Método de alto rendimiento para observar fenotipos de motilidad en Pseudomonas aeruginosa

Summary

Este protocolo presenta un método rápido y eficiente para identificar los factores genéticos involucrados en varios tipos de motilidades en Pseudomonas aeruginosa.

Abstract

Los comportamientos de motilidad a menudo juegan un papel importante en la capacidad de una bacteria para explotar los recursos disponibles en su entorno. Esto es particularmente cierto para el patógeno versátil Pseudomonas aeruginosa, que puede exhibir diversos tipos de motilidades, incluyendo enjambre y espasmos, que son rasgos patógenos importantes que contribuyen a la colonización de la superficie, la formación de biopelículas y la evasión de las defensas del huésped. Este manuscrito presenta un protocolo de motilidad de alto rendimiento para estudiar los comportamientos de motilidad de P. aeruginosa. El protocolo permite, por ejemplo, realizar pruebas simultáneas de múltiples cepas de P. aeruginosa a partir de una biblioteca de mutantes de todo el genoma, para identificar y analizar los factores genéticos implicados en su motilidad. El enfoque ofrece la posibilidad de estudiar la motilidad de manera integral y conocer los mecanismos moleculares que subyacen a la motilidad de P. aeruginosa . El protocolo descrito aquí también puede modificarse para adaptarse a diferentes tipos de ensayos de motilidad, así como a otras especies bacterianas, proporcionando así una poderosa plataforma para avanzar en la comprensión del comportamiento bacteriano en diversos contextos.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa es un patógeno oportunista que puede colonizar diversos ambientes debido a su notable versatilidad metabólica ^1,2. Esta versatilidad es crucial para la transición de un modo de crecimiento planctónico a biopelículas, lo que contribuye a su capacidad para prosperar en una amplia gama de nichos que van desde el agua hasta el cuerpo humano ^3,4,5. La transición entre estos modos de crecimiento se ve favorecida por una amplia capacidad para moverse a través ....

Protocol

NOTA: El flujo de trabajo general de este procedimiento se describe en la Figura 1.

Figura 1: Flujo de trabajo experimental. (1) Prepare la cantidad necesaria de medios de motilidad en función del tipo de motilidad de interés en los experimentos. (2) Utilizando un sistema de replicación manual o automatizado, prepare las placas madre para la biblioteca de mutantes de ins....

Results

Utilizamos este protocolo para caracterizar el efecto de la inactivación génica sobre la motilidad de P. aeruginosa en alto rendimiento. Aquí, detallamos su uso para estudiar la motilidad de enjambre y espasmos en una colección de deleción de P en todo el genoma. cepa aeruginosa PA14 (biblioteca PA14). El protocolo ofrece una gran versatilidad y facilidad de uso, permitiendo modificaciones en diferentes pasos del protocolo, como el uso de diferentes medios de .......

Discussion

El protocolo de motilidad de alto rendimiento descrito aquí nos permite procesar y analizar el fenotipo de motilidad de muchas colonias con precisión y reproducibilidad. En comparación con los métodos manuales tradicionales, este enfoque semiautomatizado aumenta la escalabilidad y el rendimiento de los ensayos de motilidad para permitir la evaluación de la motilidad bacteriana en todo el genoma. El protocolo se ha optimizado para su uso con la biblioteca PA14, pero este ensayo podría usa.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 placas de pozo	Corning	3701
Agar	Fisher Scientific & nbsp;	BP1423-2	Concentración final del 0,5% para motilidad en enjambre o 1% para motilidad de espasmos, respectivamente.
Ácidos Casamino	Fisher Scientific & nbsp;	223050	Prepara un 20% de agua. El filtro esteriliza con un 0,22 y mu; m filtrar y almacenar a 4 °C. Concentración final 0,5% en medio mínimo M9.
Violeta cristalino	Bio Básico	CB0331	Prepara una solución al 1% en agua.
D-Glucosa	Bio Básico	GB0219	Prepara un stock del 20% (1,1 M) en agua y esterilízalo mediante autoclave. Concentración final 0,2% en medio mínimo M9.
Filtropur S 0,2	Sarstedt	83.1826.001
Sulfato de gentamicina	Bio Básico	GB0217	Prepara un caldo de 30 mg/ml en agua. El filtro esteriliza con un 0,22 y mu; M filtra y almacena a 4 grados; C y guion; concentración final en las láminas 15 y micro; g/mL...
Inoculación de Bucle y Aguja	Fisher Scientific & nbsp;	22363597
M9 Sales Mínimas, 5X y nbsp;	Fisher Scientific & nbsp;	248510	Prepara un stock de 1M en agua y esteriliza con autoclave. Concentración final 1 mM en medio mínimo M9.
Sulfato de Magnesio (MgSO4) y nbsp;	Fisher Scientific & nbsp;	M63-500	Prepara un caldo de MgSO4 de 1 m en agua. El filtro esteriliza con un 0,22 y mu; Filtro M y guárdalo a temperatura ambiente. Concentración final
Biblioteca de mutantes de inserción de transposones PA14		Liberati et al., 2006 (véase la referencia 29)	59 planchas de 96 pozos para toda la colección. Cada pozo contiene un solo mutante en LB con un 25% de glicerol.
placa de Petri 92x16mm	Sarstedt	82.1473.001
PhenoBooth+	Instrumentos de cantante	https://www.singerinstruments.com/solution/phenobooth/specification/	Disolve 11,3 g del polvo en 200 mL de agua purificada. Autoclave en 121 y grados; C durante 15 min.
Jeringuilla de plástico 10 mL	Fisher Scientific & nbsp;	14955459
Rotor+	Instrumentos de cantante	https://www.singerinstruments.com/resource/rotor-had/
Densidades de 384 RePads de pines cortos	Instrumentos de cantante	REP-004
RePads de pinos cortos 96 densidades	Instrumentos de cantante	REP-002
Cloruro de sodio (NaCl)	Fisher Scientific & nbsp;	BP358-212
Replicador de 96 pines con resorte	EnzyScreen	CR1000
Cuchilla quirúrgica de acero inoxidable nº 25	Fisher Scientific & nbsp;	08-918-5F
Triptona y nbsp;	Oxoid	LP0042B
Placas Uniwell	Instrumentos de cantante	PlusPlates: PLU-003	Dimensión de la placa: 54 y más veces; 34 y más veces; 38 cm - sin paredes interiores, que proporcionan dimensiones internas mayores.
Placas Uniwell	VWR	Placas de cultivo de tejido de pozo único: 75780-348	Mismas dimensiones que las PlusPlates.
Extracto de levadura	Fisher Scientific & nbsp;	248510