Una operación simplificada para el modelo murino de perforación endovascular de la hemorragia subaracnoidea

Resumen

Aquí presentamos una operación simplificada para el modelo murino de perforación endovascular de hemorragia subaracnoidea combinado con puntuación neurológica.

Resumen

El modelo de perforación endovascular se utiliza comúnmente como método para simular la hemorragia subaracnoidea (HSA) en estudios experimentales. Por completo y fiable que sea, requiere técnicas complicadas. Este protocolo simplifica el modelo con cierto detalle, combinado con la puntuación neurológica. Utilizamos una sutura de nailon para enrollar y tirar de la arteria carótida común (CCA) para bloquear temporalmente el flujo sanguíneo, a diferencia de la ligadura tradicional, que ofrece un campo operatorio claro. La utilización de la pluma de electrocauterización para fusionar los vasos sanguíneos reduce el riesgo de sangrado. Además, utilizamos un filamento con una marca negra para facilitar la determinación de la profundidad de la punción.

El avance sin obstáculos del marcador negro más allá de la bifurcación carotídea, donde la arteria carótida común (CCA) diverge en la arteria carótida interna (ACI), acompañada de una resistencia mínima, indica que el filamento ha atravesado con éxito la unión intracraneal de la arteria cerebral anterior (ACA) y la arteria cerebral media (ACM). Este fenómeno significa la posición del filamento en un punto crítico de convergencia cerebrovascular. Luego, el avance ligero del filamento hacia adelante para perforar el vaso sanguíneo permite una operación más fácil para la perforación endovascular en ratones, lo que facilita la aplicación del modelo de perforación endovascular en ratones modificados genéticamente. Esto puede ser muy crucial para la investigación molecular y la investigación y el desarrollo farmacéuticos.

Introducción

La hemorragia subaracnoidea (HSA), un subtipo grave de accidente cerebrovascular, está relacionada con altas tasas de morbilidad y mortalidad, que afectan especialmente a las personas de cincuenta y tantos años. La HSA espontánea es causada principalmente por la rotura de aneurismas intracraneales, que ocurre predominantemente en el círculo de Willis ^1,2. Clínicamente, los pacientes a menudo presentan dolores de cabeza en trueno, disfunción neurológica y una rápida disminución de la conciencia³. A pesar de los avances en los cuidados neurocríticos, casi el 40% de los pacientes mueren en el plazo de un mes tras la hemorragia^. Pueden ocurrir varias complicaciones secundarias después de la HSA aneurismática, que conduce a un deterioro neurológico progresivo. Sin embargo, la fisiopatología y las características clínicas de la HSA aún son poco conocidas.

Por lo tanto, para comprender mejor los mecanismos subyacentes y mejorar las estrategias terapéuticas, son indispensables modelos completos y fiables en animales pequeños. Hasta la fecha, se han propuesto numerosos protocolos para establecer modelos de HAS. Por ejemplo, un enfoque consiste en inyectar sangre autóloga en la cisterna magna. Otro protocolo modificado implica dos inyecciones separadas, una en la cisterna magna y la otra en la cisterna de quiasma óptico. La inyección de sangre autóloga ha ganado una adopción generalizada debido a su simplicidad técnica y tasa de mortalidad favorable ^5,6. Para lograr la posibilidad de utilizar un animal de laboratorio más pequeño y menos costoso, Barry et al. describieron el primer modelo de SAH en ratas en 1979 que consistía en perforar la arteria basilar con microelectrodos de tungsteno después de extraer el cráneo⁷.

En 1995, se presentó otro modelo de perforación endovascular, una versión modificada del modelo Zea-Longa de isquemia cerebral, cuya forma actual demostró posteriormente ser el modelo más utilizado para estudiar la HAS⁸. Investigaciones previas han demostrado que los ratones y los seres humanos poseen una estructura vascular intracraneal similar, conocida como círculo de Willis, donde se produce predominantemente el aneurisma intracraneal⁹. Este método de no craneotomía replica los mecanismos de ruptura de aneurismas humanos a través de una perforación precisa en bifurcación de ICA¹⁰. Además, el ratón modificado genéticamente se utiliza con frecuencia en el estudio de los mecanismos moleculares. Sin embargo, debido a sus complicadas técnicas en animales pequeños, el modelo de perforación endovascular se utiliza predominantemente en ratas o conejos, mientras que su aplicación en ratones es comparativamente menos común. Por lo tanto, es de gran importancia simplificar el modelo murino de perforación endovascular y reducir su alta tasa de mortalidad.

En este trabajo se presenta una modificación simplificada del modelo murino de perforación endovascular, integrando una versión modificada de la escala de evaluación neurológica de García¹¹. Nuestra modificación proporciona un modelo fácil, conveniente y confiable para futuros estudios experimentales de HSA.

Protocolo

Los ratones machos C57BL/6 (de 6 a 8 semanas de edad), libres de patógenos específicos, se mantuvieron en una instalación de animales con temperatura y condiciones de aclimatación reguladas, mantenidos en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. A los ratones se les proporcionó acceso ilimitado a una dieta estándar para roedores y agua del grifo esterilizada. Se permitió un período de aclimatación de 2 semanas antes del inicio de los experimentos. Todos los procedimientos que involucran animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Hospital de Longhua y se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas del Comité Nacional de Ciencia y Tecnología de China para el cuidado y uso de animales de laboratorio.

1. Preparación animal

1. Coloque el ratón sobre una almohadilla térmica precalentada a 37 °C y continúe manteniendo esta temperatura hasta que se complete la cirugía.
2. Anestesiar al ratón por inhalación de isoflurano al 2-2,5%. Mantener con isoflurano al 1-1,5% durante el funcionamiento a un caudal de 0,4-0,6 L/min.
3. Coloque el ratón en la mesa quirúrgica, estabilice su cabeza, manténgalo en posición supina y asegure sus extremidades con cinta adhesiva.

2. Inducción de SAH

1. Haga una incisión en la piel con unas tijeras a lo largo de la mitad de la parte anterior del cuello (Figura 1A).
2. Diseccionar el tejido conectivo y exponer la arteria carótida común izquierda (ACC) y sus bifurcaciones.
   NOTA: Proteja el nervio vago y las glándulas adyacentes con cuidado (Figura 1B).
3. Enrolle el CCA con una sutura de nailon 6-0 y deje los dos extremos libres sin ligadura (Figura 1C).
4. Conecte ambos extremos de la sutura a la cinta y tire suavemente de la sutura hacia abajo y hacia la derecha en un ángulo de 45° con respecto al plano horizontal. Fije la cinta a la mesa de operaciones para bloquear temporalmente el CCA (Figura 1D).
   NOTA: Cuando el flujo sanguíneo dentro del vaso ocluido se vuelve filiforme, indica una oclusión exitosa.
5. Lime la arteria carótida externa (ECA) con una sutura de nailon (Figura 1E).
   NOTA: El sitio de cauterización debe estar lo más cerca posible del extremo superior, con una longitud de aproximadamente 2 mm desde la bifurcación carotídea.
6. Fusionar el AEC distal al sitio de ligadura con una pluma de electrocauterización (Figura 1F).
7. Tire del ECA hacia abajo lentamente hasta que la arteria carótida interna (ACI) quede expuesta. Alinee el ECA y el ICA en línea recta, asegurando la posición adecuada para el siguiente procedimiento (Figura 1G).
8. Afila la parte superior del filamento. Un punto de marca en el filamento se encuentra a 8 mm de la parte superior.
9. Realice una pequeña incisión con unas tijeras para la inserción del filamento en el ECA. Inserte el filamento con un par de pinzas (Figura 1H).
10. Avance el filamento con cuidado con pinzas hasta que la marca negra pase completamente a través de la bifurcación de CCA e ICA. Avanzar ligeramente 2 mm para perforar el vaso sanguíneo (Figura 1I).
    NOTA: Se siente una resistencia significativa, lo que indica que se ha alcanzado la bifurcación de la arteria cerebral anterior (ACA)-arteria cerebral media (ACM).
11. Retraiga el filamento inmediatamente después de la perforación.
12. Fusione el ECA con una pluma de electrocauterización (Figura 1J).
13. Retire la cinta y retire la sutura de nailon del CCA para restaurar el flujo sanguíneo. Observe la pulsación obvia del CCA (Figura 1K).
14. Cierre la incisión del cuello con suturas reabsorbibles 5-0.

3. Grupo falso

1. En el grupo simulado, se realiza la misma operación quirúrgica excepto que el filamento se avanza parcialmente en el ICA y se retira sin punción¹².

4. Fin del experimento

1. Veinticuatro horas después de la cirugía, evaluar el rendimiento neurológico de acuerdo con la versión modificada del sistema de puntuación reportado por Sugawara et ^al.11 (del original García et ^al.13). Realizar las siguientes seis evaluaciones de manera ciega: actividad espontánea, movimiento de todas las extremidades, movimiento de las extremidades anteriores, escalada de la pared de la jaula de alambre, respuesta al tacto en ambos lados del tronco y reacción a la estimulación de las vibrisas. Evalúe la función neurológica utilizando la tabla de puntuación de la conducta (Tabla 1).
2. Anestesiar al ratón con isoflurano inhalado. Coloque el ratón en posición supina y asegúrelo a la mesa quirúrgica con cinta adhesiva, fijando sus extremidades. Luego, use unas tijeras para hacer una incisión a lo largo de la línea media del abdomen, corte a través de la pared abdominal y exponga la cavidad torácica. Corta con cuidado el esternón para exponer el corazón.
3. Inserte con cuidado una aguja de infusión en el ventrículo izquierdo, asegurándose de que la aguja esté estable y no penetre en el corazón.
4. Comience la perfusión con 1x PBS preenfriado (4 °C) a un caudal adecuado (aproximadamente 10 mL/min) hasta que el líquido que sale se vuelva claro y transparente, lo que indica que la sangre se ha reemplazado por completo.
5. Una vez completada la perfusión, retire la aguja de infusión y detenga la infusión de líquido. Proceda con la recolección de tejido cerebral.

5. Manejo postoperatorio

1. Al cerrar la piel, administrar una inyección intramuscular de lornoxicam para aliviar el dolor de los ratones.
2. Durante la cirugía, aplique el ungüento oftálmico de eritromicina en ambos ojos para mejorar la sequedad de los ojos.
3. Después de la cirugía, en función de la cantidad de sangre perdida durante el proceso quirúrgico, inyecte 0,2-0,4 ml de solución salina en el ratón por vía intraperitoneal para la reposición de líquidos.
4. Inyectar penicilina por vía intramuscular a una dosis de 40.000 unidades al día durante 3 días consecutivos para prevenir la infección.
5. Revise regularmente la respiración espontánea de los animales durante las primeras horas después de la cirugía y monitoree dos veces al día para determinar los criterios de valoración humanitarios predefinidos. Eutanasiar a los ratones con CO₂ inmediatamente si se descubre que tienen problemas respiratorios causados por la cirugía o cumplen con alguno de los criterios de valoración, incluida la pérdida de peso del >20% desde el inicio, la incapacidad sostenida para acceder a alimentos/agua o déficits neurológicos graves.
   NOTA: El animal no se deja desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal y no se devuelve a la compañía de otros animales hasta que se recupere por completo.

Resultados

Puntuaciones neurológicas
Nueve ratones de cada grupo fueron evaluados 24 h en el postoperatorio utilizando una modificación del sistema de puntuación reportado por Sugawara et ^al.11 para evaluar la HSA. La puntuación máxima que se puede obtener es 18. Entre ellos, n = 9 animales en el grupo simulado obtuvieron 18 puntos. En el grupo HSA, el puntaje promedio fue de 11 (p < 0,0001) (Figura 2).

Cambios patológic...

Discusión

En conclusión, este estudio presenta un modelo murino simplificado y fiable de hemorragia subaracnoidea (HSA) inducida por inserción de filamentos endovasculares, ofreciendo un abordaje cómodo y eficaz. En comparación con el modelo de perforación endovascular existente, este protocolo es el mismo en la etapa de perforación: el filamento se introduce en la arteria carótida externa (ECA), avanza a través de la arteria carótida común (CCA) y posteriormente se dirige a la arteria carótida in...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ratones C57BL/6	Shanghai Jiesjie Laboratory Animal Co., LTD
bolígrafo de electrocauterización	Zhuoyu Angel Medical Equipment Co., Ltd	GermanV50	Adecuado para su uso en cirugías menores superficiales, coagulación de tejidos y cauterización de vegetación.
isoflurancia	RWD	R650-IE	es un anestésico general inhalado. Tiene un pequeño coeficiente de partición sangre/gas. Cuando se usa para anestesia animal, puede inducir la anestesia de manera suave, rápida y cómoda, con una recuperación rápida, buena relajación muscular y sin efecto excitatorio en el sistema nervioso simpático. La tasa metabólica de isoflurano en el hígado es baja, por lo que tiene poca toxicidad para el hígado y no hay efectos secundarios obvios incluso con el uso repetido. Para evitar los efectos adversos de los gases residuales anestésicos en el medio ambiente y el personal del laboratorio, se recomienda utilizarlo junto con un sistema de recuperación de gases.
Filamento MACO	Beijing Cinontech	Co.LTD 1620-A2	Utilizado principalmente para ratones que pesan 20-25 g, la punta de sutura se funde en forma hemisférica, sin recubrimiento de polilisina o silicona, marcada a 9-10 mm de distancia de la punta, desinfectada y se puede usar directamente. Este modelo tiene tres especificaciones de embalaje. Se recomienda realizar un experimento previo antes del experimento formal para determinar el modelo apropiado.
microscopio	Olympus	BX61VS	Microscopio vertical totalmente motorizado equipado con el sistema óptico UIS2, diseñado para obtener imágenes de alta resolución y alta precisión. Las características incluyen revólver motorizado, platina y enfoque, así como capacidades de portaobjetos virtuales para crear imágenes digitales grandes y de alta resolución de muestras. Adecuado para aplicaciones de investigación avanzada en patología, biología celular, neurociencia y ciencia de materiales.
sutura de nailon	Huawei Medical Supplies Co., Ltd	J1110	Una sutura quirúrgica no absorbible hecha de materiales biocompatibles de alta resistencia.

El isoflurano