NaCl10 g de NaCl
10 mL de glucosa al 20%10 g de triptona10 g de triptona
25 mL de ácidos casamino5 g de extracto de levadura5 g de extracto de levadura
1 mL de 1M MgSO410 g de agar15 g de agar
500 mL de agar al 1%Añadir dH2O a 1LAñadir dH2O a 1L
Añadir dH2O a 1LGentamicina (concentración final 15 μg/mL)

Tabla 1: Composición de los medios para las distintas placas utilizadas en el ensayo.

1. Preparación de placas de medio de cultivo

NOTA: Consulte la Tabla de Materiales para preparar las soluciones de stock y las condiciones de almacenamiento. Las placas deben llenarse sobre una superficie nivelada. Al secar, las placas deben estar planas sobre la superficie (es decir, no apiladas). Esto asegura que el medio de cultivo en la placa se seque de manera uniforme. Cualquier placa uniwell con una huella típica puede funcionar, pero las placas con dimensiones internas más grandes (sin paredes interiores), como las placas Singer Instruments Plus o las placas de cultivo de tejidos no tratadas de un solo pocillo de VWR, facilitan el trabajo con una mayor densidad de colonias por placa.

  1. Prepare una cantidad adecuada de medios para los experimentos según la receta de la Tabla 1. Mantenga el medio a ~45 °C- 50 °C para evitar que el agar se solidifique.
    1. Para las placas de origen, prepare placas de 59 LB (caldo de lisogén) que contengan 1.5% de agar y 15 μg/mL de gentamicina, que se necesita para replicar la biblioteca completa de PA14: 59 x 25 mL =~ 1500 mL. Prepare otras 15 placas de agar LB al 1,5% y 15 μg/mL de gentamicina para ampliar la biblioteca en un formato de densidad de 384: 15 x 25 mL = ~400 mL.
    2. Placas de contracción: Si se trabaja en formato de densidad 96, prepare 59 placas de agitación (agar LB 1%). Prepare 15 placas de contracción si trabaja en formato de densidad 384.
    3. Placas de enjambre: Prepare 15 (formato de 384 densidades) o 59 (formato de 96 densidades) placas de enjambre (agar M9-glucosa 0,5%)
  2. Retire la tapa de un plato y vierta 25 ml de medio por plato. Distribuya el medio de manera uniforme a través de la placa levantando suavemente cada esquina de la placa una a la vez. Repite este movimiento de meneo 2x-3x. Vuelva a colocar la tapa en el plato.
  3. Deje que las placas se solidifiquen y se sequen a temperatura ambiente (RT) durante la noche. Si las placas no se utilizan inmediatamente, colóquelas en bolsas herméticas y guárdelas en un lugar seco. Se pueden almacenar durante 3 semanas.

2. Preparación de placas fuente de la biblioteca de transposones mutantes de P. aeruginosa

NOTA: Las placas fuente se refieren a las placas de LBA-gentamicina que contienen una copia de la biblioteca PA14 que se utilizan posteriormente para inocular las placas de motilidad. La biblioteca de mutantes de transposones de P. aeruginosa (biblioteca PA14) es un conjunto de 59 placas congeladas de 96 pocillos29. A continuación se describen los pasos para preparar las placas de origen para cada formato. Este protocolo es adaptable para laboratorios que no tienen acceso al replicador Rotor+. Los investigadores pueden realizar con éxito los mismos procedimientos experimentales utilizando replicadores manuales, como los replicadores de 96 pines accionados por resorte que se utilizan aquí para la replicación de las placas congeladas de la biblioteca PA14 durante el Día 1 (consulte la Tabla de Materiales) o cualquier otro replicador de 96 pines. Los replicadores manuales deben esterilizarse y dejarse enfriar entre cada uso.

  1. Día 1: Replicación de la biblioteca PA14 de las 59 placas congeladas de 96 pocillos en placas de origen
    1. Esterilice un replicador de 96 pines con resorte colocándolo en una placa calefactora a temperatura máxima durante 8 min. Después de la esterilización, deje que el replicador se enfríe lo suficiente (~ 10 min) para evitar matar las bacterias.
    2. Agarra una placa de origen. Con el replicador estéril de 96 pines, sumerja con cuidado los pines del replicador en una placa de 96 pocillos y, a continuación, transfiera las células directamente a la superficie de la placa fuente. Repita hasta que las 59 placas congeladas de 96 pocillos de la biblioteca PA14 se repliquen en las placas fuente.
    3. Incubar las placas fuente de densidad 96 a 37 °C durante 16-18 h.
      NOTA: Si se utiliza el método con un formato de densidad 96, estas placas fuente se pueden utilizar para inocular las placas de motilidad.
  2. Día 2: Escalado del formato de 96 a 384 densidades
    NOTA: El día 2 se puede omitir si se trabaja a una densidad de 96.
    1. Después de la incubación, deje las placas (planas sobre una superficie, no apiladas) a temperatura ambiente (~ 1 h) para que se enfríen. Si hay condensación en las tapas, elimine la condensación con una toallita delicada para evitar que caigan gotas de agua sobre las placas, lo que podría causar contaminación cruzada entre colonias.
    2. Configure el replicador con los siguientes parámetros para garantizar una transferencia de colonias precisa. Encienda el replicador. En la sección Seleccionar un modo de funcionamiento, seleccione Seleccionar y ejecutar programas almacenados.
    3. En la sección Seleccionar placas de origen, seleccione PlusPlate 96 Agar. En la sección Seleccionar placas objetivo, seleccione PlusPlate 384 Agar. En la sección Seleccionar pads, seleccione Pin corto 96.
    4. En la sección Opciones de programa de réplica, seleccione General y haga clic en Reciclar > Ninguno.
    5. En la sección Origen, seleccione Desplazamiento y haga clic en Radio aleatorio > predeterminado. En la sección Objetivo, seleccione Anclaje y ajuste la presión al 20%. Deje todas las demás configuraciones como predeterminadas.
    6. Inserte las almohadillas de pin corto 96 en el compartimento apropiado.
    7. Coloque las placas de origen y destino en la plataforma designada del replicador. Coloque las placas de origen de densidad 96 (placas 1, 2, 3 y 4) y la nueva placa de fuente vacía (placas LBA) en la plataforma. Usando los parámetros seleccionados, el robot de fijación de matrices microbianas transferirá colonias de las placas de densidad 96 a la nueva placa de densidad 384. Presione Ejecutar.
    8. Cambie todas las placas de la plataforma (las siguientes cuatro placas de origen de densidad 96 y una nueva placa de origen vacía) y repita hasta que todas las placas se hayan ampliado. Para el último juego de placas, use las placas 57, 58, 59 y 1. Cada placa de 384 densidades consistirá en colonias alternas de cuatro placas de 96 densidades (ver Figura 2). Incubar las placas LBA de densidad 384 a 37 °C durante 16-18 h.
      NOTA: Estas placas fuente de densidad 384 se pueden utilizar para inocular la placa de motilidad para realizar el protocolo a la densidad 384. En cualquier paso después de la incubación, las placas pueden almacenarse a 4 °C durante un máximo de 3 semanas.

figure-protocol-2
Figura 2: Aumento de escala de placas de 96 a 384 placas de densidad. Las colonias de cuatro placas fuente de densidad 96 se transfieren y se fusionan en una sola placa de densidad 384. Cada cuadrante de la placa de densidad 384 corresponde a una de las placas originales de 96 pocillos (rojo, azul, amarillo y verde), preservando la posición de cada mutante. Creado con BioRender. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Experimento de motilidad de alto rendimiento

NOTA: El protocolo se realizó aquí en formato de densidad 384, pero el mismo protocolo se puede adaptar a un formato de densidad 96 modificando los parámetros en el replicador para transferir de las placas de origen a las placas de motilidad utilizando la selección 96 en lugar de 384.

  1. Después de la incubación, deje las placas (planas sobre una superficie, no apiladas) a temperatura ambiente (~ 1 h) para que se enfríen. Si se produce condensación en las tapas, retírela con una toallita delicada para evitar que caigan gotas de agua sobre las placas, lo que podría causar contaminación cruzada entre colonias.
  2. Tome el número apropiado de placas (59 para un formato de densidad 96 o 15 para un formato de densidad 384) para el ensayo deseado: placas de agar M9-glucosa al 0,5% para enjambre, LB y placas de agar al 1% para espasmos.
  3. Configure el replicador con los siguientes parámetros para garantizar una transferencia de colonias precisa.
    1. Encienda el replicador. En la sección Seleccionar un modo de funcionamiento, seleccione Seleccionar y ejecutar programas almacenados. En la sección Seleccionar placas de origen, seleccione PlusPlate 384 Agar.
    2. En la sección Seleccionar placas objetivo, seleccione PlusPlate 384 Agar. En la sección Seleccionar pads, seleccione Pin corto 384. En la sección Opciones de programa de réplica, seleccione General > Reciclar > Ninguno.
    3. En Programas de Singer, seleccione Replicar muchos.
    4. En la sección Origen, seleccione Desplazamiento > Radio aleatorio > predeterminado. En la sección Objetivo, seleccione Anclaje y ajuste la presión al 2%. Deje todas las demás configuraciones como predeterminadas.
  4. Inserte las almohadillas de clavija corta 384 en el compartimento apropiado.
  5. Coloque las placas de origen y destino en la plataforma designada del replicador. Coloque las placas fuente de densidad 384 y las placas de motilidad vacías en la plataforma. Presione Ejecutar Con los parámetros seleccionados, el robot de fijación de matrices microbianas transferirá colonias de las placas fuente de 384 densidad a las placas de motilidad. Cada placa de densidad 384 consistirá en una copia de una placa fuente de densidad 384.
  6. Asegúrese de que la transferencia sea uniforme y de que todas las colonias estén debidamente fijadas en la superficie del agar de las placas de motilidad. Coloque las placas de motilidad inoculadas en bolsas de plástico. Coloque con cuidado las bolsas que contienen las placas en una incubadora a 37 °C durante 18 h.
    NOTA: Las placas se colocan en bolsas para mantener la humedad y evitar un secado desigual. Coloque las placas en la incubadora con las tapas hacia arriba.
  7. Después de la incubación, revise las placas de motilidad para ver si hay un crecimiento uniforme de la colonia y ausencia de contaminación.
  8. Día 3: Imágenes de las placas de motilidad
    NOTA: El PhenoBooth de Singer Instruments se utiliza para capturar imágenes de alta resolución de las placas de motilidad. Utiliza una cámara de grado científico y produce imágenes de 23 megapíxeles. Incluye cinco canales de iluminación para capturar imágenes de alta resolución de las colonias a partir de placas de Petri y placas rectangulares. Otros generadores de imágenes de alta calidad también funcionan.
    1. Después del período de incubación, las placas de motilidad están listas para el proceso de imagen. Encienda el Phenobooth y haga clic en el Icono correspondiente al software Phenobooth.
    2. Se abre una página Seleccionar proyecto; haga clic en Nuevo proyecto > Conteo de colonias. Elija la ruta de archivo deseada para almacenar las imágenes en el campo Ubicación. En el campo Resolución, elija 5626 x 4220. Haga clic en Aceptar, el dispositivo ya está listo para tomar fotografías.
    3. Inserte la placa en el lector con el lado medio hacia arriba después de quitar la tapa. Asegúrese de que la placa esté colocada correctamente antes de cerrar el lector para evitar atascar la placa.
    4. Establezca el parámetro en luz blanca en la pestaña Iluminación. Haga clic en Vista previa. Ajuste la configuración de exposición en la pestaña de configuración de PhenoBooth para obtener los parámetros óptimos para observar los fenotipos de motilidad.
    5. Haga clic en Adquirir; Las imágenes capturadas aparecerán en el lado izquierdo de la pantalla. Una vez finalizado, cierre el software (todas las imágenes capturadas se guardarán en el archivo elegido previamente en la pestaña Ubicación).
      NOTA: Phenobooth guarda las imágenes en formato JPEG, pero para los pasos de análisis posteriores, las imágenes pueden estar en formato TIFF, JPEG o PNG.

4. Análisis de los fenotipos de motilidad

NOTA: El análisis de la imagen se realiza como se describe en detalle en French et al.30,31. Un script para realizar análisis de datos está disponible en31 (ImageJ Macro).

  1. Brevemente, las imágenes se procesan en ImageJ32, que genera un valor para cada colonia en la placa de motilidad. En primer lugar, convierta las imágenes a formato de 8 bits y segmente las colonias y sus áreas de motilidad asociadas desde el fondo utilizando el comando threshold. Dibuje una región de interés (ROI) alrededor de cada colonia y mida el área de motilidad. Esto genera una tabla que contiene un valor de densidad integrado para cada pozo, organizado por filas. Esta tabla se puede guardar como un archivo CSV para su posterior análisis.
    1. Ejecute la macro en ImageJ y abra la carpeta que contiene las imágenes.
    2. Cuando se le solicite, ajuste la rotación de la placa modificando el ángulo de la placa mediante la opción Vista previa para que la placa quede recta. Cuando esté satisfecho, haga clic en el botón Aceptar .
    3. A continuación, mueva el rectángulo alrededor de las colonias y utilícelo para recortar la parte del plato que contiene las colonias. Cuando esté listo, haga clic en el botón Aceptar .
    4. El siguiente mensaje definirá la cuadrícula utilizada para dibujar el ROI alrededor de cada colonia y medirá el área de motilidad. Seleccione la densidad de colonias adecuada. Ajuste los distintos parámetros si es necesario, de modo que cada círculo esté alrededor de una colonia. Cuando esté listo, active el menú ¿Está bien? y haga clic en el botón Aceptar . Esto medirá el área de motilidad de cada colonia y guardará un archivo CSV en la carpeta que contiene los datos.
  2. Combine este archivo CSV con la leyenda de la placa, también organizada por filas, para identificar cada área de motilidad con el mutante correspondiente. Los valores más bajos de densidad integrada corresponden a los mutantes que no eran móviles o mostraron una motilidad disminuida.

5. Ensayos de motilidad tradicionales para la validación de aciertos

NOTA: Después de observar mutantes con motilidad impactada en el protocolo de motilidad de alto rendimiento, es importante validar los resultados obtenidos individualmente. El protocolo de motilidad individual difiere del utilizado para las pruebas de alto rendimiento, pero los medios utilizados son los mismos.

  1. Ensayo de motilidad de enjambre
    NOTA: La motilidad del enjambre se realiza como se describe en detalle por Ha et al.16.
    1. Brevemente, autoclave una solución de agar con M9 (agar al 0,5%), glucosa, ácidos casamino y MgSO4. Vierta el agar mezclado enfriado en placas de Petri (25 mL por placa).
    2. Inocular con 2,5 μL de cultivo bacteriano durante la noche. Incubar a 37 °C durante 18 h con los párpados hacia arriba para observar los fenotipos de motilidad.
  2. Ensayo de motilidad espasmódica
    NOTA: La motilidad espasmódica se realiza como se describe en detalle por Haley et al.33,34.
    1. Brevemente, autoclave un agar LB 1% (ver Tabla 1). Vierta el agar LB 1% mezclado y enfriado en placas de Petri (25 mL por placa).
    2. Inocular bacterias en el fondo de las placas de contracción (agar al 1%). Incubar las placas a 37 °C durante 48 h y luego a RT durante 48 h adicionales. Retire el agar de la placa y visualice la zona de espasmos tiñendo la placa de Petri con un 1% de violeta cristalino.
    3. Fotografíe las placas de Petri utilizando el PhenoBooth con los mismos parámetros descritos en el paso 3.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Utilizamos este protocolo para caracterizar el efecto de la inactivación génica sobre la motilidad de P. aeruginosa en alto rendimiento. Aquí, detallamos su uso para estudiar la motilidad de enjambre y espasmos en una colección de deleción de P en todo el genoma. cepa aeruginosa PA14 (biblioteca PA14). El protocolo ofrece una gran versatilidad y facilidad de uso, permitiendo modificaciones en diferentes pasos del protocolo, como el uso de diferentes medios de ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El protocolo de motilidad de alto rendimiento descrito aquí nos permite procesar y analizar el fenotipo de motilidad de muchas colonias con precisión y reproducibilidad. En comparación con los métodos manuales tradicionales, este enfoque semiautomatizado aumenta la escalabilidad y el rendimiento de los ensayos de motilidad para permitir la evaluación de la motilidad bacteriana en todo el genoma. El protocolo se ha optimizado para su uso con la biblioteca PA14, pero este ensayo podría usa...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran no divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos al laboratorio Surette de la Universidad McMaster por proporcionar una copia de la biblioteca PA14. Agradecemos al Dr. Fabrice Jean-Pierre por sus útiles comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo contó con el apoyo del Consejo de Investigación en Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (RGPIN-2019-06044) y una beca inicial para nuevos investigadores del Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS; #295613). J.-P.C. es titular de una beca Chercheur boursier junior 2 del Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQS).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
96 placas de pozo   Corning   3701 
Agar Fisher Scientific & nbsp;  BP1423-2 Concentración final del 0,5% para motilidad en enjambre o 1% para motilidad de espasmos, respectivamente.
Ácidos Casamino    Fisher Scientific & nbsp;  223050 Prepara un 20% de agua. El filtro esteriliza con un 0,22 y mu; m filtrar y almacenar a 4 °C. Concentración final 0,5% en medio mínimo M9.
Violeta cristalino Bio Básico   CB0331Prepara una solución al 1% en agua.
D-Glucosa   Bio Básico   GB0219 Prepara un stock del 20% (1,1 M) en agua y esterilízalo mediante autoclave. Concentración final 0,2% en medio mínimo M9.
Filtropur S 0,2 Sarstedt 83.1826.001
Sulfato de gentamicina    Bio Básico   GB0217 Prepara un caldo de 30 mg/ml en agua. El filtro esteriliza con un 0,22 y mu; M filtra y almacena a 4 grados; C y guion; concentración final en las láminas 15 y micro; g/mL...    
Inoculación de Bucle y Aguja Fisher Scientific & nbsp;22363597
M9 Sales Mínimas, 5X y nbsp;Fisher Scientific & nbsp;248510Prepara un stock de 1M en agua y esteriliza con autoclave. Concentración final 1 mM en medio mínimo M9.  
Sulfato de Magnesio (MgSO4) y nbsp;  Fisher Scientific & nbsp;M63-500  Prepara un caldo de MgSO4 de 1 m en agua. El filtro esteriliza con un 0,22 y mu; Filtro M y guárdalo a temperatura ambiente. Concentración final  
Biblioteca de mutantes de inserción de transposones PA14    Liberati et al., 2006 (véase la referencia 29)59 planchas de 96 pozos para toda la colección. Cada pozo contiene un solo mutante en LB con un 25% de glicerol.
placa de Petri 92x16mm Sarstedt 82.1473.001
PhenoBooth+ Instrumentos de cantante https://www.singerinstruments.com/solution/phenobooth/specification/ Disolve 11,3 g del polvo en 200 mL de agua purificada. Autoclave en 121 y grados; C durante 15 min. 
Jeringuilla de plástico 10 mL Fisher Scientific & nbsp;14955459
Rotor+     Instrumentos de cantante https://www.singerinstruments.com/resource/rotor-had/ 
Densidades de 384 RePads de pines cortos Instrumentos de cantante   REP-004 
RePads de pinos cortos 96 densidades    Instrumentos de cantante   REP-002 
Cloruro de sodio (NaCl)   Fisher Scientific & nbsp;BP358-212 
Replicador de 96 pines con resorteEnzyScreen   CR1000 
Cuchilla quirúrgica de acero inoxidable nº 25 Fisher Scientific & nbsp;08-918-5F
Triptona y nbsp;Oxoid   LP0042B 
Placas UniwellInstrumentos de cantante   PlusPlates: PLU-003   Dimensión de la placa: 54 y más veces; 34 y más veces; 38 cm - sin paredes interiores, que proporcionan dimensiones internas mayores.
Placas UniwellVWRPlacas de cultivo de tejido de pozo único: 75780-348Mismas dimensiones que las PlusPlates.
Extracto de levadura  Fisher Scientific & nbsp;248510 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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