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Artículo de método

Análisis exhaustivo de la respuesta a los fármacos mediante el ensayo FLICK

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DOI:

10.3791/67768

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6 de junio de 2025

 , 
1Department of Systems Biology, UMass Chan Medical School

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe cómo usar el ensayo FLICK para evaluar las respuestas a los medicamentos, incluidas instrucciones detalladas para usar este ensayo para calcular las tasas de crecimiento y mortalidad inducidas por medicamentos y para evaluar el mecanismo de la muerte celular inducida por medicamentos.

Resumen

Para comprender la eficacia de los fármacos, una necesidad crítica es caracterizar el alcance de la muerte celular inducida por los fármacos. Los esfuerzos para cuantificar el nivel de muerte celular inducida por fármacos se ven desafiados por la existencia de más de una docena de formas molecularmente distintas de muerte regulada, cada una con su propio momento de activación y características bioquímicas distintivas. Además, para algunos subtipos de muerte necrótica, las características distintivas solo se observan transitoriamente y se pierden rápidamente debido a la ruptura celular. Por lo tanto, incluso cuando se utiliza una combinación de ensayos específicos de la vía de muerte, es difícil cuantificar con precisión la cantidad total de muerte celular o las contribuciones relativas de cada subtipo de muerte. Otro problema es que muchos ensayos específicos de muerte ignoran cómo los fármacos afectan a la proliferación celular, lo que dificulta la interpretación de si una población tratada con fármacos se está expandiendo o disminuyendo. El ensayo FLICK permite cuantificar el nivel total de muerte celular después de la estimulación de una manera que es específica para la muerte, pero también en gran medida independiente del tipo o tipos de muerte activados. Además, el ensayo FLICK retiene información sobre el tamaño total de la población y la tasa de proliferación celular. En este manuscrito, describimos el uso básico del ensayo FLICK, cómo solucionar problemas de este ensayo cuando se utilizan diferentes tipos de material biológico y cómo usar el ensayo FLICK para cuantificar las contribuciones de cada tipo de muerte celular a una respuesta farmacológica observada.

Introducción

En el caso de los fármacos contra el cáncer, la evaluación preclínica de la sensibilidad a los fármacos suele implicar la comprobación de cómo afectan los fármacos a la viabilidad de las células encultivo. La viabilidad celular después de la exposición al fármaco es producto de al menos dos efectos separados: la inhibición de la proliferación celular inducida por el fármaco y la activación de la muerte celular2. Desafortunadamente, aunque la muerte celular es una característica crítica que se requiere para respuestas duraderas a los medicamentos, los enfoques estándar no aclaran el grado en que un medicamento activala muerte celular.

Los ensayos comunes de respuesta a fármacos incluyen aquellos que cuentan directamente las células (p. ej., contador de Coulter, algunos usos de la citometría de flujo o la microscopía), cuantifican la capacidad de las células para proliferar (p. ej., ensayo de formación de colonias) o cuantifican una actividad metabólica (p. ej., CellTiter-Glo, ensayos MTT o MTS basados en tetrazolio). Una característica compartida de estos ensayos es que los datos generados son proporcionales al número de células vivas. Debido a que los fármacos varían considerablemente en la forma en que coordinan la inhibición del crecimiento y la muerte celular, el número de células vivas tras la exposición al fármaco proporciona una visión poco fiable del nivel de muerte celular inducida por el fármaco. Además, debido a que las células cancerosas generalmente proliferan rápidamente en cultivos celulares, el número de células vivas puede reducirse drásticamente en relación con la población no tratada sin inducirninguna muerte celular. Por lo tanto, una falla central es que el grado de muerte celular no se puede cuantificar sin medir tanto el número de células vivas como el de células muertas.

Cuantificar el número de células muertas después de la exposición a un fármaco es difícil de hacer con precisión porvarias razones. En primer lugar, existen más de una docena de vías de muerte celular reguladas 5,6,7,8. Aunque generalmente existen marcadores bioquímicos para identificar cada tipo de muerte celular regulada, estos marcadores varían en su especificidad, y no se puede utilizar un solo ensayo para cuantificar simultáneamente todos los subtipos de muerte. En segundo lugar, el momento de la activación de cada forma de muerte celular puede variar drásticamente dependiendo del contexto, por lo que no puede surgir una imagen completa a menos que la muerte se cuantifique a lo largo del tiempo9,10. Muchos ensayos bioquímicos para cuantificar la muerte celular producen una medición de punto final, por lo que la generación de datos cinéticos puede ser un desafío y estar limitada por el costo. Una tercera complicación es que la célula muerta en sí misma es un estado intermedio transitorio entre el estado de la célula viva y los restos de células disociadas. La estabilidad de las células muertas varía según el subtipo de muerte, con algunos tipos, como la apoptosis, creando cadáveres relativamente estables, mientras que otros tipos de muerte causan una lisis rápida. Por lo tanto, los métodos de cuantificación de la muerte que requieren la recolección y el recuento de células muertas también producirán una comprensión sesgada de la muerte celular. Por último, una cuarta limitación es que los ensayos bioquímicos que cuantifican el grado de muerte celular no suelen proporcionar ninguna información sobre cómo un fármaco altera la proliferación. Por lo tanto, no se puede interpretar el tamaño total de la población y, lo que es más importante, si la población está aumentando o disminuyendo.

Algunos ensayos basados en microscopía, como STACK y SPARKL, son eficaces para medir las células vivas y muertas a lo largo del tiempo, y estos ensayos pueden producir información completa sobre la muerte celular inducida por fármacos10,11. Sin embargo, estos ensayos requieren instrumentos especializados, como el microscopio Incucyte, lo que crea limitaciones en el rendimiento y el acceso a estos enfoques. Además, las técnicas basadas en microscopía requieren que las células muertas permanezcan en el plano focal del microscopio durante todo el experimento, lo que compromete la capacidad de cuantificar las células muertas cuando pierden adherencia a la placa o con el tiempo a medida que las células muertas se descomponen. De manera similar, los ensayos basados en microscopía enfrentan desafíos cuando se aplican en el contexto de cultivos en suspensión, ya que las células entran y salen de un plano focal determinado.

Para abordar los problemas señalados anteriormente, hemos generado un ensayo llamado FLICK (Fluorescence-based and Lysis-dependent Inference of Cell Death Kinetics)12,13. El objetivo del ensayo FLICK es determinar el nivel de muerte celular inducida por fármacos, independientemente de cómo estén muriendo las células. El método FLICK utiliza tintes celulares impermeabilizados, cuya fluorescencia depende de la unión del ADN. Una característica clave de FLICK es el uso de estos fluoróforos para etiquetar la acumulación de células muertas a lo largo del tiempo en virtud de su ADN accesible, seguido de una lisis mecánica basada en detergente para permeabilizar cualquier célula viva al final del ensayo. Estos datos, combinados con modelos matemáticos, permiten la cuantificación de poblaciones de células vivas y muertas con una resolución temporal continua y sin necesidad de recoger o manipular células muertas. Además, el uso de un lector de placas para evaluar la fluorescencia de las células muertas permite la evaluación de las células muertas sin necesidad de que las células muertas permanezcan intactas, aliviando así el sesgo contra las formas necróticas de muerte que dan lugar a la ruptura celular. Por último, el ensayo FLICK requiere una manipulación mínima de la placa y puede generar rápidamente mediciones cinéticas, lo que permite el cribado de fármacos de alto rendimiento. En este protocolo, nos centramos en el uso del ensayo FLICK, incluyendo cómo utilizar FLICK para inferir la tasa de crecimiento inducida por fármacos, la tasa de mortalidad y/o los mecanismos de muerte celular.

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Protocolo

1. Optimización del tiempo de permeabilización para cada línea celular de interés

NOTA: Los volúmenes y cantidades descritos son para optimizar una línea celular. Estos valores deben ampliarse en función del número de líneas celulares que se van a probar.

  1. Coloque el número deseado de celdas en cada pocillo de una placa de 96 pocillos, fondo óptico, de paredes negras. Agregue 100 μL de medio completo y deje que las células se adhieran a la placa durante la noche.
    NOTA: El número de células en placa debe optimizarse teniendo en cuenta la tasa de crecimiento de las células, las densidades óptimas y la longitud del ensayo. El número de células iniciales típicas para las líneas celulares cancerosas adherentes medido durante 72 h es de 1500 a 5000 células por pocillo. Por ejemplo, las células U2OS pueden sembrarse a 2000 células por pocillo en DMEM con 10% de FBS, 2 mM de glutamina y 1% de Pen-Strep y cultivarse durante la noche en condiciones estándar (5% de CO2, 37 °C, con humedad).
  2. En un tubo centrífugo cónico de 15 mL, prepare 1,5 mL de una solución al 1,5% de Triton-X en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Vortex, la solución Triton-X al 1,5% durante 5 s a velocidad máxima. Colocar en un baño de agua a 37 °C durante al menos 30 min.
  3. Inspeccione visualmente la solución para asegurarse de que Triton-X se haya disuelto completamente por vórtice durante varios segundos. Asegúrese de que la solución sea homogénea.
  4. Añada 10 μL de la solución Triton-X al 1,5% a cada pocillo de las células plateadas. No mezclar.
    NOTA: En esta etapa, no es deseable mezclar mediante pipeteo repetido debido a la formación de burbujas.
  5. Regrese las células al 5% de CO2, 37 °C con humedad en la incubadora de cultivos celulares durante al menos 1 h.
    NOTA: Después de la aplicación de la solución Triton-X, la mayoría de las líneas celulares se lisan completamente en 2-3 h. Esperar hasta 24 horas tiene un impacto mínimo en la señal de fluorescencia cuando se utilizan colorantes como SYTOX Green. El aumento del porcentaje de Triton-X puede acortar el tiempo de incubación de líneas celulares difíciles de lisar.
  6. Observe las morfologías celulares en un microscopio óptico utilizando un objetivo 10x. Inspeccione las celdas una vez cada hora hasta que los cuerpos celulares ya no sean visibles. Registre el tiempo necesario para la permeabilización celular.
    NOTA: Si se dispone de un microscopio fluorescente, la lisis se puede visualizar utilizando un tinte de ADN impermeable a las células, como SYTOX Green. El colorante se puede agregar a una concentración final de 10 veces a la solución de Triton-X, y la permeabilización se puede confirmar mediante microscopía de fluorescencia.

2. Selección y calibración de la tinción de ADN

NOTA: Un requisito para el ensayo FLICK es el uso de un fluoróforo impermeable a la célula que emita una señal de manera dependiente de la unión al ADN, que no afecte a la viabilidad de la célula y que produzca una señal que escale linealmente con el número de células. Este protocolo utiliza SYTOX Green. Otros colorantes con propiedades similares también pueden ser adecuados para el ensayo FLICK, pero cada uno de ellos debe ser evaluado y calibrado. Consulte la Tabla 1 para ver ejemplos.

  1. Para el tinte de ADN seleccionado, determine el rango de concentraciones que se probarán según la recomendación del fabricante.
  2. Para cada concentración que se vaya a probar, coloque 40.000 células en 180 μL de medio de cultivo celular por triplicado a lo largo de la columna más a la izquierda de una placa de pared negra de 96 pocillos, con fondo óptico. Agregue 90 μL de medio a los pocillos restantes.
    NOTA: Esto se utilizará para generar una valoración lineal de la celda a través de las filas de la placa. La concentración final de los primeros pozos será de 20.000 células/pocillo. Las placas inferiores ópticas no son necesarias para los lectores de placas que leen la fluorescencia desde la parte superior del pocillo. El medio de cultivo celular debe ser el mismo que se utiliza para cultivar las células que se están analizando. Por ejemplo, si se utilizan células U2OS, se deben resuspender 40.000 células en 180 μL de DMEM.
  3. Con una pipeta multicanal, cree una dilución en serie 1:2 transfiriendo 90 μL de la columna situada más a la izquierda a la columna adyacente de la derecha. Pipetear 15x para mezclar.
  4. Repita el paso 2.3, pasando de la segunda columna a la tercera, luego de la tercera columna a la cuarta columna, y así sucesivamente. Termine la valoración en la penúltima columna de la placa. Deje la última columna sin celdas para que se pueda obtener la señal de fondo de los medios de cultivo celular.
  5. Para la penúltima columna, retire 90 μL para que todos los pocillos tengan 90 μL de medio que contenga un número variado de células. Deje que las células se adhieran durante 6 h en una incubadora de cultivo celular a 37 °C.
  6. Prepare una solución 10x de tinte de ADN para cada concentración de tinte que se va a analizar, con el tinte de ADN diluido en un medio de crecimiento completo utilizado para cultivar las células de interés. Prepare 1,5 ml de una solución de Triton-X al 1,5% en PBS, como se describe en el paso 1.
  7. A cada pocillo de la placa de 96 pocillos, agregue 10 μL del tinte de ADN 10x. Añadir 10 μL de solución de Triton-X al 1,5% a cada pocillo para permeabilizar las células. Incubar las células en esta solución durante el tiempo óptimo, que se determinó en el paso 1.
    NOTA: Después de la adición de Triton-X, la concentración final de tinte de ADN es ligeramente inferior a 1x, pero esto es intrascendente. Después de la incubación, se debe lisar toda la placa. La valoración celular manual se utilizará para identificar la concentración óptima de colorante de ADN y los ajustes óptimos para adquirir fluorescencia.
  8. Mida las intensidades de fluorescencia en la placa de valoración de la célula. Cuantifique la fluorescencia en una variedad de configuraciones de adquisición según lo descrito por el fabricante del tinte de ADN. Dependiendo del lector de placas utilizado, modifique las longitudes de onda de excitación y emisión y/o la ganancia digital.
  9. Elimine la señal de fondo de cada medición restando la señal promedio de la columna que no contiene celdas. Estos valores se pueden encontrar en la columna de pocillos más a la derecha en la placa de dilución en serie.
  10. Determine la linealidad de cada concentración de colorante de ADN para cada configuración de adquisición. La linealidad se puede determinar graficando el número de celdas frente a la señal de fluorescencia y realizando una regresión lineal. El coeficiente de determinación (r2) informa el grado en que la señal de fluorescencia está relacionada linealmente con el número de células.
  11. Elija la configuración de adquisición y la concentración de colorante de ADN que tenga la mejor combinación de linealidad y rango dinámico.
    NOTA: Considere todo el rango de números de celda de 0 a 20,000 celdas. Asegúrese de que la ganancia y la concentración de colorante de ADN sean lineales a números de células bajos, entre 0 y 1000 células. Varios ajustes del instrumento o concentraciones de colorante de ADN pueden proporcionar una fuerte correlación en todo el rango. Sin embargo, es esencial que la sensibilidad del extremo inferior sea robusta, de modo que se puedan medir con precisión los pequeños cambios en las células muertas.

3. Colocación de placas celulares, aplicación de fármacos en pocillos y medición de la fluorescencia de células muertas a lo largo del tiempo en placas tratadas con fármacos

NOTA: Las placas de dilución de fármacos pueden diseñarse de forma flexible en función de las necesidades experimentales. Por lo general, las placas de dilución de fármacos incluirán una serie de diluciones logarítmicas o semilogarítmicas de uno o varios fármacos.

  1. Considere el diseño de recubrimiento óptimo para el experimento. Evite las mediciones de los pozos exteriores de una placa de 96 pocillos para disminuir el ruido asociado con la variación del crecimiento, ya que los pozos exteriores experimentan diferentes temperaturas, oxigenación y evaporación en comparación con los pocillos internos de la placa.
    NOTA: Incluir controles en todo el paisaje de la placa aumentará la solidez de los datos de crecimiento. Considere incluir pozos de control en el centro y los bordes de la placa.
  2. Determine el número de placas necesarias para el experimento. Incluya una placa adicional que se lisará al comienzo del ensayo para establecer el número promedio de células por pocillo en el momento del fármaco (es decir, la placa de control T0).
  3. Prepare una suspensión celular en un medio de crecimiento completo.
    1. En función del número de placas necesarias para el experimento (calculado en el paso 3.2), determine el volumen de la suspensión celular necesario. Si las placas de siembra se siembran a 90 μL por pocillo, se requieren aproximadamente 10 mL por placa. Multiplique el número de placas necesarias por 10 mL.
      NOTA: Es deseable aumentar este volumen para tener en cuenta el volumen muerto del depósito y la pérdida de volumen durante el pipeteo. Por ejemplo, el volumen calculado se puede multiplicar por 1,2.
    2. Cuente las células y prepare una dilución de células en función del número deseado de células por pocillo. Por ejemplo, si el objetivo es sembrar 2000 células en 90 μL de medio por pocillo de una placa de 96 pocillos, para un total de 3 placas, calcule el número total de células necesarias para el experimento de la siguiente manera:
      figure-protocol-1
      De manera similar, si la suspensión celular contada es de 400.000 células/mL, el volumen de la suspensión celular necesario para el experimento sería:
      figure-protocol-2
    3. Corrija el volumen de los medios de cultivo celular utilizados para la siembra restando el volumen de la suspensión celular contada que se va a agregar.
      Medios de 36 mL - Suspensión de células de 2 mL = volumen de medio corregido de 34 mL
  4. Mezcle la suspensión de células contadas con el volumen de medio correcto utilizando una pipeta serológica. Transfiera esta suspensión celular a un depósito de reactivos de fondo en V.
  5. Con una pipeta multicanal, añada 90 μL de la suspensión celular a cada pocillo de las placas de 96 pocillos. Mezcle la suspensión celular en el depósito de reactivo regularmente utilizando pipeteo repetido con una pipeta serológica para asegurarse de que se mantenga la concentración deseada de células por volumen.
  6. Deje que las células se adhieran durante la noche en una incubadora de cultivo celular a 37 °C (generalmente 12-24 h).
  7. Prepare una solución de Triton-X al 1,5 % en PBS, como se describe en el paso 1. El volumen de esta solución debe ser suficiente para lisar todas las placas. Aproximadamente 1,5 mL de Triton-X al 1,5% en PBS es suficiente para lisar una placa de 96 pocillos.
    NOTA: La solución Triton-X al 1,5% en PBS es estable durante más de una semana y se puede fabricar con anticipación para mayor comodidad.
  8. Determine la cantidad de medios de cultivo celular necesarios para hacer una placa de dilución de medicamentos. Prepare placas de dilución de medicamentos en placas transparentes de 96 pocillos con fondo en U o V.
    1. Para asegurarse de que el volumen del fármaco diluido es suficiente para el experimento, aumente el volumen mínimo necesario para tener en cuenta la pérdida de volumen durante el pipeteo. Por ejemplo, si se van a añadir fármacos en 10 μL a cada pocillo de una placa de 96 pocillos y el experimento incluye tres placas, se requieren 30 μL de fármaco diluido por pocillo. Prepare 40-50 μL de medio drogado por pocillo para tener en cuenta la pérdida de volumen. Agregue 1.5 mL al volumen de medios requerido para tener en cuenta los medios necesarios para la placa de control T0.
  9. Prepare una concentración de 10x del tinte de ADN seleccionado en un medio de crecimiento completo. Esta concentración se basa en la concentración seleccionada en el paso 2.11. El volumen total de esta solución se calcula en el paso 3.8.
  10. Usando el tinte de ADN + medio de crecimiento del paso 3.9, prepare una concentración 10x de cada medicamento que se va a probar. Cree solo la dosis más alta de cada fármaco en la placa de dilución del fármaco y diluya en serie los fármacos con una pipeta multicanal, mezclando 15 veces entre cada pocillo.
    NOTA: Al hacer la dosis más alta para un medicamento determinado en la placa de dilución del medicamento, se debe tener en cuenta el volumen del medicamento para garantizar que la concentración sea precisa.
  11. Con una pipeta multicanal, añada 10 μL de fármaco + solución de colorante de ADN del paso 3.10 a las placas que contienen las células.
    NOTA: En el caso de las placas de dilución de fármacos en las que se ha creado una dilución en serie, si se añaden fármacos a las células empezando por la concentración más baja del fármaco y subiendo hasta la concentración más alta, no es necesario cambiar las puntas de la pipeta multicanal. Sin embargo, las puntas de la pipeta multicanal deben cambiarse entre cada placa y siempre que las puntas se hayan utilizado en un pocillo que contenga un fármaco diferente o una concentración más alta del fármaco.
  12. Lea la fluorescencia de todas las placas en las que se agregaron medicamentos. Esta lectura de fluorescencia es la lectura T0 (es decir, células muertas en el tiempo = 0 h).
  13. Regrese las placas a la incubadora después de tomar la lectura de fluorescencia T0.
  14. Añada 10 μL de la solución de colorante de ADN 10x creada en el paso 3.9 y 10 μL de la solución Triton-X al 1,5% en el paso 3.7 a la placa de control T0. Regrese esta placa a la incubadora durante la cantidad de tiempo seleccionada en el paso 1.8.
  15. Lea la placa de control T0 una vez que las células estén completamente lisadas, como se describe en el paso 1.6.

4. Mida la fluorescencia de las células muertas a lo largo del tiempo para placas tratadas con medicamentos

NOTA: Minimice el tiempo que las placas están fuera de la incubadora. Los cambios prolongados de temperatura pueden afectar a la viabilidad celular, y la exposición a la luz puede comprometer los fluoróforos de ADN, como SYTOX Green.

  1. Adquiera lecturas de fluorescencia para todas las placas tratadas con medicamentos cada 3-4 horas después de la administración del medicamento. Las placas no necesitan leerse durante la noche a menos que se requiera una cinética de muerte muy precisa.
    NOTA: No es necesario tomar los puntos de tiempo a intervalos fijos/estándar. En general, los puntos de tiempo se pueden tomar exclusivamente durante las horas normales de trabajo sin causar errores en el análisis posterior de la cinética de muerte. La cinética se puede inferir siempre y cuando se tomen algunas mediciones en el período anterior al inicio de la muerte, durante la fase ascendente de la muerte y durante la fase de saturación/meseta.
  2. En el punto de tiempo final deseado, adquiera una lectura de fluorescencia. Inmediatamente después, añadir 10 μL de la solución de Triton-X al 1,5% preparada en el paso 3.7 para lisar las células.
  3. Regrese las placas a la incubadora y deje que las células se permeabilicen durante el tiempo determinado en el paso 1.
  4. Adquirir lecturas de fluorescencia después de la permeabilización. Este valor de fluorescencia es proporcional al número total de células (es decir, células vivas + células muertas) de cada pocillo.

5. Calcular la cinética de la fracción letal

NOTA: Los cálculos descritos en este protocolo se pueden analizar en cualquier formato o software. Sin embargo, el uso de un entorno de programación como MATLAB, R o Python permitirá un análisis más rápido y flexible.

  1. Calcule los valores medios de fluorescencia de la placa de control T0 utilizando la media recortada al 50%. Este valor es proporcional al número total de células antes de la medicación.
  2. Usando el ajuste de la curva y una función de crecimiento exponencial, calcule la cinética del crecimiento de la población para todos los pozos del experimento. El tamaño inicial de la población para cada pocillo es el valor medio de fluorescencia T0 calculado en el paso 5.1. El tamaño final de la población para cada pozo es el valor posterior a la permeabilización calculado en el paso 4.4. La duración del ensayo es desde 0 h hasta el punto final del ensayo seleccionado en el paso 4.4.
  3. Utilizando los parámetros de crecimiento determinados en el paso 5.2, calcule el número total de células en cada punto de tiempo medido en el ensayo para cada pocillo. Determine el número de células vivas en cada punto de tiempo medido restando la medición de células muertas del total de células calculadas en el paso 5.2.
    NOTA: Debido a las pequeñas cantidades de ruido en el ensayo, en ocasiones, el número de células vivas puede ser un pequeño número negativo. Esto se puede establecer manualmente en 0 ya que no puede haber un número negativo de células vivas y lo más probable es que indique que todas las células de ese pozo estaban muertas.
  4. Calcule la fracción letal (LF) para cada punto de tiempo dividiendo la señal de fluorescencia de la célula muerta por la señal de célula total para cada punto de tiempo.
  5. Ajuste una ecuación de muerte exponencial por retraso (LED) a los datos del curso de tiempo de la fracción letal10. Para evitar parámetros cinéticos arbitrarios para dosis de un fármaco que no inducen ninguna letalidad significativa, ajústelo a un modelo lineal con una pendiente igual a 0. Determine los niveles significativos de letalidad en función del ruido en el ensayo o la LF observada para las condiciones no farmacológicas.
  6. Registre el tiempo de inicio de la muerte (DO) de la ecuación del LED. La ecuación del LED tiene cuatro parámetros: el LF inicial (LFi), el LF en la meseta (LFp), la tasa de mortalidad inicial (DR) y el OD. Deduzca estos parámetros a partir de los datos utilizando una regresión no lineal (es decir, ajuste de curva).
  7. Calcule la viabilidad fraccional (FV) en el criterio de valoración del ensayo para cada fármaco en cada dosis. Reste el valor LF del punto final de 1 o divida el número de celdas vivas por el total de celdas.
    NOTA: El FV se puede calcular en cualquier punto temporal, no solo en el punto final del ensayo. Estos datos se utilizan para evaluar la farmacología de la dosis (p. ej., fármaco IC50 o EC50).

6. Calcular el valor GR

  1. Determine el número promedio de células vivas para cada pocillo al comienzo del ensayo. Calcule este valor utilizando la lectura de T0 posterior a la permeabilización calculada en el paso 3.15 y restando la lectura de T0 para cada pocillo, que se recopiló en el paso 3.12. En la ecuación GR que se muestra a continuación (paso 6.3), este valor se denomina x0.
    NOTA: Ocasionalmente, la dosis más alta de un medicamento puede interferir con la lectura de fluorescencia del tinte de ADN. Puede ser conveniente calcular el número medio de células vivas en el tiempo 0 utilizando los pozos de control.
  2. Para los pocillos de control (xctrl), determine el número promedio de celdas vivas para cada pocillo en el punto final del ensayo. Determine el número promedio de células vivas en el criterio de valoración del ensayo para cada afección tratada con fármaco (x(c)).
    NOTA: Dependiendo de la variación en el crecimiento celular a través de la placa, se pueden usar diferentes valores de xctrl para la normalización de cada pocillo. Por ejemplo, si los valores de xctrl varían sistemáticamente a lo largo de la placa, puede ser conveniente utilizar el valor dex ctrl más cercano en lugar del valor medio de xctrl de la placa.
  3. Para cada pozo tratado con fármaco, calcule el valor de inhibición de la tasa de crecimiento (GR) normalizado utilizando la siguiente ecuación4:
    figure-protocol-3
    Realice el ajuste de curvas utilizando una regresión logística de 4 parámetros. GR está en una escala de -1 a 1.

7. Calcular las tasas de crecimiento y mortalidad inducidas por fármacos utilizando el método GRADE

NOTA: GR representa la tasa neta de crecimiento de la población, no la verdadera tasa de proliferación celular. Las tasas de crecimiento poblacional y mortalidad inducidas por drogas se pueden calcular utilizando una combinación de la GR y la fracción letal (LF).

  1. Determine el tiempo de duplicación (τ) de la línea celular durante el experimento utilizando el número promedio de células vivas de la lectura de control T0 (x0), el número promedio de células vivas de la condición de control en el punto final del ensayo (xctrl) y la longitud del ensayo en horas (t) para resolver la siguiente ecuación:
    figure-protocol-4
    NOTA: El cálculo preciso del tiempo de duplicación de células (τ) requiere que las células se dupliquen continuamente a lo largo del ensayo. En el caso de las células que experimentan inhibición por contacto, las células deben sembrarse a densidades iniciales que no confluyan durante el tiempo de ensayo deseado. Por ejemplo, U2OS tiene un tiempo medio de duplicación de 24 h. La siembra de 2000 células por pocillo en un ensayo de 72 h es óptima para interpretar su tasa de crecimiento.
  2. Determinar la relación entre las tasas de crecimiento/mortalidad y el tamaño de la población. Para ello, utilice un modelo de nacimiento/muerte y una simulación inicializada con todas las combinaciones plausibles de tasas de crecimiento y mortalidad. Esta simulación requiere el número promedio de células vivas de la placa de control T0 (x0), la longitud del ensayo (t) y un rango definido por el usuario de tasas de proliferación plausibles (p) y tasas de mortalidad (d).
    figure-protocol-5
    figure-protocol-6
    1. Para determinar valores plausibles para las tasas de crecimiento, comience con la tasa de crecimiento no tratada en la población celular duplicada por h (1/T) como la tasa de crecimiento más alta y 0 como la tasa de crecimiento más baja. Divida este rango en 500 segmentos igualmente espaciados. Se puede aplicar una operación similar para la tasa de mortalidad, probando un rango de 0 a 1.
      NOTA: Todas las combinaciones de pares de 500 velocidades se pueden realizar utilizando cualquier entorno de programación, pero pueden ser demasiado intensas computacionalmente si se utiliza algún software. Reducir esto a todas las combinaciones de pares de 50 tasas de crecimiento y mortalidad puede aliviar este problema, con una reducción en la precisión de la inferencia. Se ha proporcionado una plantilla de hoja de cálculo con este protocolo.
  3. Determine los valores de GR y LF (descritos anteriormente) para cada par de tasas de proliferación (p) y mortalidad (d) simuladas.
    NOTA: Los pasos 7.2-7.3 generarán una tabla que contiene cada par teórico de tasas de proliferación y mortalidad, con los valores calculados de GR y LF para ese par teórico. Esto funcionará como una tabla de búsqueda para asociar un par de valores de GR y LF observados experimentalmente con un par de tasas de proliferación y mortalidad inducidas por fármacos. El análisis de más de 500 valores discretos para las tasas de proliferación y mortalidad dará como resultado un valor más preciso numéricamente, pero es probable que este nivel de precisión esté más allá de la precisión del ensayo.
  4. Calcule la distancia por pares entre cada par GR/LF calculado experimentalmente y cada par GR/LF teórico en la tabla de búsqueda. Inferir que el par teórico con la distancia mínima al par de valores GR/LF observados experimentalmente son las verdaderas tasas de proliferación y mortalidad inducidas por fármacos.

8. Determinación de vías de muerte mediante inhibidores químicos selectivos de vías

NOTA: Los inhibidores químicos por sí solos son insuficientes para determinar definitivamente el mecanismo de muerte de un fármaco determinado. Los inhibidores químicos de las vías de muerte deben utilizarse para determinar qué respuestas bioquímicas o fenotípicas deben explorarse en experimentos posteriores, que probablemente incluyan la evaluación morfológica, los marcadores bioquímicos específicos de la vía y la evaluación de las dependencias genéticas.

  1. Optimizar la dosis de cada inhibidor de la muerte celular en la línea celular de interés mediante la prueba de un rango de dosis de concentraciones de inhibidores en el contexto de un activador canónico de la(s) vía(s) de muerte de interés (Tabla 2). Idealmente, la dosis seleccionada de inhibidor no debería afectar la viabilidad celular por sí sola (consulte la métrica GR).
    NOTA: No todas las líneas celulares pueden activar todas las vías de muerte. Es posible que se requiera una validación bioquímica o fenotípica cuando se prueban activadores/inhibidores de diferentes vías de muerte.
  2. Considere el diseño óptimo de la placa para una pantalla inhibidora. Para minimizar los efectos del lote, mantenga cada medicamento en la misma placa que los inhibidores que se están evaluando, con réplicas en placas separadas.
  3. Siembre el número deseado de células en cada pocillo de una placa de 96 pocillos, con fondo óptico y paredes negras, similar al paso 3.3. Disminuya el volumen de siembra a 80 μL para tener en cuenta los volúmenes del inhibidor y del fármaco.
  4. Prepare 10 veces la concertación de los inhibidores que se van a probar en medios completos y agregue 10 μL a cada pocillo. Tratamiento previo de las células con inhibidores de la vía de muerte durante 2-4 h. Posteriormente, agregue los medicamentos de interés y adquiera la lectura de fluorescencia, como en los pasos 3-5.
  5. Evaluar el cambio en el tiempo de inicio de la muerte (OD) y/o la fracción letal máxima para evaluar la efectividad de los inhibidores. El DO es un parámetro inferido del modelo de muerte exponencial de retraso (LED). Consulte los pasos 5.6 y 5.7.

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Resultados

Utilizando este protocolo, exploramos la sensibilidad de las células U2OS al inhibidor de HDAC Belinostat. Estos experimentos se realizaron utilizando 2 μM de SYTOX Green para etiquetar las células muertas (Figura 1A). Las lecturas cinéticas se realizaron utilizando un lector de placas fluorescentes a un ajuste de ganancia de 130 (Figura 1B). Las células se lisaron en una solución de Triton-X al 1,5% en PBS durante 2 h al final del ensayo (F...

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Discusión

El ensayo FLICK es un método sólido para generar una evaluación completa del efecto de un fármaco en el crecimiento y la muerte de una población celular. Debido a que este método no cuenta directamente las células, los pasos críticos del protocolo son garantizar la linealidad del ensayo y la lisis completa durante los pasos de permeabilización del tritón. El tiempo de permeabilización correcto se puede identificar visualmente, como se destaca en este protocolo, o cuantitativamente median...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a todos los miembros pasados y presentes del Laboratorio Lee por sus contribuciones a la perspectiva de nuestro laboratorio sobre la evaluación de las respuestas a los medicamentos. Este trabajo fue apoyado por fondos de los Institutos Nacionales de Salud para MJL (R21CA294000 y R35GM152194).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
BelinostatApexBioA4612
CamptotecinaApexBioA2877
Tubo de centrífuga cónico, 15mLFisher Scientific12-565-269
DMEMCorning10017CVPara células de siembra y fármaco
DMSOFisher ScientificMT-25950CQCPara células
de siembra y fármacoFisherbrand 96-Well, Cell Culture-Treated, Uk-Shaped Bottom MicroplateFisher ScientificFB012932Para sembrar y fármaco células (placa de clavijas)
Greiner Bio-One  CELLSTAR μ Clear 96-well-Cell Culture-Treated, Flat-Bottom MicroplateGreiner655090Para células de siembra y fármaco
IncuCyte S3Essen BiosciencesCualquier microscopio de fase funcionará
MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/products/matlab.htmlMATLAB versión R2023b, se requiere una licencia
Lector de fluorescencia de microplacasTecanSparkPara medir la fluorescencia de las células muertas
PalbociclibApexBioA8316
PBSCorning21-040-CMCualquier PBS funciona
Spark Lector de microplacas multimodo Tecanhttps://www.tecan.com/spark-overviewSparkControl versión de software 2.2
Depósito estéril, 25 mLFisher Scientific13-681-508Para sembrar y drogar células
Tinción de ácido nucleico Sytox GreenThermo Fisher ScientificS7020Tinción de ADN para medir la fluorescencia de células muertas
Triton-X 100Thermo Fisher ScientificJ66624-APPara permeabilizar células
U2OSATCCHTB-96Una línea celular de ejemplo utilizada en este protocolo
Z-VAD-FMKApexBioA1902

Referencias

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  3. Schwartz, H. R., et al. Drug GRADE: An Integrated Analysis of Population Growth and Cell Death Reveals Drug-Specific and Cancer Subtype-Specific Response Profiles. Cell Rep. 31 (12), 107800(2020).
  4. Hafner, M., Niepel, M., Chung, M., Sorger, P. K. Growth rate inhibition metrics correct for confounders in measuring sensitivity to cancer drugs. Nat Methods. 13 (6), 1-11 (2016).
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