Artículo de método

Establecimiento de un módulo de cocultivo tridimensional de células epiteliales utilizando membranas nanofibrosas

DOI:

10.3791/67780

⸱

27 de diciembre de 2024

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, School of Medicine, Ajou University, 2Department of Medical Sciences, The Graduate School, Ajou University, 33D Immune System Imaging Core Center, Ajou University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, demostramos cómo las células epiteliales cultivadas con fibroblastos en el sistema de dos capas basado en membranas nanofibrosas pueden adherirse y crecer de manera estable en la membrana.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los obstáculos técnicos en un cultivo de células epiteliales incluyen la desdiferenciación y la pérdida de función. Los métodos biomiméticos de cultivo celular tridimensional (3D) pueden mejorar la eficiencia del cultivo celular. Este estudio presenta un sistema avanzado de cultivo de dos capas destinado a cultivar células epiteliales como capas similares a tejidos con el cultivo de fibroblastos dentro de un entorno 3D. Las membranas nanofibrosas (NM) de alcohol polivinílico (PVA) y poli(ε-caprolactona) (PCL) se fabricaron mediante electrohilado y se utilizaron como matriz extracelular fisiológicamente relevante para el cultivo de células epiteliales y fibroblastos, respectivamente. En los pocillos de inserción superiores, las células epiteliales pulmonares se cultivaron en el PVA NM, y en las cámaras inferiores, los fibroblastos se cultivaron en el PCL NM. Esta configuración elimina el contacto directo célula-célula y facilita el examen de la señalización paracrina mediada por factores solubles. Se empleó la microscopía confocal para analizar la distribución, el patrón de crecimiento y la expresión de proteínas intracelulares, incluida la zona oclusiva en las células epiteliales. Las técnicas de apilamiento en Z permitieron reconstrucciones 3D detalladas, proporcionando información precisa sobre la integridad de las uniones estrechas y la organización espacial dentro de la capa epitelial. La microscopía electrónica de barrido (SEM) evaluó las características morfológicas de los tipos celulares en las membranas nanofibrosas. Las imágenes SEM revelaron intrincadas estructuras de la superficie celular e interacciones con las nanofibras, lo que ofrece una perspectiva integral sobre la arquitectura celular y la interacción celular con la estructura nanofibrosa. El ensayo Cell Counting Kit-8 (CCK-8) es un método sencillo para medir las tasas de crecimiento de células epiteliales y fibroblastos a lo largo del tiempo. Proporciona los comportamientos proliferativos y los posibles efectos sinérgicos de la coculturización de estas células. Estos hallazgos ponen de manifiesto la eficacia de un sistema de cocultivo con insertos simple para el cultivo simultáneo de fibroblastos y células epiteliales, que es crucial en diversos contextos fisiológicos y farmacológicos, incluida la regeneración del tejido epitelial, el microambiente tumoral con células endoteliales, inmunológicas y otras células del estroma, el ensayo de toxicidad y la prueba de actividad de fármacos.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A lo largo de las décadas, el cultivo clásico de monocapa bidimensional (2D) ha sido esencial para comprender las infecciones, la farmacología y la toxicología 1,2. Sin embargo, es importante tener en cuenta la complejidad, las interacciones dinámicas entre las multicomposiciones y la arquitectura tridimensional (3D) del microambiente tisular. Por lo tanto, el cultivo celular 2D tiene limitaciones para imitar estructuras similares a tejidos 3,4. Por ejemplo, hay una falta de señalización de célula a célula y de célula a matriz extracelular (ECM), que es esencial en la diferenciación celular, la proliferación y las funciones celulares en el microambiente vivo. Por estas razones, se han desarrollado los sistemas de cultivos celulares en 3D5. Las células en cultivo 3D crecen e interactúan con la matriz extracelular circundante en tres dimensiones. Además, se ha desarrollado un enfoque de cocultivo en 3D, compuesto por más de un tipo de célula, para cerrar la brecha entre los modelos in vitro simplistas de tipo de una sola célula y las interacciones celulares dinámicas que ocurren in vivo6. Los sistemas de cocultivo 3D han ganado popularidad en el estudio de la comunicación célula-célula y las interacciones célula-matriz extracelular (ECM) 7,8,9,10. Los sistemas actuales de cocultivo 3D tienen varias formas y pueden separarse en cocultivo directo e indirecto 8,9. En el cocultivo directo, varias funciones celulares en células cultivadas pueden verse afectadas principalmente por el contacto directo en lugar de los efectos paracrinos. En comparación, el cocultivo indirecto tiene una mayor ventaja en la investigación de la interacción paracrina mediante el uso de barreras o capas para separar diferentes tipos de células.

Se utilizan diversos materiales y métodos para fabricar andamios biomiméticos que imitan el ECM utilizando sustancias biocompatibles y biodegradables10. La estructura nanofibrosa del andamio imita la configuración de la MEC nativa en los tejidos biológicos, proporcionando una arquitectura 3D para el cultivo celular11,12. Las membranas nanofibrosas (NMs) electrohiladas han sido utilizadas en el cocultivo directo e indirecto de diferentes tipos de células 13,14,15.

Las células epiteliales forman una barrera física de los órganos principales, mientras que los fibroblastos son células del estroma predominantes que median la remodelación de la MEC y regulan el epitelio vecino 6,16,17. Las células epiteliales y los fibroblastos interactúan con la laminina en la membrana basal y con la fibronectina en la matriz intersticial, respectivamente, a través de receptores de integrinas en la superficie celular18. Cuando las células epiteliales se cultivan en NM de poli(alcohol vinílico) (PVA) con diámetros de 150 a 250 nm y microporos, forman múltiples capas en lugar de agregados celulares y esferoides, y sus patrones de crecimiento son similares a los de las células en el tejido epitelial19. En comparación, los NMs de poli(caprolactona) (PCL) con diámetros de 400-1.500 nm y microporos de 10-50 μm proporcionan una dimensionalidad espacial similar a la matriz intersticial para el crecimiento de fibroblastos cultivados 13,14. Debido a su biocompatibilidad, las membranas de PVA y PCL son polímeros comúnmente utilizados en ingeniería de tejidos20,21.

Este estudio presenta un sistema avanzado de cultivo de dos capas que utiliza NM porosas electrohiladas para cultivar células epiteliales como capas similares a tejidos y fibroblastos dentro de una estructura 3D. El protocolo se puede dividir en cinco etapas clave: fabricación de nanofibras, post-reticulación de fibras y evaluación de la calidad, preparación del pozo de cultivo unido a la membrana, siembra de células y cocultivo en 3D, y ensayos de células cultivadas en 3D.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Fabricación de nanofibras de PVA estables al agua

  1. Pesa 0,02 g de poli(ácido acrílico) (PAA) y 1 g de PVA, luego agrégalos a una botella de vidrio limpia que contenga una barra magnética. Agregue 7,8 mL de agua destilada a la botella, coloque la botella en un agitador de placas y ajuste la temperatura a 84 °C, la velocidad a 500 rpm y el tiempo a 12 h.
  2. Deje que el frasco se enfríe a temperatura ambiente antes de agregar 0,2 mL de glutaraldehído (GA). Coloque la botella en el agitador de placas y ajuste la velocidad a 500 rpm, el tiempo a 30 minutos y la temperatura a temperatura ambiente.
  3. Use una jeringa de 5 ml para electrohilado, separe los émbolos de los barriles y limpie los pequeños desechos de plástico dentro de los barriles y la punta de los émbolos.
  4. Use agujas para bloquear el flujo de líquido, luego vierta la solución de PVA en cada barril (volumen: 2,5-3 mL cada uno). Ensamble los émbolos y luego retire las agujas.
    NOTA: Es posible que haya una burbuja en la solución, así que espere hasta que la burbuja desaparezca. Esto tarda entre 10 y 30 minutos.
  5. Monta una nueva aguja metálica de 27 G y colócala en la máquina de electrohilado.
  6. Envuelva bien el colector con papel de aluminio.
  7. Deje que el panel del inyector vuelva a la posición original. Utilice los siguientes ajustes para la máquina: (cada bomba) volumen de inyección: 2 mL, velocidad de inyección: 6 μL/min, velocidad del rodillo: 100 rpm, distancia entre la punta y el colector: 14 cm. Compruebe el caudal de líquido de cada bomba.
  8. Haga funcionar la máquina con un potencial eléctrico de aproximadamente 12 kV.
  9. Asegúrese de que la humedad sea del 40 al 50% al principio y del 25 al 30% al final del proceso. Use un humidificador cuando la humedad disminuya y coloque platos que contengan agua destilada dentro de la máquina el día antes del electrospinning para aumentar la humedad.
    NOTA: Este es un factor crítico en la fabricación exitosa de nanofibras de PVA.
  10. Revise el flujo regularmente. Si la aguja está bloqueada, detenga temporalmente la máquina. Use una toallita de laboratorio para quitar la gota y espere hasta que aparezca la nueva gota. De lo contrario, cambie la aguja y luego continúe haciendo funcionar la máquina.
  11. El proceso de fabricación de nanofibras de PVA tarda ~ 6 h en completarse. Una vez finalizado el proceso de electrohilado, separe la lámina que contiene la estera de fibra del colector y almacene la estera de nanofibras en un desecante al vacío.

2. Tratamiento de una membrana nanofibrosa de PVA con vapor de ácido clorhídrico (HCl) y evaluación de la calidad de la fibra

NOTA: La estabilidad del agua de los NM de PVA se conserva bien después de la reacción posterior a la reticulación por vapor de HCl. Este proceso está optimizado para el grosor, el tamaño de poro y la rugosidad adecuados de los NM. El PVA es un polímero muy hidrófilo y las nanofibras de PVA electrohiladas son inestables en condiciones húmedas y en contacto con el agua. Los NM de PVA deben tratarse con vapor de HCl justo después de la fabricación del polímero PVA.

  1. Corte una estera de nanofibras en pedazos del tamaño deseado para el inserto de pocillo trans.
  2. Prepare un plato pequeño que contenga 1,5 mL de HCl puro. Coloque el plato que contiene HCl y las piezas de nanofibra dentro de una cámara de vacío y cierre la tapa.
    NOTA: El vapor de HCl se utiliza como agente de postreticulación para hacer que la nanofibra sea estable al agua.
  3. Abra la válvula conectada a la bomba de vacío, espere 10 s hasta que suba el humo de HCl y, a continuación, cierre la válvula. Tratar las membranas con humo de HCl durante 2 min.
  4. Después del tratamiento con vapor de HCl, agregue algunas gotas de agua destilada (DW) a las membranas, colóquelas en un portaobjetos de vidrio y retire la membrana de la lámina. Después de secarse al aire durante 20 minutos, las membranas se adhieren naturalmente al portaobjetos.
  5. Cubra las membranas con cinta de carbón con una capa delgada de oro con un recubridor de pulverización automática. Obtención de imágenes de microscopio electrónico de barrido (SEM).
  6. Después de la reticulación de los NM de PVA con HCl, lávelos 3 veces con 1x PBS y verifique el pH después de remojarlos en medios de cultivo para confirmar la ausencia de HCl residual.

3. Fabricación de nanofibras PCL y evaluación de la calidad de las nanofibras

  1. Pesa 1,5 g de PCL y añádelo a un frasco de vidrio limpio. Agregue 8,5 mL de cloroformo al frasco, coloque el frasco en un agitador de placas y disuelva el PCL en cloroformo durante 12 h a temperatura ambiente.
  2. Repita los pasos 1.3 a 1.9, excepto los pasos 1.7 y 1.8, ajuste la velocidad de inyección a 8 μL/min y el voltaje a 17,5 kV.
    NOTA: La fabricación de PCL tarda ~ 3.5 h en terminar.
  3. Corta un pequeño trozo de la membrana y cubre los trozos mediante el proceso de pulverización automática durante 5 min. Obtener imágenes SEM.

4. Ensamblaje de dos capas de membranas en un pozo trans

NOTA: En este protocolo, utilizamos una placa de 24 pocillos y su respectivo pocillo de inserción. El PVA NM se fija al pocillo de inserción, mientras que el PCL NM se fija al pocillo inferior.

  1. Corte una estera de nanofibras en trozos redondos, con un diámetro de 10 mm y 13 mm para los NM de PVA y PCL, respectivamente.
  2. Utilice el polidimetilsiloxano (PDMS) Sylgard 184 como agente adhesivo para unir las membranas al inserto y al pozo de la cámara. Antes de usar, mezcle Sylgard 184 Base (parte A) y Agente de curado (parte B) en un vaso de plástico en una proporción de masa de 10:1. Use un portaobjetos de vidrio limpio para mezclar vigorosamente la solución de PDMS durante 2-3 minutos hasta que toda la mezcla esté llena de burbujas. Deje que la burbuja se forme y desaparezca durante 10 minutos antes de usar; mientras tanto, deje que la corredera se caliente a 100 °C.
  3. Extienda el PDMS en un portaobjetos de vidrio y sumerja ligeramente el borde inferior del inserto en el PDMS. Mantenga el inserto bien boca abajo en el calentador de correderas para que el PDMS se endurezca (~10-15 min). Compruébelo cuidadosamente con una punta de 200 μL para asegurarse de que el PDMS no esté pegajoso.
  4. Trate las piezas de PVA NM como se describe en los pasos 2.2 a 2.4.
  5. Presione suavemente el pocillo del inserto sobre la pieza de PVA NM de modo que la parte inferior del pocillo del inserto quede frente al lado de la nanofibra de la pieza de membrana. Agregue una gota de agua destilada al centro del pozo y use pinzas para quitar el papel de aluminio. Coloque el inserto en una placa nueva de 24 pocillos y deje que la membrana se seque.
  6. Al colocar la pieza PCL NM en el pozo inferior, asegúrese de sumergir la punta de 200 μL en la mezcla de PDMS y puntearla con precisión en las cuatro esquinas y en el centro.
  7. Coloque la placa en el calentador de correderas y deje que el PDMS se endurezca durante 5-7 minutos para garantizar la calidad del ensamblaje.
  8. Coloque la pieza de PCL NM en el pocillo que contiene PDMS, con el lado de la nanofibra de la membrana unido al PDMS. Use un cepillo pequeño y limpio para presionar ligeramente el lado del papel de aluminio de la pieza de membrana para una fijación completa. Agregue 0,2 mL de etanol al 70% al pocillo para quitar fácilmente el papel de aluminio.
  9. Esterilice el inserto y el pocillo inferior en la configuración de pocillo trans bajo luz ultravioleta durante la noche.
    NOTA: El PDMS mezclado se puede almacenar a -20 °C para su uso posterior. PRECAUCIÓN: La placa unida a la membrana nanofibrosa PCL se puede almacenar seca, pero debe humedecerse con etanol al 70% antes de su uso.
  10. Al día siguiente, lave bien el inserto y el fondo añadiendo 200 μL y 500 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS), respectivamente, durante 3 x 10 min. El inserto y el pocillo inferior están listos para usar.

5. Siembra celular y montaje de dos capas para el modelo de cocultivo

NOTA: Las células MLE-12 se cultivaron en 1x Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de antibiótico penicilina/estreptomicina. Las células NIH3T3 se cultivaron en 1x DMEM alto en glucosa con 10% de FBS y 1% de antibiótico penicilina/estreptomicina.

  1. Mantener las células en una placa de cultivo de 150 mm. Cuando estén confluentes en un 70-80%, lavar las células con 10 mL de PBS 1x y tripsinarlas con 2 mL de solución precalentada de tripsina/EDTA al 0,05% durante 3 min a 37 °C.
  2. Golpee suavemente la placa para desalojar las células del fondo y luego agregue 8 ml de medio de cultivo completo a cada tipo de célula para neutralizar la enzima tripsina. Transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 50 ml, centrifugue a 400 × g durante 5 minutos y deseche el sobrenadante. Tiña las células con Cell-Tracker para observar la distribución de las células sembradas en el NM (ver sección 6 para más detalles).
  3. Vuelva a suspender el pellet de celda en 5 mL de medio DMEM/F12 completo. Determine el número de células y ajústelo a 6 × 10,6 células MLE-12/ml y 8 × 105 células NIH3T3/ml.
    NOTA: Los medios DMEM/F12 completos se utilizan para el cocultivo con células MLE-12 y NIH3T3.
  4. Llene el pocillo inferior con 500 μL de medio DMEM/F12 completo (el pocillo sin PCL). Transfiera el inserto unido a la membrana nanofibrosa de PVA al pocillo trans y agregue 50 μL de suspensión celular MLE-12. Incubar las células a 37 °C y 5% de CO2.
  5. Al mismo tiempo, llene el pocillo inferior unido a la membrana nanofibrosa PCL con 500 μL de suspensión celular NIH3T3 e incube las células a 37 °C y 5% de CO2.
  6. Después de 2 h, ensamble el inserto que contiene la celda MLE-12 y el pocillo inferior que contiene la celda NIH3T3 en la configuración de pocillo trans. Este es el modelo de cocultivo con células MLE-12 como capa superior y células NIH3T3 como capa inferior. Cocultive las células en las membranas de dos capas durante el tiempo deseado.

6. Ensayo de distribución celular

  1. Prepare 5 μM de solución roja y verde de Cell-Tracker en un volumen total de 2 mL de medio DMEM/F12 completo.
  2. Después de la tripsinización, mezcle las células MLE-12 con la solución roja de Cell-Tracker previamente preparada y NIH3T3 con la solución verde de Cell-Tracker. Incubar las células a 37 °C y 5% de CO2 durante 30 min para garantizar un marcaje celular óptimo. Añadir 8 mL de medio DMEM/F12 completo a las muestras y centrifugar a 400 × g durante 5 min.
    NOTA: Cell Tracker no puede afectar la viabilidad y proliferación celular. Por lo tanto, las células teñidas con Cell-Tracker se pueden cultivar hasta la confluencia. La intensidad de fluorescencia en las células teñidas puede reducirse 4-5 días después del cultivo.
  3. Repita los pasos 5.3 a 5.6.
  4. Mientras observa bajo un microscopio confocal, transfiera el pocillo de inserto de la placa de 24 pocillos a una placa de 12 pocillos.
    NOTA: Esto minimiza la distancia entre la lente del objetivo y las células, lo que permite observar la morfología de la célula.

7. Observaciones confocales de células cocultivadas en 3D

NOTA: La unión de las células epiteliales a un NM de PVA es débil en comparación con la de los fibroblastos a un NM de PCL. Deseche los medios viejos manualmente mediante aspiración con pipeta y agregue nuevos medios o soluciones suavemente a la pared de los pocillos. Durante el proceso de tinción, trate de no dejar que las membranas se sequen.

NOTA: La unión celular puede mejorarse mediante el recubrimiento de laminina o la incorporación de péptidos de motivos de unión a integrinas en nanofibras de PVA19.

  1. Transfiera el inserto a una nueva placa de 24 pocillos. Deseche el medio viejo y agregue 150 μL de una solución de paraformaldehído (PFA) al 4%. Incubar durante 15 min a temperatura ambiente.
  2. Retirar la solución de PFA al 4% y lavar las células adheridas con 150 μL de 1x PBS.
  3. Para el bloqueo y la permeabilización, añadir 150 μL de suero de cabra normal al 5% y Triton X-100 al 0,2% diluido en 1x PBS e incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
  4. Prepare el anti-zona occludens conjugado con Alexa Fluor 594 Ab (1:400) y Phalloidin-iFlour 488 (1:1,000) diluyéndolos en el reactivo diluyente de anticuerpos. Retire la solución de bloqueo, añada 150 μL de la solución de fluoróforo por pocillo e incube durante 1 h a temperatura ambiente.
    NOTA: Prepare las soluciones de anticuerpos con la máxima precisión, ya que tendrá un impacto directo en la calidad de los resultados. Evite la exposición a la luz.
  5. Deseche la solución de anticuerpos y lave las células con 150 μL de 1x PBS durante 10 min.
  6. Añadir 150 μL de Hoechst 33342 diluido en 1x PBS (1:1.000) e incubar durante 10 min; Evite la exposición a la luz.
  7. Retire la solución de Hoechst 33342 y lave las células adheridas con 150 μL de 1x PBS durante 10 min.
  8. Prepare un portaobjetos de vidrio limpio y agregue una cantidad precisa de gel de montaje acuoso. Utilice pinzas con puntas puntiagudas para separar delicadamente las membranas del borde circundante. Coloque las membranas en el gel de montaje, asegurándose de que el lado que contiene las células esté hacia arriba. Agregue una cantidad precisa de gel de montaje y cúbralo con un portaobjetos de cubierta. Selle los portaobjetos con esmalte de uñas, asegurando un sellado preciso y completo.
  9. Observe las células bajo un microscopio confocal utilizando los siguientes ajustes de imagen: Control de potencia láser: 405 Intensidad 10; Control de potencia láser: 488 Intensidad 10; Control de potencia láser: 561 Intensidad 10; Sensibilidad del detector: 420LP (valor 600); Sensibilidad del detector: 525/50 (valor 700); Sensibilidad del detector: 561LP (valor 750).

8. Ensayo de la unión celular a las nanofibras

  1. Deseche el medio viejo y lave las células con 150 μL de 1x PBS.
  2. Fijar las células con 150 μL de GA al 3% diluido en 1x PBS durante 1 h a temperatura ambiente.
  3. Lavar las células con 150 μL de 1x PBS en 10 min.
  4. Fijar las células secundariamente añadiendo 150 μL de tetróxido de osmio al 1% (OsO4) diluido en 1x PBS durante 1 h.
    PRECAUCIÓN: El OsO4 y su vapor son dañinos. Debe usarse en una campana extractora.
  5. Deseche la solución y lave las células con 300 μL de 1x PBS durante 2 x 10 min.
  6. Deshidrate las células con etanol graduado de 50%, 70%, 90% y 95% a 100%, durante 10 minutos en cada paso. Realice el último paso de deshidratación agregando etanol fresco 100% durante 10 min.
  7. Seque completamente las células y membranas al aire. Use pinzas con las puntas puntiagudas para separar las membranas y coloque las membranas en el portamuestras con un grifo de dos lados. Realice la pulverización catódica de iones durante 5 minutos antes de observar las celdas bajo SEM con un aumento de 2.000x.

9. Ensayo de crecimiento celular

NOTA: En este protocolo, el ensayo CCK-8 se utiliza para cuantificar la tasa de crecimiento celular siguiendo las instrucciones del fabricante.

  1. Prepare la mezcla CCK-8 mezclando 9 partes de DMEM/F12 precalentado (por volumen) con 1 parte del reactivo CCK-8. Después de retirar el medio de cultivo antiguo, añada 150 μL de la mezcla CCK-8 al pocillo que contiene la célula.
  2. Transfiera el inserto a la nueva placa de 24 pocillos para separarlo del pocillo inferior que contiene las celdas. Incubar las células durante 45 min a 37 °C y 5% de CO2.
  3. Recoja el sobrenadante y transfiéralo a un tubo de 1,5 mL. Centrifugar a 1.800 × g durante 3 min.
  4. Añada 100 μL del sobrenadante del tubo de microcentrífuga a la placa de 96 pocillos. Densidad óptica de lectura (OD) a 450 nm.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe los pasos críticos para la coculturión de células epiteliales pulmonares MLE-12 y fibroblastos NIH3T3 mediante la construcción de un modelo de dos capas basado en membrana nanofibrosa (Figura 1). Este modelo se adapta a la obtención de imágenes de células vivas, la inmunohistoquímica y el análisis cuantitativo de puntos finales de células cocultivadas. También se pueden utilizar otros tipos de células optimizando la densidad celular y las condiciones de crecimiento.

SEM muestra la distribución uniforme de las nanofibras de PVA fabricadas sin ninguna formación de cordones (Figura 2A). El diámetro de las nanofibras de PVA osciló entre 150 nm y 230 nm (180 ± 25 nm, media ± desviación estándar (DE)). Las nanofibras en las NM de PCL electrohiladas estaban orientadas aleatoriamente y estructuralmente se parecían al colágeno (Figura 2B). La mayoría de las fibras de los NM PCL tenían un diámetro de entre 300 nm y 7 μm (3,8 ± 2,5 μm). Por lo tanto, la membrana nanofibrosa de PVA tenía tamaños de poro más pequeños que la membrana nanofibrosa de PCL.

Antes de la siembra, las células MLE-12 y NIH3T3 se tiñeron con Cell-Tracker rojo y verde, respectivamente, y se monitorizaron durante todo el proceso de cocultivo. Como se muestra en la Figura 3, se pudo observar claramente la distribución espacial de las células MLE-12 en la cámara de inserción y de las células NIH3T3 en la cámara inferior. El análisis de apilamiento de focos reveló que las células NIH3T3 se dispersaron y detectaron a diferentes profundidades (102 ± 20 μm), mientras que las células MLE-12 formaron capas con un espesor de 80 ± 10 μm. Las células NIH3T3 se infiltran en la membrana nanofibrosa de PCL y se extienden a lo largo de los ejes de las nanofibras, mientras que las células MLE-12 se adhieren a la superficie de la membrana nanofibrosa de PVA y exhiben una agregación (Figura 4). A continuación, examinamos la organización del citoesqueleto de las células NIH3T3 y las células MLE-12 mediante tinción de actina. Las células NIH3T3 cultivadas en membrana nanofibrosa PCL muestran una distribución proyectil de filamentos de actina que se asemejan a las células en el tejido, y la tinción de actina en células MLE-12 cultivadas en membrana nanofibrosa de PVA muestra agregados redondos sin propagación celular (Figura 5).

Se comparó la distribución y el patrón de crecimiento de las células MLE-12 en monocultivo y cocultivo. Las células teñidas de rojo con Cell-Tracker en monocultivo en los NM de PVA formaron agregados, pero las células en condición de cocultivo mantuvieron una distribución uniforme en la membrana (Figura 6A). En un análisis 3D de imágenes de microscopía confocal, el patrón de crecimiento de las células MLE-12 cocultivadas en los NM de PVA muestra una adhesión en capas de las células cultivadas a la membrana con una mayor densidad celular confluente, en comparación con las células cultivadas en ausencia de fibroblastos (Figura 6B). Además, la adhesión célula a célula y la expresión de ocludina zonal (ZO)-1 en las superficies celulares (flecha indicada), pero no de los agregados celulares, fueron más evidentes en la condición de cocultivo que en el cultivo sin fibroblastos (Figura 6C).

La proliferación de células en las membranas se midió mediante el ensayo CCK-8. La proliferación de células NIH3T3 y MLE-12 aumentó con el tiempo (Figura 7). Sin embargo, se observaron tasas de crecimiento más bajas de las células en las membranas que en una placa de cultivo (datos no mostrados). Las células NIH3T3 y MLE-12 cocultivadas en NM muestran una tasa de crecimiento estable en comparación con las células monocultivadas en una placa de cultivo.

figure-results-1
Figura 1: Esquema para ilustrar el método de cocultivo de fibroblastos NIH3T3 y células epiteliales MLE-12 en el sistema de dos capas basado en andamios. Abreviaturas: PVA = alcohol polivinílico; PCL = poli(ε-caprolactona). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Estructura de las nanofibras de PVA y PCL. Las membranas nanofibrosas de (A) PVA y (B) PCL se produjeron mediante electrohilado. La estructura y el diámetro de las nanofibras se miden mediante SEM de las superficies de las membranas. Barras de escala = 1 μm (A), 10 μm (B). Abreviaturas: PVA = alcohol polivinílico; PCL = poli(ε-caprolactona). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-3
Figura 3: En un sistema de cocultivo, la distribución espacial de las células NIH3T3 en la membrana nanofibrosa PCL y las células MLE-12 en la membrana nanofibrosa PVA. Las células NIH3T3 (4 × 105) se tiñeron con Cell-Tracker Green, y las células MLE-12 (3 × 105) se tiñeron con Cell-Tracker Red. Las células sembradas se cultivaron durante 24 h y se observaron utilizando una imagen de apilamiento en Z de un microscopio confocal. Los números se indican en μm; Las flechas muestran las dimensiones con x (ancho), y (largo), z (profundidad). Abreviaturas: PVA = alcohol polivinílico; PCL = poli(ε-caprolactona). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-4
Figura 4: Adhesión y morfología de las células NIH3T3 en la membrana nanofibrosa PCL y de las células MLE-12 en la membrana nanofibrosa PVA. Las células se cultivaron en las membranas durante 24 h y se observaron mediante SEM con un aumento de 2.000x. Barras de escala = 15 μm. Abreviaturas: PVA = alcohol polivinílico; PCL = poli(ε-caprolactona). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-5
Figura 5: Fibras de estrés de actina en células NIH3T3 en la membrana nanofibrosa PCL y células MLE-12 en membrana nanofibrosa PVA. Las células NIH3T3 (4 × 105) y las células MLE-12 (3 × 105 células) se sembraron en las membranas nanofibrosas de PCL y PVA, respectivamente. Después de 48 h de cultivo, las células se tiñeron con faloidina-iFlour 488 y se observaron mediante microscopía confocal. Barras de escala = 50 μm. Abreviaturas: PVA = alcohol polivinílico; PCL = poli(ε-caprolactona); FITC = isotiocianato de fluoresceína. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-6
Figura 6: Patrón de crecimiento de células MLE-12 cocultivadas en membrana nanofibrosa de PVA. (A) Las células MLE-12 teñidas en rojo con Cell-Tracker (3 × 105 células) se sembraron en la membrana nanofibrosa de PVA y se cultivaron solas (células -NIH3T3) y con células NIH3T3 en un sistema de dos capas (células +NIH3T3) durante 48 h. (B) Las células MLE-12 monocultivadas y cocultivadas durante 48 h se tiñeron con Hoechst 33342 (azul) y Phalloidin-iFlour 488 y se observaron utilizando un microscopio confocal. Las imágenes 3D se muestran utilizando la función de superficie del software Imaris. (C) Las células MLE-12 se cultivaron durante 48 h y se marcaron con fluorescencia con Phalloidin-iFlour 488 y anticuerpo anti-ZO-1 (rojo). Barras de escala = 50 μm. Abreviaturas: PVA = alcohol polivinílico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-7
Figura 7: Tasa de crecimiento de las células en un sistema de cocultivo de dos capas. Las células NIH3T3 (4, ×, 10,5) y las células MLE-12 (3, ×, 10,5) se cocultivan durante el tiempo indicado. El crecimiento celular en el inserto y el pocillo inferior se mide mediante el ensayo CCK-8. Los datos se presentan como media ± DE (n = 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La transición de la cultura 2D a los modelos de cultivo 3D representa un avance significativo en el desarrollo de modelos de cocultivo in vitro . Un modelo de cultivo 3D debe imitar el microambiente tisular en el que las células pueden proliferar, agregarse y diferenciarse22. El uso de modelos de cocultivo 3D basados en andamios mejora la replicación de la arquitectura de tejidos. En este estudio, un sistema trans-well basado en NM proporciona cocultivo indirecto en 3D de dos tipos de células. El PCL NM con poros grandes en la cámara inferior permite la infiltración celular e imita la matriz intersticial. Este andamio apoya el crecimiento y la organización espacial de los fibroblastos. El uso de una membrana nanofibrosa de PVA en la cámara superior permite la formación de células epiteliales MLE-12 en la capa. El diámetro y el tamaño de poro de la membrana nanofibrosa de PVA la convierten en un sustrato ideal para apoyar la adhesión y el crecimiento de las células epiteliales, que imita a las células epiteliales de la membrana basal en los tejidos epiteliales19.

Las proteínas adhesivas celulares, como la fibronectina y la laminina, son proteínas clave en la MEC, que conectan las células con las fibrillas de colágeno23. Las células epiteliales interactúan con la laminina a través de los receptores de integrinas en su superficie18. Las células MLE-12 sembradas en los NM de PVA se adhirieron y crecieron tridimensionalmente en la membrana. Sin embargo, la unión de las células epiteliales al PVA NM poroso fue baja, lo que resultó en agregación porque carecen de motivos biológicos específicos que interactúen con las células cultivadas. En nuestro sistema de cocultivo, el contacto directo célula-célula entre las células NIH3T3 y MLE-12 está ausente, y la comunicación se produce exclusivamente a través de la señalización paracrina. La presencia de células NIH3T3 cocultivadas puede estabilizar la unión de las células MLE-12 a la membrana durante todo el período de cultivo. Esta estabilización puede atribuirse a la secreción de factores solubles por parte de los fibroblastos, incluyendo colágeno, fibronectina, laminina y varios factores de crecimiento24. En comparación, en un modelo tumoral con cocultivo directo de fibroblastos y células cancerosas en un andamio nanofibroso PCL, los fibroblastos alteran las propiedades de la MEC a través de la remodelación de la matriz25.

Las células epiteliales descansan sobre una membrana basal que actúa como soporte de crecimiento y capa selectivamente permeable. Actualmente se están desarrollando varias estrategias tecnológicas, incluida la tecnología de organoides, para crear modelos complejos en 3D de tejidos epiteliales26. Sin embargo, la estructura de los organoides dificulta el uso de ensayos convencionales27. Además, la microscopía convencional para la recolección de datos experimentales se complica por el hecho de que los organoides se cultivan mientras están incrustados en una matriz de hidrogel3D 27. En este estudio, la cámara de inserción se separó de la cámara inferior para facilitar la observación precisa de las células epiteliales cultivadas en PVA NM. Además, los organoides 3D se producen por la diferenciación de las células madre. Así, el cultivo de células madre lleva mucho tiempo y es un procedimiento complejo en comparación con un sistema de cocultivo, y se reporta la heterogeneidad de los organoides28.

En comparación con el monocultivo, el cocultivo de células epiteliales y fibroblastos mejora la adhesión al andamio y mantiene el crecimiento y la función estables de las células epiteliales cultivadas. Además, los materiales suplementarios, incluidos los factores de crecimiento y las citocinas, no son necesarios en el medio de cultivo debido a los factores solubles secretados por los fibroblastos cocultivados. A pesar de las ventajas de utilizar andamios nanofibrosos en el cocultivo celular al proporcionar soporte estructural, no pueden proporcionar ECM alrededor de las células de cultivo en comparación con los hidrogeles biocompatibles29. Por lo tanto, esta limitación se puede lograr utilizando celdas en NM con hidrogeles superpuestos.

En conclusión, un sistema simple de cocultivo con insertos para el cultivo simultáneo de fibroblastos y células epiteliales es crucial en varios contextos fisiológicos y farmacológicos, incluida la regeneración de tejido epitelial, el microambiente tumoral, el ensayo de toxicidad y la prueba de actividad del fármaco. Se instrumentará y diseñará un sistema de cocultivo 3D basado en membranas nanofibrosas para estudios de cribado de absorción y transporte de fármacos de alto rendimiento.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por una subvención del Proyecto de Investigación y Desarrollo de Tecnología Sanitaria de Corea a través del Instituto de Desarrollo de la Industria de la Salud de Corea (KHIDI), financiado por el Ministerio de Salud y Bienestar de la República de Corea (HR16C0001); el Proyecto de Mejora de la Capacidad de Investigación en Ciencias Básicas a través de la subvención del Instituto de Ciencias Básicas de Corea (Centro Nacional de Instalaciones y Equipos de Investigación) financiado por el Ministerio de Educación (2019R1A6C1010003); y subvenciones de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiadas por el Gobierno de Corea (MSIT) (2022R1A4A5032702).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0.05% Tripsina/EDTAWelgeneLS015-01
100x Penicilina/EstreptomicinaGibco10378016
20x PBSLPS soluciónCBP007A
% ParaformaldehídoBiosesangPC2031-050-00
Alexa Fluor-594 anticuerpo conjugado ZO-1Invitrogen339194
Diluyente de anticuerpos OP QuantoEpredia10129-576
Kit de ensayo CCK-8DonginbioCCK-3000
Placa de cultivo celular (150x20)SPL20151
CellTracker Verde CMFDAInvitrogenC7025
CellTracker Rojo CMTPXInvitrogenC34552
CloroformoSamchunC0584
Tubo cónicoSPL50050
CubreobjetosCorningCLS2980245
DMEM alta glucosaWelgeneLM001-05
DMEM/F12WelgeneLM 002-05
DURAN Bases de desecador con brida plana, rosca de tornilloDWK Life Sciences 7.022 260
DURAN Tapa y desecador de vidrio Llave de pasoDaihan ScienceSM.2444061
DURAN Llave de paso, con husillo de PTFEDWK Life Sciences 
Máquina de electrohiladoNanoNC ESR200RD
Alcohol etílico,Pure Sigma Aldrich 459844
FBSSigma AldrichTMS-013-BKR 
Módulo de escáner confocal láser de fluorescencia K1-fluoSistemas
Gel / montajeBiomeda Corp.M01
Solución de glutaraldehídoSigma Aldrich340855
Hoechst 33342InvitrogenH1399
Boquilla metálica 27GNanoNC
Esmalte de uñasNature republic
Suero de cabra normalVector LaboratoriesS-1000
Tetróxido de osmioSigma Aldrich201030
Phalloidin-iFlour 488abcamab176753
Cerradura de Syringe_Lure de plástico (10 mL)HENKE SASS WOLFAL10
Poli(ácido acrílico)Sigma Aldrich323667
Poli(alcohol vinílico)Sigma Aldrich341584
PolicaprolactonaSigma Aldrich440744
Pure HCLDuksan1129
Microscopía electrónica de barridoSECSNE-4500M
Portaobjetos de vidrioMarienfeld SuperiorK15663717
Sylgard 184 setomniscienceOMNI.05255
Synergy H1 Lector multimodoBiotek
Triton X-100Sigma AldrichX100
410322671de nanoscopio

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Development of an in vitro co-culture model to mimic the human intestine in healthy and diseased state. Toxicol In Vitro. 45 (Pt 1), 31-43 (2017).">Kämpfer, A. A. M., et al. Development of an in vitro co-culture model to mimic the human intestine in healthy and diseased state. Toxicol In Vitro. 45 (Pt 1), 31-43 (2017).
  2. Three-dimensional organotypic co-culture model of intestinal epithelial cells and macrophages to study Salmonella enterica colonization patterns. npj Microgravity. 3, 10(2017).">Barrila, J., et al. Three-dimensional organotypic co-culture model of intestinal epithelial cells and macrophages to study Salmonella enterica colonization patterns. npj Microgravity. 3, 10(2017).
  3. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discov Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).">Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discov Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  4. A novel 3D in vitro culture model to study stromal epithelial interactions in the mammary gland. Tissue Eng Part C: Methods. 14, 261-271 (2008).">Krause, S., et al. A novel 3D in vitro culture model to study stromal epithelial interactions in the mammary gland. Tissue Eng Part C: Methods. 14, 261-271 (2008).
  5. Three-dimensional cell cultures: The bridge between in vitro and in vivo models. Int J Mol Sci. 24 (15), 12046(2023).">Urzì, O., et al. Three-dimensional cell cultures: The bridge between in vitro and in vivo models. Int J Mol Sci. 24 (15), 12046(2023).
  6. Epithelial cell coculture models for studying infectious diseases: benefits and limitations. J Biomed Biotech. 2011, 852419(2011).">Duell, B. L., Cripps, A. W., Schembri, M. A., Ulett, G. C. Epithelial cell coculture models for studying infectious diseases: benefits and limitations. J Biomed Biotech. 2011, 852419(2011).
  7. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. J. R. Soc. Interface. 11 (96), 20140065(2014).">Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. J. R. Soc. Interface. 11 (96), 20140065(2014).
  8. From 2D to 3D co-culture systems: A review of co-culture models to study the neural cells interaction. Int J Mol Sci. 23 (21), 13116(2022).">Liu, R., et al. From 2D to 3D co-culture systems: A review of co-culture models to study the neural cells interaction. Int J Mol Sci. 23 (21), 13116(2022).
  9. Impact of culture medium on cellular interactions in in vitro co-culture systems. Front Bioeng Biotechnol. 8, 911(2020).">Vis, M. A. M., Ito, K., Hofmann, S. Impact of culture medium on cellular interactions in in vitro co-culture systems. Front Bioeng Biotechnol. 8, 911(2020).
  10. Design of biomimetic cellular scaffolds for co-culture system and their application. J Tissue Eng. 8, 2041731417724640(2017).">Kook, Y. M., Jeong, Y., Lee, K., Koh, W. G. Design of biomimetic cellular scaffolds for co-culture system and their application. J Tissue Eng. 8, 2041731417724640(2017).
  11. Nanofibrous scaffolds for biomedical applications. Nanoscale. 10 (26), 12228-12255 (2018).">Stocco, T. D., et al. Nanofibrous scaffolds for biomedical applications. Nanoscale. 10 (26), 12228-12255 (2018).
  12. Progress in electrospun composite nanofibers: composition, performance and applications for tissue engineering. J Mater Chem B. 7 (45), 7075-7089 (2019).">Gao, X., Han, S., Zhang, R., Liu, G., Wu, J. Progress in electrospun composite nanofibers: composition, performance and applications for tissue engineering. J Mater Chem B. 7 (45), 7075-7089 (2019).
  13. Three-dimensional culture and interaction of cancer cells and dendritic cells in an electrospun nano-submicron hybrid fibrous scaffold. Int J Nanomedicine. 11, 823-835 (2016).">Kim, T. E., et al. Three-dimensional culture and interaction of cancer cells and dendritic cells in an electrospun nano-submicron hybrid fibrous scaffold. Int J Nanomedicine. 11, 823-835 (2016).
  14. Coculturing of endothelial and cancer cells in a nanofibrous scaffold-based two-layer system. Int J Mol Sci. 21 (11), 4128(2020).">Oh, Y. S., Choi, M. H., Shin, J. I., Maza, P. A. M. A., Kwak, J. Y. Coculturing of endothelial and cancer cells in a nanofibrous scaffold-based two-layer system. Int J Mol Sci. 21 (11), 4128(2020).
  15. Bacterial infection-mimicking three-dimensional phagocytosis and chemotaxis in electrospun poly(ε-caprolactone) nanofibrous membrane. Membranes. 11 (8), 569(2021).">Lee, S. J., et al. Bacterial infection-mimicking three-dimensional phagocytosis and chemotaxis in electrospun poly(ε-caprolactone) nanofibrous membrane. Membranes. 11 (8), 569(2021).
  16. Fibroblasts: The arbiters of extracellular matrix remodeling. Matrix Biol. 91-92, 1-7 (2020).">DeLeon-Pennell, K. Y., Barker, T. H., Lindsey, M. L. Fibroblasts: The arbiters of extracellular matrix remodeling. Matrix Biol. 91-92, 1-7 (2020).
  17. Mammary fibroblasts regulate morphogenesis of normal and tumorigenic breast epithelial cells by mechanical and paracrine signals. Cancer Lett. 325 (2), 175-188 (2012).">Lühr, I., et al. Mammary fibroblasts regulate morphogenesis of normal and tumorigenic breast epithelial cells by mechanical and paracrine signals. Cancer Lett. 325 (2), 175-188 (2012).
  18. Integrin ligands at a glance. J Cell Sci. 119 (19), 3901-3903 (2006).">Humphries, J. D., Byron, A., Humphries, M. J. Integrin ligands at a glance. J Cell Sci. 119 (19), 3901-3903 (2006).
  19. Synthetic Extracellular Matrix of Polyvinyl Alcohol Nanofibers for Three-Dimensional Cell Culture. J Funct Biomater. 15, 262(2024).">Tran, T. X. T., et al. Synthetic Extracellular Matrix of Polyvinyl Alcohol Nanofibers for Three-Dimensional Cell Culture. J Funct Biomater. 15, 262(2024).
  20. Recent advances in polyvinyl alcohol-based composite films and their applications in food packaging. Food Packaging Shelf Life. 34, 100991(2022).">Oun, A. A., Shin, G. H., Rhim, J. -W., Kim, J. T. Recent advances in polyvinyl alcohol-based composite films and their applications in food packaging. Food Packaging Shelf Life. 34, 100991(2022).
  21. Applications of poly(caprolactone)-based nanofibre electrospun scaffolds in tissue engineering and regenerative medicine. Curr Stem Cell Res Ther. 16 (4), 414-442 (2021).">Zhang, W., et al. Applications of poly(caprolactone)-based nanofibre electrospun scaffolds in tissue engineering and regenerative medicine. Curr Stem Cell Res Ther. 16 (4), 414-442 (2021).
  22. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Front Mol Biosci. 7, 33(2020).">Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Front Mol Biosci. 7, 33(2020).
  23. From cell-ECM interactions to tissue engineering. J Cell Physiol. 199 (2), 174-180 (2004).">Rosso, F., Giordano, A., Barbarisi, M., Barbarisi, A. From cell-ECM interactions to tissue engineering. J Cell Physiol. 199 (2), 174-180 (2004).
  24. Identification of extracellular matrix proteins secreted by human dermal fibroblasts cultured in 3D electrospun scaffolds. Sci Rep. 11, 6655(2021).">Malakpour-Permlid, A., et al. Identification of extracellular matrix proteins secreted by human dermal fibroblasts cultured in 3D electrospun scaffolds. Sci Rep. 11, 6655(2021).
  25. Three-dimensional cell culture: a powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncol Lett. 14 (6), 6999-7010 (2017).">Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: a powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncol Lett. 14 (6), 6999-7010 (2017).
  26. Mimicking epithelial tissues in three-dimensional cell culture models. Front Bioeng Biotechnol. 6, 197(2018).">Torras, N., García-Díaz, M., Fernández-Majada, V., Martínez, E. Mimicking epithelial tissues in three-dimensional cell culture models. Front Bioeng Biotechnol. 6, 197(2018).
  27. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunol. 8 (2), 352-361 (2015).">Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunol. 8 (2), 352-361 (2015).
  28. The hope and the hype of organoid research. Development. 144 (6), 938-941 (2017).">Huch, M., Knoblich, J. A., Lutolf, M. P., Martinez-Arias, A. The hope and the hype of organoid research. Development. 144 (6), 938-941 (2017).
  29. Advances in biomimetic hydrogels for organoid culture. Chem Commun. (Camb). 59 (64), 9675-9686 (2023).">Luo, L., Liu, L., Ding, Y., Dong, Y., Ma, M. Advances in biomimetic hydrogels for organoid culture. Chem Commun. (Camb). 59 (64), 9675-9686 (2023).

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Three Dimensional CocultureEpithelial CellsNanofibrous MembranesElectrospinning TechniquePolyvinyl Alcohol MembranePolycaprolactone MembraneFibroblast CocultureParacrine SignalingConfocal MicroscopyScanning Electron Microscopy

Artículos relacionados