Establecimiento de un módulo de cocultivo tridimensional de células epiteliales utilizando membranas nanofibrosas

Thi Xuan Thuy Tran; Hue Vy An Tran; In-Jeong Lee; Jong-Young Kwak

doi:10.3791/67780

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Artículo de método

Establecimiento de un módulo de cocultivo tridimensional de células epiteliales utilizando membranas nanofibrosas

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DOI:

10.3791/67780

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27 de diciembre de 2024

Thi Xuan Thuy Tran¹^,² , Hue Vy An Tran¹ , In-Jeong Lee³ , Jong-Young Kwak¹^,³

¹Department of Pharmacology, School of Medicine, Ajou University, ²Department of Medical Sciences, The Graduate School, Ajou University, ³3D Immune System Imaging Core Center, Ajou University

En este artículo

Resumen

Aquí, demostramos cómo las células epiteliales cultivadas con fibroblastos en el sistema de dos capas basado en membranas nanofibrosas pueden adherirse y crecer de manera estable en la membrana.

Resumen

Los obstáculos técnicos en un cultivo de células epiteliales incluyen la desdiferenciación y la pérdida de función. Los métodos biomiméticos de cultivo celular tridimensional (3D) pueden mejorar la eficiencia del cultivo celular. Este estudio presenta un sistema avanzado de cultivo de dos capas destinado a cultivar células epiteliales como capas similares a tejidos con el cultivo de fibroblastos dentro de un entorno 3D. Las membranas nanofibrosas (NM) de alcohol polivinílico (PVA) y poli(ε-caprolactona) (PCL) se fabricaron mediante electrohilado y se utilizaron como matriz extracelular fisiológicamente relevante para el cultivo de células epiteliales y fibroblastos, respectivamente. En los pocillos de inserción superiores, las células epiteliales pulmonares se cultivaron en el PVA NM, y en las cámaras inferiores, los fibroblastos se cultivaron en el PCL NM. Esta configuración elimina el contacto directo célula-célula y facilita el examen de la señalización paracrina mediada por factores solubles. Se empleó la microscopía confocal para analizar la distribución, el patrón de crecimiento y la expresión de proteínas intracelulares, incluida la zona oclusiva en las células epiteliales. Las técnicas de apilamiento en Z permitieron reconstrucciones 3D detalladas, proporcionando información precisa sobre la integridad de las uniones estrechas y la organización espacial dentro de la capa epitelial. La microscopía electrónica de barrido (SEM) evaluó las características morfológicas de los tipos celulares en las membranas nanofibrosas. Las imágenes SEM revelaron intrincadas estructuras de la superficie celular e interacciones con las nanofibras, lo que ofrece una perspectiva integral sobre la arquitectura celular y la interacción celular con la estructura nanofibrosa. El ensayo Cell Counting Kit-8 (CCK-8) es un método sencillo para medir las tasas de crecimiento de células epiteliales y fibroblastos a lo largo del tiempo. Proporciona los comportamientos proliferativos y los posibles efectos sinérgicos de la coculturización de estas células. Estos hallazgos ponen de manifiesto la eficacia de un sistema de cocultivo con insertos simple para el cultivo simultáneo de fibroblastos y células epiteliales, que es crucial en diversos contextos fisiológicos y farmacológicos, incluida la regeneración del tejido epitelial, el microambiente tumoral con células endoteliales, inmunológicas y otras células del estroma, el ensayo de toxicidad y la prueba de actividad de fármacos.

Introducción

A lo largo de las décadas, el cultivo clásico de monocapa bidimensional (2D) ha sido esencial para comprender las infecciones, la farmacología y la toxicología ^1,2. Sin embargo, es importante tener en cuenta la complejidad, las interacciones dinámicas entre las multicomposiciones y la arquitectura tridimensional (3D) del microambiente tisular. Por lo tanto, el cultivo celular 2D tiene limitaciones para imitar estructuras similares a tejidos ^3,4. Por ejemplo, hay una falta de señalización de célula a célula y de célula ....