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Artículo de método

Establecimiento de un módulo de cocultivo tridimensional de células epiteliales utilizando membranas nanofibrosas

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DOI:

10.3791/67780

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27 de diciembre de 2024

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, School of Medicine, Ajou University, 2Department of Medical Sciences, The Graduate School, Ajou University, 33D Immune System Imaging Core Center, Ajou University

En este artículo

Resumen

Aquí, demostramos cómo las células epiteliales cultivadas con fibroblastos en el sistema de dos capas basado en membranas nanofibrosas pueden adherirse y crecer de manera estable en la membrana.

Resumen

Los obstáculos técnicos en un cultivo de células epiteliales incluyen la desdiferenciación y la pérdida de función. Los métodos biomiméticos de cultivo celular tridimensional (3D) pueden mejorar la eficiencia del cultivo celular. Este estudio presenta un sistema avanzado de cultivo de dos capas destinado a cultivar células epiteliales como capas similares a tejidos con el cultivo de fibroblastos dentro de un entorno 3D. Las membranas nanofibrosas (NM) de alcohol polivinílico (PVA) y poli(ε-caprolactona) (PCL) se fabricaron mediante electrohilado y se utilizaron como matriz extracelular fisiológicamente relevante para el cultivo de células epiteliales y fibroblastos, respectivamente. En los pocillos de inserción superiores, las células epiteliales pulmonares se cultivaron en el PVA NM, y en las cámaras inferiores, los fibroblastos se cultivaron en el PCL NM. Esta configuración elimina el contacto directo célula-célula y facilita el examen de la señalización paracrina mediada por factores solubles. Se empleó la microscopía confocal para analizar la distribución, el patrón de crecimiento y la expresión de proteínas intracelulares, incluida la zona oclusiva en las células epiteliales. Las técnicas de apilamiento en Z permitieron reconstrucciones 3D detalladas, proporcionando información precisa sobre la integridad de las uniones estrechas y la organización espacial dentro de la capa epitelial. La microscopía electrónica de barrido (SEM) evaluó las características morfológicas de los tipos celulares en las membranas nanofibrosas. Las imágenes SEM revelaron intrincadas estructuras de la superficie celular e interacciones con las nanofibras, lo que ofrece una perspectiva integral sobre la arquitectura celular y la interacción celular con la estructura nanofibrosa. El ensayo Cell Counting Kit-8 (CCK-8) es un método sencillo para medir las tasas de crecimiento de células epiteliales y fibroblastos a lo largo del tiempo. Proporciona los comportamientos proliferativos y los posibles efectos sinérgicos de la coculturización de estas células. Estos hallazgos ponen de manifiesto la eficacia de un sistema de cocultivo con insertos simple para el cultivo simultáneo de fibroblastos y células epiteliales, que es crucial en diversos contextos fisiológicos y farmacológicos, incluida la regeneración del tejido epitelial, el microambiente tumoral con células endoteliales, inmunológicas y otras células del estroma, el ensayo de toxicidad y la prueba de actividad de fármacos.

Introducción

A lo largo de las décadas, el cultivo clásico de monocapa bidimensional (2D) ha sido esencial para comprender las infecciones, la farmacología y la toxicología 1,2. Sin embargo, es importante tener en cuenta la complejidad, las interacciones dinámicas entre las multicomposiciones y la arquitectura tridimensional (3D) del microambiente tisular. Por lo tanto, el cultivo celular 2D tiene limitaciones para imitar estructuras similares a tejidos 3,4. Por ejemplo, hay una falta de señalización de célula a célula y de célula a matriz extracelular (ECM), que es esencial en la diferenciación celular, la proliferación y las funciones celulares en el microambiente vivo. Por estas razones, se han desarrollado los sistemas de cultivos celulares en 3D5. Las células en cultivo 3D crecen e interactúan con la matriz extracelular circundante en tres dimensiones. Además, se ha desarrollado un enfoque de cocultivo en 3D, compuesto por más de un tipo de célula, para cerrar la brecha entre los modelos in vitro simplistas de tipo de una sola célula y las interacciones celulares dinámicas que ocurren in vivo6. Los sistemas de cocultivo 3D han ganado popularidad en el estudio de la comunicación célula-célula y las interacciones célula-matriz extracelular (ECM) 7,8,9,10. Los sistemas actuales de cocultivo 3D tienen varias formas y pueden separarse en cocultivo directo e indirecto 8,9. En el cocultivo directo, varias funciones celulares en células cultivadas pueden verse afectadas principalmente por el contacto directo en lugar de los efectos paracrinos. En comparación, el cocultivo indirecto tiene una mayor ventaja en la investigación de la interacción paracrina mediante el uso de barreras o capas para separar diferentes tipos de células.

Se utilizan diversos materiales y métodos para fabricar andamios biomiméticos que imitan el ECM utilizando sustancias biocompatibles y biodegradables10. La estructura nanofibrosa del andamio imita la configuración de la MEC nativa en los tejidos biológicos, proporcionando una arquitectura 3D para el cultivo celular11,12. Las membranas nanofibrosas (NMs) electrohiladas han sido utilizadas en el cocultivo directo e indirecto de diferentes tipos de células 13,14,15.

Las células epiteliales forman una barrera física de los órganos principales, mientras que los fibroblastos son células del estroma predominantes que median la remodelación de la MEC y regulan el epitelio vecino 6,16,17. Las células epiteliales y los fibroblastos interactúan con la laminina en la membrana basal y con la fibronectina en la matriz intersticial, respectivamente, a través de receptores de integrinas en la superficie celular18. Cuando las células epiteliales se cultivan en NM de poli(alcohol vinílico) (PVA) con diámetros de 150 a 250 nm y microporos, forman múltiples capas en lugar de agregados celulares y esferoides, y sus patrones de crecimiento son similares a los de las células en el tejido epitelial19. En comparación, los NMs de poli(caprolactona) (PCL) con diámetros de 400-1.500 nm y microporos de 10-50 μm proporcionan una dimensionalidad espacial similar a la matriz intersticial para el crecimiento de fibroblastos cultivados 13,14. Debido a su biocompatibilidad, las membranas de PVA y PCL son polímeros comúnmente utilizados en ingeniería de tejidos20,21.

Este estudio presenta un sistema avanzado de cultivo de dos capas que utiliza NM porosas electrohiladas para cultivar células epiteliales como capas similares a tejidos y fibroblastos dentro de una estructura 3D. El protocolo se puede dividir en cinco etapas clave: fabricación de nanofibras, post-reticulación de fibras y evaluación de la calidad, preparación del pozo de cultivo unido a la membrana, siembra de células y cocultivo en 3D, y ensayos de células cultivadas en 3D.

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Protocolo

1. Fabricación de nanofibras de PVA estables al agua

  1. Pesa 0,02 g de poli(ácido acrílico) (PAA) y 1 g de PVA, luego agrégalos a una botella de vidrio limpia que contenga una barra magnética. Agregue 7,8 mL de agua destilada a la botella, coloque la botella en un agitador de placas y ajuste la temperatura a 84 °C, la velocidad a 500 rpm y el tiempo a 12 h.
  2. Deje que el frasco se enfríe a temperatura ambiente antes de agregar 0,2 mL de glutaraldehído (GA). Coloque la botella en el agitador de placas y ajuste la velocidad a 500 rpm, el tiempo a 30 minutos y la temperatura a temperatura ambiente.
  3. Use una jeringa de 5 ml para electrohilado, separe los émbolos de los barriles y limpie los pequeños desechos de plástico dentro de los barriles y la punta de los émbolos.
  4. Use agujas para bloquear el flujo de líquido, luego vierta la solución de PVA en cada barril (volumen: 2,5-3 mL cada uno). Ensamble los émbolos y luego retire las agujas.
    NOTA: Es posible que haya una burbuja en la solución, así que espere hasta que la burbuja desaparezca. Esto tarda entre 10 y 30 minutos.
  5. Monta una nueva aguja metálica de 27 G y colócala en la máquina de electrohilado.
  6. Envuelva bien el colector con papel de aluminio.
  7. Deje que el panel del inyector vuelva a la posición original. Utilice los siguientes ajustes para la máquina: (cada bomba) volumen de inyección: 2 mL, velocidad de inyección: 6 μL/min, velocidad del rodillo: 100 rpm, distancia entre la punta y el colector: 14 cm. Compruebe el caudal de líquido de cada bomba.
  8. Haga funcionar la máquina con un potencial eléctrico de aproximadamente 12 kV.
  9. Asegúrese de que la humedad sea del 40 al 50% al principio y del 25 al 30% al final del proceso. Use un humidificador cuando la humedad disminuya y coloque platos que contengan agua destilada dentro de la máquina el día antes del electrospinning para aumentar la humedad.
    NOTA: Este es un factor crítico en la fabricación exitosa de nanofibras de PVA.
  10. Revise el flujo regularmente. Si la aguja está bloqueada, detenga temporalmente la máquina. Use una toallita de laboratorio para quitar la gota y espere hasta que aparezca la nueva gota. De lo contrario, cambie la aguja y luego continúe haciendo funcionar la máquina.
  11. El proceso de fabricación de nanofibras de PVA tarda ~ 6 h en completarse. Una vez finalizado el proceso de electrohilado, separe la lámina que contiene la estera de fibra del colector y almacene la estera de nanofibras en un desecante al vacío.

2. Tratamiento de una membrana nanofibrosa de PVA con vapor de ácido clorhídrico (HCl) y evaluación de la calidad de la fibra

NOTA: La estabilidad del agua de los NM de PVA se conserva bien después de la reacción posterior a la reticulación por vapor de HCl. Este proceso está optimizado para el grosor, el tamaño de poro y la rugosidad adecuados de los NM. El PVA es un polímero muy hidrófilo y las nanofibras de PVA electrohiladas son inestables en condiciones húmedas y en contacto con el agua. Los NM de PVA deben tratarse con vapor de HCl justo después de la fabricación del polímero PVA.

  1. Corte una estera de nanofibras en pedazos del tamaño deseado para el inserto de pocillo trans.
  2. Prepare un plato pequeño que contenga 1,5 mL de HCl puro. Coloque el plato que contiene HCl y las piezas de nanofibra dentro de una cámara de vacío y cierre la tapa.
    NOTA: El vapor de HCl se utiliza como agente de postreticulación para hacer que la nanofibra sea estable al agua.
  3. Abra la válvula conectada a la bomba de vacío, espere 10 s hasta que suba el humo de HCl y, a continuación, cierre la válvula. Tratar las membranas con humo de HCl durante 2 min.
  4. Después del tratamiento con vapor de HCl, agregue algunas gotas de agua destilada (DW) a las membranas, colóquelas en un portaobjetos de vidrio y retire la membrana de la lámina. Después de secarse al aire durante 20 minutos, las membranas se adhieren naturalmente al portaobjetos.
  5. Cubra las membranas con cinta de carbón con una capa delgada de oro con un recubridor de pulverización automática. Obtención de imágenes de microscopio electrónico de barrido (SEM).
  6. Después de la reticulación de los NM de PVA con HCl, lávelos 3 veces con 1x PBS y verifique el pH después de remojarlos en medios de cultivo para confirmar la ausencia de HCl residual.

3. Fabricación de nanofibras PCL y evaluación de la calidad de las nanofibras

  1. Pesa 1,5 g de PCL y añádelo a un frasco de vidrio limpio. Agregue 8,5 mL de cloroformo al frasco, coloque el frasco en un agitador de placas y disuelva el PCL en cloroformo durante 12 h a temperatura ambiente.
  2. Repita los pasos 1.3 a 1.9, excepto los pasos 1.7 y 1.8, ajuste la velocidad de inyección a 8 μL/min y el voltaje a 17,5 kV.
    NOTA: La fabricación de PCL tarda ~ 3.5 h en terminar.
  3. Corta un pequeño trozo de la membrana y cubre los trozos mediante el proceso de pulverización automática durante 5 min. Obtener imágenes SEM.

4. Ensamblaje de dos capas de membranas en un pozo trans

NOTA: En este protocolo, utilizamos una placa de 24 pocillos y su respectivo pocillo de inserción. El PVA NM se fija al pocillo de inserción, mientras que el PCL NM se fija al pocillo inferior.

  1. Corte una estera de nanofibras en trozos redondos, con un diámetro de 10 mm y 13 mm para los NM de PVA y PCL, respectivamente.
  2. Utilice el polidimetilsiloxano (PDMS) Sylgard 184 como agente adhesivo para unir las membranas al inserto y al pozo de la cámara. Antes de usar, mezcle Sylgard 184 Base (parte A) y Agente de curado (parte B) en un vaso de plástico en una proporción de masa de 10:1. Use un portaobjetos de vidrio limpio para mezclar vigorosamente la solución de PDMS durante 2-3 minutos hasta que toda la mezcla esté llena de burbujas. Deje que la burbuja se forme y desaparezca durante 10 minutos antes de usar; mientras tanto, deje que la corredera se caliente a 100 °C.
  3. Extienda el PDMS en un portaobjetos de vidrio y sumerja ligeramente el borde inferior del inserto en el PDMS. Mantenga el inserto bien boca abajo en el calentador de correderas para que el PDMS se endurezca (~10-15 min). Compruébelo cuidadosamente con una punta de 200 μL para asegurarse de que el PDMS no esté pegajoso.
  4. Trate las piezas de PVA NM como se describe en los pasos 2.2 a 2.4.
  5. Presione suavemente el pocillo del inserto sobre la pieza de PVA NM de modo que la parte inferior del pocillo del inserto quede frente al lado de la nanofibra de la pieza de membrana. Agregue una gota de agua destilada al centro del pozo y use pinzas para quitar el papel de aluminio. Coloque el inserto en una placa nueva de 24 pocillos y deje que la membrana se seque.
  6. Al colocar la pieza PCL NM en el pozo inferior, asegúrese de sumergir la punta de 200 μL en la mezcla de PDMS y puntearla con precisión en las cuatro esquinas y en el centro.
  7. Coloque la placa en el calentador de correderas y deje que el PDMS se endurezca durante 5-7 minutos para garantizar la calidad del ensamblaje.
  8. Coloque la pieza de PCL NM en el pocillo que contiene PDMS, con el lado de la nanofibra de la membrana unido al PDMS. Use un cepillo pequeño y limpio para presionar ligeramente el lado del papel de aluminio de la pieza de membrana para una fijación completa. Agregue 0,2 mL de etanol al 70% al pocillo para quitar fácilmente el papel de aluminio.
  9. Esterilice el inserto y el pocillo inferior en la configuración de pocillo trans bajo luz ultravioleta durante la noche.
    NOTA: El PDMS mezclado se puede almacenar a -20 °C para su uso posterior. PRECAUCIÓN: La placa unida a la membrana nanofibrosa PCL se puede almacenar seca, pero debe humedecerse con etanol al 70% antes de su uso.
  10. Al día siguiente, lave bien el inserto y el fondo añadiendo 200 μL y 500 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS), respectivamente, durante 3 x 10 min. El inserto y el pocillo inferior están listos para usar.

5. Siembra celular y montaje de dos capas para el modelo de cocultivo

NOTA: Las células MLE-12 se cultivaron en 1x Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de antibiótico penicilina/estreptomicina. Las células NIH3T3 se cultivaron en 1x DMEM alto en glucosa con 10% de FBS y 1% de antibiótico penicilina/estreptomicina.

  1. Mantener las células en una placa de cultivo de 150 mm. Cuando estén confluentes en un 70-80%, lavar las células con 10 mL de PBS 1x y tripsinarlas con 2 mL de solución precalentada de tripsina/EDTA al 0,05% durante 3 min a 37 °C.
  2. Golpee suavemente la placa para desalojar las células del fondo y luego agregue 8 ml de medio de cultivo completo a cada tipo de célula para neutralizar la enzima tripsina. Transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 50 ml, centrifugue a 400 × g durante 5 minutos y deseche el sobrenadante. Tiña las células con Cell-Tracker para observar la distribución de las células sembradas en el NM (ver sección 6 para más detalles).
  3. Vuelva a suspender el pellet de celda en 5 mL de medio DMEM/F12 completo. Determine el número de células y ajústelo a 6 × 10,6 células MLE-12/ml y 8 × 105 células NIH3T3/ml.
    NOTA: Los medios DMEM/F12 completos se utilizan para el cocultivo con células MLE-12 y NIH3T3.
  4. Llene el pocillo inferior con 500 μL de medio DMEM/F12 completo (el pocillo sin PCL). Transfiera el inserto unido a la membrana nanofibrosa de PVA al pocillo trans y agregue 50 μL de suspensión celular MLE-12. Incubar las células a 37 °C y 5% de CO2.
  5. Al mismo tiempo, llene el pocillo inferior unido a la membrana nanofibrosa PCL con 500 μL de suspensión celular NIH3T3 e incube las células a 37 °C y 5% de CO2.
  6. Después de 2 h, ensamble el inserto que contiene la celda MLE-12 y el pocillo inferior que contiene la celda NIH3T3 en la configuración de pocillo trans. Este es el modelo de cocultivo con células MLE-12 como capa superior y células NIH3T3 como capa inferior. Cocultive las células en las membranas de dos capas durante el tiempo deseado.

6. Ensayo de distribución celular

  1. Prepare 5 μM de solución roja y verde de Cell-Tracker en un volumen total de 2 mL de medio DMEM/F12 completo.
  2. Después de la tripsinización, mezcle las células MLE-12 con la solución roja de Cell-Tracker previamente preparada y NIH3T3 con la solución verde de Cell-Tracker. Incubar las células a 37 °C y 5% de CO2 durante 30 min para garantizar un marcaje celular óptimo. Añadir 8 mL de medio DMEM/F12 completo a las muestras y centrifugar a 400 × g durante 5 min.
    NOTA: Cell Tracker no puede afectar la viabilidad y proliferación celular. Por lo tanto, las células teñidas con Cell-Tracker se pueden cultivar hasta la confluencia. La intensidad de fluorescencia en las células teñidas puede reducirse 4-5 días después del cultivo.
  3. Repita los pasos 5.3 a 5.6.
  4. Mientras observa bajo un microscopio confocal, transfiera el pocillo de inserto de la placa de 24 pocillos a una placa de 12 pocillos.
    NOTA: Esto minimiza la distancia entre la lente del objetivo y las células, lo que permite observar la morfología de la célula.

7. Observaciones confocales de células cocultivadas en 3D

NOTA: La unión de las células epiteliales a un NM de PVA es débil en comparación con la de los fibroblastos a un NM de PCL. Deseche los medios viejos manualmente mediante aspiración con pipeta y agregue nuevos medios o soluciones suavemente a la pared de los pocillos. Durante el proceso de tinción, trate de no dejar que las membranas se sequen.

NOTA: La unión celular puede mejorarse mediante el recubrimiento de laminina o la incorporación de péptidos de motivos de unión a integrinas en nanofibras de PVA19.

  1. Transfiera el inserto a una nueva placa de 24 pocillos. Deseche el medio viejo y agregue 150 μL de una solución de paraformaldehído (PFA) al 4%. Incubar durante 15 min a temperatura ambiente.
  2. Retirar la solución de PFA al 4% y lavar las células adheridas con 150 μL de 1x PBS.
  3. Para el bloqueo y la permeabilización, añadir 150 μL de suero de cabra normal al 5% y Triton X-100 al 0,2% diluido en 1x PBS e incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
  4. Prepare el anti-zona occludens conjugado con Alexa Fluor 594 Ab (1:400) y Phalloidin-iFlour 488 (1:1,000) diluyéndolos en el reactivo diluyente de anticuerpos. Retire la solución de bloqueo, añada 150 μL de la solución de fluoróforo por pocillo e incube durante 1 h a temperatura ambiente.
    NOTA: Prepare las soluciones de anticuerpos con la máxima precisión, ya que tendrá un impacto directo en la calidad de los resultados. Evite la exposición a la luz.
  5. Deseche la solución de anticuerpos y lave las células con 150 μL de 1x PBS durante 10 min.
  6. Añadir 150 μL de Hoechst 33342 diluido en 1x PBS (1:1.000) e incubar durante 10 min; Evite la exposición a la luz.
  7. Retire la solución de Hoechst 33342 y lave las células adheridas con 150 μL de 1x PBS durante 10 min.
  8. Prepare un portaobjetos de vidrio limpio y agregue una cantidad precisa de gel de montaje acuoso. Utilice pinzas con puntas puntiagudas para separar delicadamente las membranas del borde circundante. Coloque las membranas en el gel de montaje, asegurándose de que el lado que contiene las células esté hacia arriba. Agregue una cantidad precisa de gel de montaje y cúbralo con un portaobjetos de cubierta. Selle los portaobjetos con esmalte de uñas, asegurando un sellado preciso y completo.
  9. Observe las células bajo un microscopio confocal utilizando los siguientes ajustes de imagen: Control de potencia láser: 405 Intensidad 10; Control de potencia láser: 488 Intensidad 10; Control de potencia láser: 561 Intensidad 10; Sensibilidad del detector: 420LP (valor 600); Sensibilidad del detector: 525/50 (valor 700); Sensibilidad del detector: 561LP (valor 750).

8. Ensayo de la unión celular a las nanofibras

  1. Deseche el medio viejo y lave las células con 150 μL de 1x PBS.
  2. Fijar las células con 150 μL de GA al 3% diluido en 1x PBS durante 1 h a temperatura ambiente.
  3. Lavar las células con 150 μL de 1x PBS en 10 min.
  4. Fijar las células secundariamente añadiendo 150 μL de tetróxido de osmio al 1% (OsO4) diluido en 1x PBS durante 1 h.
    PRECAUCIÓN: El OsO4 y su vapor son dañinos. Debe usarse en una campana extractora.
  5. Deseche la solución y lave las células con 300 μL de 1x PBS durante 2 x 10 min.
  6. Deshidrate las células con etanol graduado de 50%, 70%, 90% y 95% a 100%, durante 10 minutos en cada paso. Realice el último paso de deshidratación agregando etanol fresco 100% durante 10 min.
  7. Seque completamente las células y membranas al aire. Use pinzas con las puntas puntiagudas para separar las membranas y coloque las membranas en el portamuestras con un grifo de dos lados. Realice la pulverización catódica de iones durante 5 minutos antes de observar las celdas bajo SEM con un aumento de 2.000x.

9. Ensayo de crecimiento celular

NOTA: En este protocolo, el ensayo CCK-8 se utiliza para cuantificar la tasa de crecimiento celular siguiendo las instrucciones del fabricante.

  1. Prepare la mezcla CCK-8 mezclando 9 partes de DMEM/F12 precalentado (por volumen) con 1 parte del reactivo CCK-8. Después de retirar el medio de cultivo antiguo, añada 150 μL de la mezcla CCK-8 al pocillo que contiene la célula.
  2. Transfiera el inserto a la nueva placa de 24 pocillos para separarlo del pocillo inferior que contiene las celdas. Incubar las células durante 45 min a 37 °C y 5% de CO2.
  3. Recoja el sobrenadante y transfiéralo a un tubo de 1,5 mL. Centrifugar a 1.800 × g durante 3 min.
  4. Añada 100 μL del sobrenadante del tubo de microcentrífuga a la placa de 96 pocillos. Densidad óptica de lectura (OD) a 450 nm.

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Resultados

Este protocolo describe los pasos críticos para la coculturión de células epiteliales pulmonares MLE-12 y fibroblastos NIH3T3 mediante la construcción de un modelo de dos capas basado en membrana nanofibrosa (Figura 1). Este modelo se adapta a la obtención de imágenes de células vivas, la inmunohistoquímica y el análisis cuantitativo de puntos finales de células cocultivadas. También se pueden utilizar otros tipos de células optimizando la densidad celular y las condiciones de crecimiento.

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Discusión

La transición de la cultura 2D a los modelos de cultivo 3D representa un avance significativo en el desarrollo de modelos de cocultivo in vitro . Un modelo de cultivo 3D debe imitar el microambiente tisular en el que las células pueden proliferar, agregarse y diferenciarse22. El uso de modelos de cocultivo 3D basados en andamios mejora la replicación de la arquitectura de tejidos. En este estudio, un sistema trans-well basado en NM proporciona cocultivo i...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por una subvención del Proyecto de Investigación y Desarrollo de Tecnología Sanitaria de Corea a través del Instituto de Desarrollo de la Industria de la Salud de Corea (KHIDI), financiado por el Ministerio de Salud y Bienestar de la República de Corea (HR16C0001); el Proyecto de Mejora de la Capacidad de Investigación en Ciencias Básicas a través de la subvención del Instituto de Ciencias Básicas de Corea (Centro Nacional de Instalaciones y Equipos de Investigación) financiado por el Ministerio de Educación (2019R1A6C1010003); y subvenciones de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiadas por el Gobierno de Corea (MSIT) (2022R1A4A5032702).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0.05% Tripsina/EDTAWelgeneLS015-01
100x Penicilina/EstreptomicinaGibco10378016
20x PBSLPS soluciónCBP007A
% ParaformaldehídoBiosesangPC2031-050-00
Alexa Fluor-594 anticuerpo conjugado ZO-1Invitrogen339194
Diluyente de anticuerpos OP QuantoEpredia10129-576
Kit de ensayo CCK-8DonginbioCCK-3000
Placa de cultivo celular (150x20)SPL20151
CellTracker Verde CMFDAInvitrogenC7025
CellTracker Rojo CMTPXInvitrogenC34552
CloroformoSamchunC0584
Tubo cónicoSPL50050
CubreobjetosCorningCLS2980245
DMEM alta glucosaWelgeneLM001-05
DMEM/F12WelgeneLM 002-05
DURAN Bases de desecador con brida plana, rosca de tornilloDWK Life Sciences 7.022 260
DURAN Tapa y desecador de vidrio Llave de pasoDaihan ScienceSM.2444061
DURAN Llave de paso, con husillo de PTFEDWK Life Sciences 
Máquina de electrohiladoNanoNC ESR200RD
Alcohol etílico,Pure Sigma Aldrich 459844
FBSSigma AldrichTMS-013-BKR 
Módulo de escáner confocal láser de fluorescencia K1-fluoSistemas
Gel / montajeBiomeda Corp.M01
Solución de glutaraldehídoSigma Aldrich340855
Hoechst 33342InvitrogenH1399
Boquilla metálica 27GNanoNC
Esmalte de uñasNature republic
Suero de cabra normalVector LaboratoriesS-1000
Tetróxido de osmioSigma Aldrich201030
Phalloidin-iFlour 488abcamab176753
Cerradura de Syringe_Lure de plástico (10 mL)HENKE SASS WOLFAL10
Poli(ácido acrílico)Sigma Aldrich323667
Poli(alcohol vinílico)Sigma Aldrich341584
PolicaprolactonaSigma Aldrich440744
Pure HCLDuksan1129
Microscopía electrónica de barridoSECSNE-4500M
Portaobjetos de vidrioMarienfeld SuperiorK15663717
Sylgard 184 setomniscienceOMNI.05255
Synergy H1 Lector multimodoBiotek
Triton X-100Sigma AldrichX100
410322671de nanoscopio

Referencias

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