Method Article

Optimización de la administración de vesículas extracelulares mediante un andamio bioimpreso en 3D con vaina central para el tratamiento de heridas crónicas

DOI:

10.3791/67764

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February 28th, 2025

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1Laboratory for Stem Cell and Regenerative Medicine, Natural and Medical Sciences Research Center, University of Nizwa, 2Doctoral Programme in Biomedicine, Faculty of Medicine, University of Helsinki

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio presenta un protocolo para la fabricación de andamios bioimpresos en 3D para la cicatrización de heridas crónicas. Las vesículas extracelulares se aíslan de las células madre mesenquimales y se cargan en el núcleo (alginato) con la vaina hecha de carboximetilcelulosa y alginato liasa. Este diseño permite una degradación controlada del andamio y una liberación eficiente de los vehículos eléctricos.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio describe un protocolo detallado para la fabricación de andamios bioimpresos en 3D con vaina central diseñados para mejorar la cicatrización de heridas crónicas. El protocolo consiste en aislar vesículas extracelulares (VE) de células madre mesenquimales (MSC), conocidas por sus propiedades regenerativas e inmunomoduladoras. A continuación, estos vehículos eléctricos se incorporan a una estructura de andamio única. El andamio cuenta con un núcleo compuesto de alginato cargado con EV, rodeado por una funda hecha de carboximetilcelulosa y alginato liasa. Este diseño innovador garantiza una degradación controlada del andamio al tiempo que promueve la liberación eficiente y controlada de los EV en el sitio de la bobina. El protocolo cubre los pasos clave, incluida la preparación y caracterización de los EV, la formulación de biotintas para la bioimpresión 3D y la optimización de los parámetros de impresión para lograr la arquitectura de núcleo y vaina deseada. Al combinar la integridad estructural y la bioactividad, el andamio tiene como objetivo abordar las limitaciones de los apósitos convencionales para heridas, ofreciendo un enfoque específico para acelerar la regeneración de tejidos y reducir la inflamación en heridas crónicas. Este método proporciona una estrategia reproducible y escalable para el desarrollo de biomateriales avanzados con posibles aplicaciones clínicas en el tratamiento de heridas crónicas. El protocolo también destaca consideraciones críticas para lograr resultados consistentes, asegurando la adaptabilidad para futuras aplicaciones terapéuticas.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las heridas crónicas, a menudo relacionadas con una inflamación excesiva, requieren un tratamiento oportuno para prevenir complicaciones graves como infecciones y necrosis tisular, que pueden provocar amputaciones. A pesar de los avances, los tratamientos actuales siguen siendo costosos, inconvenientes, tienen efectos secundarios y tienen una eficacia limitada, lo que pone de manifiesto la necesidad de apósitos más curativos 1,2,3. El desarrollo de una nueva generación de apósitos para heridas diseñadas específicamente para heridas crónicas es esencial para abordar estos desafíos. Además, la naturaleza compleja de la cicatrización de heridas exige materiales de apósito con una serie de propiedades, como la hidratación, la flexibilidad, la adherencia, la bioactividad y la biodegradabilidad4. Este estudio tiene como objetivo desarrollar un apósito para heridas de bioingeniería que integre vesículas extracelulares (VE) con un andamio bioimpreso en 3D con vaina central para proporcionar un entorno terapéutico controlado y acelerar la cicatrización de heridas crónicas.

Las VE derivadas de células madre ayudan a la cicatrización crónica de heridas al promover respuestas antiinflamatorias, crecimiento celular, migración y formación de vasos sanguíneos5. Además, los VE pueden administrar moléculas bioactivas, incluidos fármacos de moléculas pequeñas, construcciones de genes y proteínas para el tratamiento de heridas crónicas6. Además, su capacidad para proteger la carga de la degradación enzimática mejora la estabilidad y biodisponibilidad de los agentes terapéuticos, ofreciendo claras ventajas sobre los factores de crecimiento convencionales y los fármacos de moléculas pequeñas, que a menudo se degradan rápidamente in vivo7. A pesar de estas ventajas, la administración eficiente y sostenida de VE a los tejidos diana sigue siendo un desafío importante.

Los andamios de bioimpresión 3D pueden servir como plataforma de entrega para que los vehículos eléctricos aumenten sus efectos terapéuticos8. Estos andamios imitan los entornos celulares naturales y permiten la liberación controlada de vehículos eléctricos 9,10. También protegen a los VE de la degradación, mejorando la estabilidad de sus microARN y proteínas11. Han et al. demostraron que los vehículos eléctricos pueden liberarse eficazmente de los andamios GelMA bioimpresos en 3D. Esta liberación condujo a una mejor unión celular y una mayor expresión génica relacionada con las vías de mecanotransducción en células madre mesenquimales de almohadilla de grasa bucal humana (hBFP-MSC) sembradas en los andamios12. Born et al., al optimizar la concentración del reticulante, lograron una liberación controlada de los EV. Este enfoque ha demostrado eficacia en la promoción de la angiogénesis y ofrece un método prometedor para la administración regulada de EVs13.

La bioimpresión 3D de la vaina del núcleo permite la creación de estructuras complejas y multimateriales mediante la impresión de un material del núcleo encerrado en una funda. El núcleo puede incluir células, factores de crecimiento o fármacos, mientras que la vaina ofrece soporte mecánico y protección o actúa como barrera. Este método tiene aplicaciones en ingeniería de tejidos y medicina regenerativa, como el desarrollo de redes vasculares, la imitación de estructuras de tejidos naturales y la creación de sistemas de administración de fármacos. Permite un control preciso sobre la distribución y composición del material, mejorando la funcionalidad y la relevancia biológica de los constructos. En comparación con las técnicas alternativas, la bioimpresión 3D core-sheath proporciona un control preciso sobre la distribución y composición del material, mejorando la funcionalidad y la relevancia biológica de los constructos14,15.

La degradación diseñada en los apósitos para heridas ofrece beneficios como la reducción de la incomodidad durante los cambios, un ambiente húmedo para la curación y el control de infecciones, la administración terapéutica oportuna y la regeneración óptima de los tejidos 16,17,18. Los hidrogeles de alginato (Alg) y carboximetilcelulosa (CMCh) son biocompatibles y eficaces para entregar vesículas extracelulares (VE) a las heridas, mejorando la cicatrización a través de la comunicación celular y la reducción de la inflamación18. En este estudio, los VE se integraron en un núcleo de Alg, mientras que se utilizó una vaina de CMCh y AlgLiasa (AlgLyase) para permitir la rápida degradación del apósito y la administración de EV. Este diseño de vaina central facilita la liberación rápida de VE en respuesta a la degradación del andamio, mejorando su eficacia terapéutica y abordando las limitaciones de los tratamientos de heridas crónicas existentes. El objetivo principal de este estudio es desarrollar un apósito de bioingeniería que mejore la cicatrización de heridas mediante la integración de la liberación controlada de EV con un andamio degradable que responda y, en última instancia, mejore los resultados del tratamiento de las heridas crónicas.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La investigación con animales se llevó a cabo en total conformidad con los estándares éticos establecidos por el Comité Nacional de Bioética y el Comité de Ética Animal de la Universidad de Nizwa. La aprobación ética para este estudio se concedió bajo la autorización ID: VCGSR, AREC/01/2023. Todos los animales se alojaron en condiciones estándar de laboratorio, lo que garantizó controles ambientales óptimos, una nutrición adecuada y un cuidado integral para salvaguardar su bienestar durante todo el estudio. Todos los procedimientos relacionados con los animales se adhirieron estrictamente a las políticas institucionales, a las normas internacionales de cuidado animal y a las directrices de ARRIVE.

1. Cultivo celular

  1. Recupere un vial de MSC (pasaje # 2) del almacenamiento de nitrógeno líquido y manéjelo con técnicas asépticas para evitar la contaminación. Descongele rápidamente las células en un baño de agua a 37 °C, asegurándose de eliminarlas tan pronto como quede un pequeño fragmento de hielo.
  2. Prepare un medio completo que incluya MSC SFM Basal Medium, suplementado con un 1% (v/v) de MSC SFM XenoFree supplement, un 1% (v/v) de GlutaMAX y un 0,01% (v/v) de gentamicina. Añada 1 ml de medio completo precalentado (37 °C) a razón de 3 a 5 gotas cada 5 s al vial y luego mézclelo suavemente. Transfiera todo el contenido del vial de MSC a un tubo cónico de 15 mL que contenga 4 mL de medio completo precalentado, en condiciones asépticas en una cabina de bioseguridad de Clase II.
  3. Centrifugar las celdas a 200 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Asegúrese de que la centrífuga esté equilibrada correctamente.
  4. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 1 mL de medio completo precalentado. A continuación, transfiera las células a un matraz T25 que contenga 4 mL de medio completo.
  5. Incline suavemente el matraz para asegurarse de que las células se distribuyan uniformemente. Incubar el matraz a 37 °C con 5% de CO2.
  6. Cambie el medio cada 2 días, reemplazándolo por medio fresco, precalentado y completo. Utilice un pipeteo suave para evitar la alteración celular. Al alcanzar el 70%-80% de confluencia, aspire el medio gastado del matraz T25.
  7. Lave las células con 3 mL de PBS fresco para eliminar los residuos. Asegure una cobertura completa del matraz durante el lavado.
  8. Añada 1 mL de solución de tripsina al 0,25% al matraz T25, incube a 37 °C durante 3-7 min y controle cuidadosamente el desprendimiento bajo el microscopio con un aumento de 4x.
  9. Golpee suavemente el matraz si es necesario para asegurar el desprendimiento completo de la celda. Agregue medio completo precalentado al matraz y pipetee hacia arriba y hacia abajo sobre la superficie para ayudar a separar las celdas. A continuación, transfiera la suspensión de la célula a un tubo de centrífuga de 15 ml.
  10. Centrifugar el tubo a 200 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Suspenda el gránulo de células en un medio fresco y completo y cuente las células con un hemocitómetro de Neubauer. Transfiera las células a un matraz T75. Asegure una densidad de siembra de 5.000 células/cm2 para un crecimiento óptimo.
  11. Incubar las células a 37 °C con 5% de CO2. Después de 72 h de incubación de las células, recoja los medios acondicionados de las células para el aislamiento de las EV. Úselo inmediatamente después de la recolección.

2. Aislamiento de vehículos eléctricos

  1. Centrifugar los 13 mL de los medios acondicionados recolectados a 800 x g durante 15 min para eliminar los desechos celulares. Filtre el sobrenadante suavemente con un filtro de jeringa de 0,22 μm para eliminar las partículas grandes.
  2. Agregue 5 mL de tampón de precipitación a los medios acondicionados filtrados y vórtice bien para mezclar. Asegúrese de que la solución sea homogénea.
  3. Incubar la mezcla durante la noche a 4 °C para permitir que los EV precipiten. Centrifugar la mezcla a 3.220 x g durante 30 min a 20 °C. Compruebe el equilibrio de los tubos.
  4. Deseche con cuidado el sobrenadante sin alterar el pellet. Centrifugar el pellet una vez más a 3.220 x g durante 5 s para eliminar el líquido residual.
  5. Pipetear suavemente el pellet EV en 200 μL de PBS para evitar daños a los EV. Mida la concentración de proteínas EVs siguiendo las instrucciones del fabricante (BCA Protein Assay Kit).
  6. Realizar Western blot para detectar marcadores específicos de EV (CD63, CD81 y CD9), para verificar el fenotipo18 de EV. El análisis confirmó la presencia de estos marcadores, validando la identidad de los VE19.
  7. Para minimizar el riesgo de contaminación por RNasa, se recomienda utilizarlo directamente sin almacenamiento adicional. En caso de que sea necesario, almacene los vehículos eléctricos a -80 °C para su uso posterior. Alícuota la suspensión de los vehículos eléctricos en volúmenes de 40 μL para evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación.

3. Etiquetado de vehículos eléctricos con PKH-26

  1. Preparación del tampón
    1. Disuelva 0,238 g de HEPES en aproximadamente 90 ml de agua ultrapura estéril en un recipiente estéril. Utilice una solución HEPES recién preparada. Añadir 0,85 g de NaCl a la solución HEPES.
    2. Ajuste el pH a 7,4 utilizando 1 M de NaOH o HCl, según sea necesario, utilizando un medidor de pH calibrado. Agregue agua desionizada para llevar el volumen total a 100 mL. Filtre la solución a través de un filtro de 0,22 μm para esterilizarla.
  2. Diluir 4 μL de colorante PKH-26 en 1 mL de tampón preparado. Mezclar bien con una pipeta para garantizar la homogeneidad.
  3. Resuspender los EV purificados en 1 mL de PBS a una concentración de 700 μg/mL. Agregue 1 mL de la suspensión EVs a 1 mL de la solución PKH-26 preparada. Para el grupo de control de solo colorante, agregue 1 mL de medio completo sin EV a 1 mL de la solución PKH-26. Todos los pasos posteriores se realizan también para el grupo de control para tener en cuenta la posible agregación inespecífica o la formación de micelas.
  4. Mezcle bien los EV invirtiendo suavemente el tubo 10x-15x. Incubar la mezcla durante 3-5 minutos a temperatura ambiente, asegurando una exposición uniforme de los EV al tinte.
  5. Prepare una solución fresca de BSA al 1% de 2 ml con agua ultrapura estéril y añádala a los 2 ml de la mezcla resultante para apagar la reacción de etiquetado. Mezcle suavemente para evitar la agregación.
  6. Concentre los vehículos eléctricos marcados con PKH-26 de acuerdo con el protocolo mencionado anteriormente (pasos 2.2-2.7). Vuelva a suspender los EV marcados en 300 μL de PBS. Pipetee la muestra de EV marcados con PKH-26 en un tubo de filtro de 30 kDa.
  7. Centrifugar la muestra a 3.220 x g durante 30 min a 4 °C. Durante este paso, el colorante PKH-26 libre y las moléculas pequeñas pasarán a través de la membrana hacia el filtrado, mientras que los EV marcados con PKH-26 se retendrán en el retenido.
  8. Después de la centrifugación inicial, deseche el filtrado y agregue 300 μL de PBS al retenido. Vuelva a suspender suavemente los EV en el PBS pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
  9. Centrifugar la muestra de nuevo a 3.220 x g durante 30 min a 4 °C para eliminar cualquier resto de colorante libre o moléculas pequeñas.
  10. Confirmar la ausencia de PKH-26 en la solución filtrada mediante un microscopio fluorescente. Si se detecta algún tinte, repita los pasos de lavado.
  11. Recoja la solución superior con una micropipeta y retire el filtro del tubo de recolección. Invierta con cuidado el filtro (gírelo boca abajo).
  12. Centrifugar el filtro invertido a 800 x g durante 5 min a 4 °C. Esto ayudará a recoger los PKH-26-EV retenidos de la membrana del filtro en el nuevo tubo de recolección. Utilice directamente los PKH-26-EV para el siguiente paso.

4. 3D Bioimpresión

  1. Preparación de biotintas
    1. Prepare una solución fresca de Alg sódico al 4,5% (p/v) con agua ultrapura estéril. Remover durante la noche a 60 °C para permitir que la solución se disuelva por completo.
    2. Disuelva CMCh en agua ultrapura estéril para obtener una solución al 3,8% (p/v). Prepáralo fresco. Remover durante la noche a 60 °C para que se disuelva por completo.
    3. Centrifugar las biotintas preparadas a 3.220 x g durante 10 minutos a 25 °C para eliminar las burbujas que puedan interferir con el proceso de impresión.
    4. Mezcle los 3 mL de solución de Alg preparados con los EV marcados o el control de solo colorante usando un mezclador de jeringa para lograr la concentración de 0.01% (p/v) de EV. Asegure una distribución uniforme mediante una mezcla suave.
    5. Con un mezclador de jeringa, combine 1 mL de CMCh con una solución de AlgLyase recién preparada en agua ultrapura estéril para lograr una concentración final de 0,5 mU/mL.
  2. Como se muestra en la Figura 1A, cargue simultáneamente la biotinta Alg/Exo en la parte central y la biotinta CMCh/AlgLyase en la parte de la vaina de la configuración de la jeringa core/vaina.
  3. Deje reposar las biotintas durante 15 minutos antes de imprimir.
  4. Configuración de la bioimpresora 3D
    1. Con el software de la bioimpresora 3D, cree la estructura del andamio seleccionando una forma cilíndrica con un patrón de relleno diagonal. Para ello, ajuste el diámetro y la altura del cilindro a 20 mm y 1,1 mm, respectivamente. Configure el tamaño de poro a 1 mm.
    2. Ajuste las velocidades de bombeo del núcleo y de la boquilla de la vaina a 1 mm/s con un espesor de 0,25 mm por capa y ajuste la velocidad de movimiento a 6 mm/s. Imprime cuatro capas con un grosor de 0,25 mm por capa a temperatura ambiente.
  5. Comience a imprimir en película de poliéster.
  6. Utilice el humidificador con cloruro de calcio en aerosol (2,2%) para reticular el andamio durante el proceso de extrusión. Coloque la boquilla del humidificador a una distancia aproximada de 20 cm del cabezal de extrusión para garantizar una reticulación eficaz sin comprometer la estructura del andamio. Para una mayor reticulación, sumerja el andamio en una solución de cloruro de calcio (2,2%) durante 10 min.
  7. Enjuague el andamio 3 veces con agua ultrapura estéril para eliminar el exceso de cloruro de calcio y la biotinta no unida.
  8. Asegúrese de que el andamio se almacene en un entorno estéril a 4 °C para mantener la integridad y funcionalidad del andamio durante un máximo de tres meses.

5. Seguimiento de la liberación de vehículos eléctricos

  1. Creación de un modelo de herida cutánea circular
    1. Anestesiar ratones diabéticos heterocigotos machos Akita (8 semanas) administrando una inyección intraperitoneal de ketamina (70 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg). Confirme la anestesia adecuada evaluando la ausencia de respuestas reflejas (p. ej., pellizco de los dedos de los pies) y controle la frecuencia respiratoria. Para prevenir la sequedad de la córnea durante la anestesia, aplique un ungüento oftálmico veterinario estéril en los ojos.
    2. Prepare el área de la piel dorsal afeitándola primero con una maquinilla eléctrica. Evite la irritación o lesiones de la piel. Esterilice el área afeitada con una solución de povidona yodada.
    3. Con un asaltante estéril, cree una herida cutánea circular de espesor completo de 6 mm en la superficie dorsal de cada ratón.
    4. Coloque suavemente el andamio bioimpreso en 3D que contiene EV marcados con PKH directamente sobre el lecho de la herida. Asegúrese de que el andamio cubra completamente la superficie de la herida con bolsas de aire mínimas presionando ligeramente con pinzas estériles. Asegúrese de que el animal sea observado de cerca después del procedimiento y permanezca atendido hasta que haya recuperado completamente la conciencia y pueda mantener la decúbito esternal.
  2. Imágenes fluorescentes
    1. A las 2 h, 4 h, 8 h, 24 h post-implantación, anestesiar a los ratones con isoflurano. Para la inducción de la anestesia, coloque a los ratones en la cámara del sistema de imágenes in vivo (IVIS) y expongalos al 2%-3% de isoflurano en oxígeno. Aplica ungüento oftálmico en los ojos de los ratones para prevenir la sequedad. Una vez anestesiados, transfiera los ratones al sistema IVIS y manténgalos con isoflurano al 1%-2% en oxígeno suministrado a través de los canales nasales. Verifique que los animales estén completamente anestesiados y estables antes de proceder con las imágenes.
    2. Utilice el sistema IVIS para capturar las señales fluorescentes de los vehículos eléctricos marcados con PKH que se liberan del andamio. En el asistente de imágenes, seleccione la opción Imágenes de fluorescencia y active los filtros de excitación y emisión para el colorante PKH. Ajuste la configuración de la cámara, incluido el campo de visión y la altura del sujeto, para optimizar la detección de la señal. Garantice un posicionamiento coherente en todos los puntos de tiempo de obtención de imágenes para permitir comparaciones precisas. Comience a adquirir imágenes y guarde los datos resultantes.
    3. Cuantifique las intensidades de la señal fluorescente utilizando el software IVIS. Esto permitirá el seguimiento de la liberación de vehículos eléctricos a lo largo del tiempo.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En la Figura 1B, C, se muestra la liberación in vivo de los andamios Alg-EVs/CMCh y Alg-EVs/CMCh-AlgLyase. Como se anticipó, el andamio Alg-EVs/CMCh-AlgLyase exhibió un perfil de liberación más rápida en comparación con Alg-EVs/CMCh, particularmente en los puntos de tiempo de 2 h y 4 h. La liberación de VE a partir de hidrogeles está gobernada por una combinación de mecanismos fisicoquímicos, que incluyen difusión, hinchamiento, erosión y degradación

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un aspecto fundamental del protocolo es el diseño del andamio de la funda central, que es esencial para lograr una entrega eficiente de los vehículos eléctricos. El diseño incorpora Alg como material central y una combinación de CMCh con Alglyase como funda. Esta configuración facilita la liberación controlada y rápida de los vehículos eléctricos. El material central, Alg, encapsula los vehículos eléctricos, lo que garantiza su protección y entrega localizada. La funda, compuesta por CMC...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un agradecimiento especial a Said Al-Hashmi y Abdulrahman Almharbi de Happy Production por su excelente trabajo en el rodaje. También expresamos nuestro agradecimiento al Ministerio de Educación Superior, Investigación e Innovación y a la Universidad de Nizwa por su apoyo financiero y por proporcionar los recursos necesarios.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Boquilla cónica de precisión púrpura de 23 GCellinkKT0000002000Para proporcionar una extrusión precisa de biotintas con una obstrucción mínima
Alginato liasa (AlgLyase)Sigma AldrichA1603-100MGLa algiasa es una enzima que degrada el alginato.
Filtro ultracentrífugo Amicon, 30 kDa MWCOMerckUFC9030Se utiliza para lavar el kit de ensayo BCA de EV marcado con PKH-26
Thermo Scientific10678484Para determinar la concentración de proteínas/EV
Sistema de bioimpresiónRegematV1Para fabricar andamios de vaina central
Albúmina de suero bovino (BSA)sigma-aldrich05470-5GPara detener la reacción PKH 26 
Cloruro de calcioSigma AldrichC3306-100GPara reticular y estabilizar biotintas en ingeniería de tejidos
CentrífugaSigma2-16PUtilizada para el aislamiento de EVs
Centrífuga 5810 REppendorf22625101Utilizada para cultivo celular
Clase II Gabinete de seguridad biológicaTelstarBio II AdvanceCell culture
CryoCube  Serie F570 - Congelador ULTEppendorfF571240035Para almacenar EVs
microscopio fluorescenteOLYMPUS IX73P1F Se utiliza para comprobar el PKH-26 residual en el filtrado
Gentamicina (50 mg/ml)Thermofisher15750Antibiótico para medios de cultivo celular
GlutaMAX-I CTS, (100X), líquidoThermofisherA12860Suplemento de medios de cultivo celular
HClSigma Aldrich7647-01-0 Preparación detampón 
HEPESCarl RothArte. No.  6763.3Preparación de tampones
La carboximetilcelulosa de alta viscosidad (CMCh)BDH27929 4TCMCh es un derivado de la celulosa soluble en agua.
IncubadoraNew Brunswick NB-170RCultivo celular
Imagen InvivoPerkinElmerIVIS Lumina XRMS Serie IIIPara rastrear el lanzamiento de vehículos eléctricos, in vivo
Agitador magnéticoSalvisLABMC35Para preparación de biotintas
miRCURY Kits de exosomas para aislamiento de exosomasQiagen76743Aislamiento de Evs
NaOhDaejung1310-73-2 Preparación detampón
solución salina tamponada con fosfato (PBS)Thermo ScientificJ61196. APCultivo celular
PKH 26MCE154214-55-8Colorante rojo fluorescente para el etiquetado de los EV
Alginato de sodio (Alg)Sigma AldrichA0682-100GPolisacárido natural derivado de algas pardas.
Cloruro de sodio (NaCl)Carl RothArt-Nr-P029.1Preparación de tampón
StemPro BM Células madre mesenquimalesThermofisherA1382901Células madre mesenquimales
StemPro MSC SFM XenoFreeThermofisherA1067501Medios de cultivo celular
Tripsina 0,25%Thermofisher25050014Disociación celular
Vortex-MixerDaihan ScientificVM-10Se utiliza para mezclar el tampón de precipitación con el medio acondicionado

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