Generación de esferoides/organoides tridimensionales a partir de cultivos celulares bidimensionales utilizando un novedoso dispositivo de estampado

Summary

Este estudio presenta una metodología rentable y eficiente para generar estructuras celulares en 3D utilizando un sistema basado en sellos para crear micropocillos en moldes de agarosa. El sistema promueve la formación de esferoides/organoides uniformes, mejorando así las interacciones celulares. Este enfoque reduce la variabilidad experimental y apoya las aplicaciones en pruebas de fármacos e ingeniería de tejidos.

Abstract

Los cultivos celulares tridimensionales (3D) proporcionan una representación más precisa del microambiente in vivo que los cultivos bidimensionales (2D) convencionales, ya que promueven interacciones mejoradas entre las células y la matriz extracelular. Este estudio tuvo como objetivo desarrollar una metodología eficiente, rentable y reproducible para generar estructuras celulares en 3D (esferoides/organoides) utilizando un innovador sistema basado en sellos para crear micropocillos en moldes de agarosa. Se utilizó un nuevo sello para producir 663 micropocillos por pocillo de una placa de 6 pocillos, proporcionando un entorno ideal para la agregación celular. Las células primarias de los islotes pancreáticos porcinos se sembraron en estos micropocillos, donde se agregaron para formar esferoides/organoides. Los cultivos se incubaron a 37 °C bajo 5% de CO₂ y el medio se reemplazó cada 3 días. Se monitoreó periódicamente la formación de esferoides y se recolectaron muestras para su caracterización. El método generó con éxito esferoides uniformes y de alta calidad, reduciendo la variabilidad experimental, minimizando la manipulación y mejorando las interacciones celulares. El uso de moldes de micropatrones a base de agarosa proporcionó un entorno simplificado y controlado para los cultivos 3D, ofreciendo una solución estandarizada y rentable. Esta metodología admite aplicaciones para pruebas de fármacos e ingeniería de tejidos, ofreciendo una plataforma práctica y escalable para modelos de cultivo celular en 3D que se puede implementar fácilmente en diversos entornos de laboratorio.

Introduction

En los últimos 50 años, numerosas investigaciones en biología celular han demostrado que los cultivos bidimensionales (2D) no logran replicar con precisión las condiciones in vivo observadas^{en modelos animales}. Estructuralmente, los cultivos celulares 2D no permiten que las células se organicen tridimensionalmente y reproduzcan la situación observada en los sistemas in vivo . Además, las vías de señalización celular se alteran en los cultivos 2D en comparación con los cultivos tridimensionales (3D), lo que probablemente podría explicar por qué ciertos tipos de cribado de fármacos que utilizan cultivos 2D son tan discrepantes². Un avance significativo en las técnicas de cultivo celular surgió con la introducción de los sistemas de cultivo 3D. Los sistemas 3D varían considerablemente en complejidad dependiendo de la composición celular y la citoarquitectura. Generalmente, se generan dos tipos de estructuras, a saber: esferoides y organoides. Los esferoides se describen como grupos simples de células obtenidas de tejidos normales o tumorales, cuerpos embrioides y líneas celulares. La formación de estructuras 3D está influenciada por varios factores, incluidas las interacciones célula-célula y las vías de señalización mediadas por componentes de la matriz extracelular (MEC), que proporcionan soporte estructural y señales bioquímicas. Estos elementos regulan las interacciones que contribuyen a la organización y función de los tejidos³. El sistema de cultivo de esferoides se describió por primera vez a principios de la década de 1970, utilizando líneas celulares pulmonares de hámster chino V79 como modelo de carcinomas nodulares, creciendo en condiciones no adherentes y formando esferas perfectas⁴. Los organoides se describen como grupos de tipos de células específicas de órganos derivadas de células madre o progenitoras, que se autoorganizan a través de procesos, como la clasificación de células y la especificación del linaje, de una manera espacialmente confinada, reflejando el desarrollo in vivo ⁵.

Hay varios métodos y materiales disponibles para cultivar células en condiciones 3D. Los principales métodos empleados actualmente para la generación de cultivos 3D son: 1) gotas colgantes; 2) cultivo celular rotatorio y plásticos de baja adherencia; 3) placas piramidales que contienen pozos cónicos; 4) andamios macroporosos; 5) cuentas magnéticas; y 6) hidrogeles sin andamios.

Las gotas colgantes son el método utilizado para obtener cultivos 3D sin andamios. Este método presenta ciertas limitaciones, incluida la necesidad de un manejo extensivo, baja eficiencia de producción, geometría esférica y exposición a altas fuerzas de cizallamiento. Además, los procedimientos específicos, como el reemplazo de medios o la adición de compuestos, pueden ser desafiantes y pueden resultar en pérdidas de material. Además, los informes de la literatura indican que algunas líneas celulares no logran producir esferoides muy compactos cuando se emplea este enfoque⁶.

El cultivo celular rotatorio y los plásticos de baja adherencia se utilizan para evitar que las células se adhieran al sustrato, lo que hace que se agreguen y formen esferoides. Este proceso requiere matraces específicos y/o agitación/rotación. Aunque este es uno de los enfoques más sencillos para la producción de esferoides u organoides a gran escala, no está exento de inconvenientes, como la necesidad de equipos específicos, la baja longevidad del cultivo, la variación de tamaño de los esferoides, el daño mecánico a las células y la baja eficiencia⁶.

Las placas piramidales que contienen pocillos cónicos son placas disponibles comercialmente que impactan los costos, además del hecho de que algunas manipulaciones pueden dificultar la formación de esferoides/organoides⁷.

Los andamios macroporosos también se emplean para el cultivo en 3D; Sin embargo, un obstáculo importante radica en lograr una siembra celular efectiva y una distribución uniforme. Este problema surge porque los tamaños de los poros pueden ser demasiado pequeños para la penetración de las células o demasiado grandes para retenerlas de forma segura. Para abordar esta problemática, se han explorado varias estrategias⁸, las cuales impactan directamente en la complejidad y costo de esta técnica.

La metodología de perlas magnéticas genera un pequeño número de esferoides/organoides, tiene un alto costo y puede dejar residuos de nanopartículas dentro de las células⁹.

Entre los sistemas para el cultivo de esferoides, están disponibles los hidrogeles de agarosa no adhesivos, que representan un hidrogel sin andamios. Este enfoque ofrece beneficios notables, como el control preciso sobre el tamaño de las estructuras 3D y la capacidad de generar un número sustancial de estas estructuras por placa. En este método, las células se introducen en un hidrogel con pozos preformados, en el que se hunden y se autoensamblan en esferoides 3D¹⁰.

En este estudio se presenta un dispositivo y metodología para generar micropocillos de agarosa utilizando un molde de micropatrones de manera sencilla, eficiente, reproducible y de bajo costo.

El uso de este sello como molde para generar micropocillos en agarosa, ayudado por la gravedad, tiene como objetivo mejorar la interacción celular dentro del micropocillo y la organización celular, generando estructuras 3D (esferoides/organoides) in vitro de una manera sencilla, eficiente, reproducible y de bajo costo, ahorrando así tiempo de investigación y recursos de laboratorio.

Protocol

Este protocolo sigue los lineamientos del Comité de Ética en Investigación en Seres Humanos de nuestra Institución CEUA-FMUSP: 1699/2021, aprobado el 8 de septiembre de 2021 -"Aislamiento y Encapsulación de Islotes Pancreáticos Porcinos" y forma parte del Proyecto Temático de nuestro Grupo NUCEL de Terapia Celular y Molecular (www.usp.br/nucel), Beca FAPESP n.º 2016/05311-2, titulado: "Medicina Regenerativa dirigida a la terapia de enfermedades crónico-degenerativas (cáncer y diabetes)".

1. Fabricación del dispositivo de estampación

NOTA: Este sello está hecho a medida por el grupo NUCEL (https://w3nucel.webhostusp.sti.usp.br/). El dispositivo de estampación se desarrolló utilizando el software de referencia, ampliamente reconocido por su precisión y capacidades avanzadas de modelado tridimensional.

1. Asegúrese de que los prototipos diseñados cuenten con 663 micropines dispuestos para permitir la generación de un número equivalente de cultivos tridimensionales, como esferoides u organoides. Para garantizar la estabilidad del sello en las superficies de la bandeja T6, coloque cinco puntos de apoyo estratégicamente a lo largo de la circunferencia del dispositivo.
2. Asegúrese de que los micropines tengan un diseño cónico con dimensiones ajustables, que van de 1 a 3 mm de longitud. El diámetro de la base del cono varía entre 0,7 y 1,5 mm, mientras que el ángulo cónico oscila entre 5° y 10°.
3. Asegúrese de que la estructura de "tope" del dispositivo, que define la profundidad de los micropines, tenga una longitud ajustable de 10 a 19 mm y un diámetro de 20 a 40 mm, con micropines distribuidos uniformemente por su superficie.
4. Además, diseñe el dispositivo para que tenga un mango ergonómico, adecuado para operar con una sola mano, para mejorar la practicidad y la precisión durante el uso.
   NOTA: Para facilitar la producción a gran escala del dispositivo, se proporciona el archivo digital en formato .stl, siendo imprescindible para el proceso de impresión 3D.
5. Basta con cortarlo con el software adecuado e imprimirlo con una impresora 3D compatible. Utilice las siguientes dimensiones de impresión: X - 68 mm; Y - 120 mm; Z - 150 mm, lo que garantiza un equilibrio ideal entre funcionalidad y calidad estructural.
6. Para la fabricación del dispositivo, utilice una impresora 3D fotocurable, que sea compatible con la resina polimérica curable por UV que debe tener alta resolución y un acabado superficial uniforme, características esenciales para un rendimiento óptimo del dispositivo.
7. Corte el modelo digital para imprimirlo utilizando un software compatible con la impresora 3D seleccionada.

2. Preparación de micropocillos de agarosa

1. Prepara la solución de agarosa.
   1. Pesar el polvo de agarosa pura y disolverlo en 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) para lograr una concentración final de 1-2% (p/v).
   2. Caliente la solución en un microondas o baño de agua hasta que se disuelva por completo, asegurándose de que sea homogénea y transparente.
      NOTA: Evite el sobrecalentamiento o el recalentamiento excesivo, ya que esto puede degradar la agarosa. No prepare grandes volúmenes de solución madre.
   3. Deje que la solución se enfríe a ~40 °C, la temperatura ideal para el pipeteo.
2. Prepara el sello a medida.
   1. Lave el sello con una esponja de cerdas suaves y agua destilada para eliminar los residuos.
   2. Exponga el sello limpio a la luz ultravioleta durante 5-10 minutos para garantizar la esterilidad.
3. Forma los micropocillos.
   1. Verter/pipetear ~3 mL de la solución de agarosa a 40 °C en cada pocillo de una placa de 6 pocillos, asegurando una profundidad uniforme de 2-3 mm.
   2. Coloque el sello hecho a medida en el centro del pozo mientras la agarosa aún está caliente.
      NOTA: El sello tiene soportes laterales que aseguran la alineación y la estabilidad, eliminando la necesidad de soporte manual. Cada sello crea ~663 micropocillos (~2 mm de altura) por pocillo. Asegúrese de que no haya burbujas en los micropines; Si se forman burbujas, mueva suavemente el sello para eliminarlas.
   3. Deje que la agarosa se solidifique durante 5-10 minutos a temperatura ambiente sin mover el plato.
      NOTA: No altere la agarosa durante la solidificación para evitar variaciones en la estructura del micropocillo.
   4. Retire el sello con suaves movimientos hacia adelante y hacia atrás para liberar el vacío sin dañar los micropocillos.
      NOTA: Este movimiento facilita la entrada de aire, permitiendo una eliminación suave del sello sin deformar el gel. Los micropocillos deben permanecer intactos.
   5. Lave los micropocillos 3 veces con una solución de PBS para eliminar los residuos.
   6. Exponga la placa a la luz ultravioleta durante 10 minutos para eliminar la contaminación microbiana.
   7. Añadir 3 mL de medio de cultivo e incubar la placa en una incubadora de_CO2 a 37 °C durante la noche.
      NOTA: Esta incubación verifica la ausencia de contaminación antes de la siembra de la célula.

3. Siembra celular en micropocillos

1. Prepara la suspensión de la celda.
   1. Recolectar las células mediante tripsinización u otro método de disociación para obtener una suspensión homogénea.
   2. Cuente las celdas y ajuste la concentración de acuerdo con el número deseado por micropocillo.
      NOTA: Para sembrar 5.000 células por micropocillo en 663 micropocillos, prepare una suspensión que contenga al menos 3.315 × 10⁶ células en total. Optimizar la concentración celular para prevenir la necrosis central y asegurar una adecuada difusión de nutrientes y oxígeno.
2. Siembra las células.
   1. Pipetee ~3 mL de la suspensión celular preparada sobre los micropocillos, asegurando una distribución uniforme girando suavemente la placa.
   2. Deje que las células se asienten por gravedad (~ 10-15 min) o realice una centrifugación suave a 100 × g durante 5 min.
      NOTA: La centrifugación se puede utilizar para asegurar que las células se concentren en los micropocillos.
   3. Transfiera la placa a una incubadora de_CO2 a 37 °C con una atmósfera humidificada.

4. Mantenimiento de cultivos celulares 3D

1. Reemplace el medio de cultivo.
   1. Cambie el medio cada 2-3 días, eliminando el 50% del medio anterior y agregando medio nuevo.
      NOTA: Asegúrese de que los micropocillos permanezcan sumergidos durante todo el período de cultivo para evitar la deshidratación.
2. Supervise la formación de cultivos 3D.
   1. Continúe cultivando hasta que las estructuras 3D estén completamente formadas y compactas (p. ej., 2-3 días para cultivos primarios de islotes pancreáticos).
      NOTA: Para cultivos que requieran un tiempo de formación más largo, realice cambios parciales de medio cada 2-3 días.

5. Recopilación y caracterización de estructuras 3D

1. Recoge los esferoides/organoides.
   1. Retire el medio antiguo y recoja las estructuras 3D mediante un pipeteo vigoroso con una punta de pipeta de diámetro ancho o cortada para evitar la compresión o la disgregación.
      NOTA: Se debe controlar el pipeteo vigoroso para desalojar los agregados sin deformarlos.
2. Prepárese para el análisis.
   1. Utilice los esferoides/organoides recolectados inmediatamente o corríjalos para futuros análisis.
      NOTA: La asociación y la estabilidad de los esferoides dependen del tipo de célula, el tiempo de formación y las condiciones de cultivo. El cuidado es fundamental para evitar la disociación.

Results

El cultivo celular utilizado en este estudio se derivó de islotes pancreáticos porcinos. La preparación de los islotes utilizada en este estudio tuvo una pureza del 80 ± 5% basada en la tinción con ditizona, y una viabilidad de las células de los islotes del >80% basada en la detección de diacetato de fluoresceína en células vivas o yoduro de propidio en células muertas (el método fluorescente Live/Dead). Asegúrese de que la preparación de los islotes pancreáticos porcinos tenga al menos un 80 % de pureza (por ejemplo...

Discussion

Aunque en la literatura existen varios protocolos de cultivo en 3D, en un estudio realizado por Wassmer et ^al.13 se probaron varias metodologías para generar estructuras 3D utilizando islotes pancreáticos. Los autores observaron que los islotes nativos y los esferoides autoagregados exhibían una heterogeneidad considerable con respecto al tamaño y la forma y eran más grandes que los obtenidos con otros métodos. Con base en sus hallazgos, concluyeron que los esfero...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microondas 31L	Electrolux	78965840 6699 9	Equipo utilizado para calentar la solución de agarosa, facilitando su disolución y asegurando una mayor homogeneidad. Permite que la solución alcance el estado líquido ideal para la formación de los pozos.
Resina 3D fotosensible opaca gris 3DFila Resina			polimérica curable por UV Impresora
3D - Creality Halot One	Creality	N/A	Impresora 3D utilizada para imprimir el dispositivo de sellos
Agarose	UNISCIENCE	UNI-R10111	Para formar el gel, disuelva del 1 al 2% en tampón de fosfato salino (PBS) o medio apropiado.
Autodesk Fusion 360			Modelado 3D
BB15 CO2 Incubadora	Thermo Fisher 51023121		Equipo utilizado para incubar células cultivadas en un entorno adecuado y controlado.
Chitubox	Chitubox N	/A	Software utilizado para el corte de la pieza para impresión
Cabina de Seguridad Biológica Clase II	Grupo VECO	N/A	Garantiza un ambiente estéril para la realización del cultivo celular dentro de los parámetros y protocolos establecidos.
Medio de cultivo	USBiológico/Ciencias de la Vida	C5900-03A	Contiene aditivos para el correcto cultivo celular.
Placas de cultivo (P6)	SARSTEDT	1023221	Se utiliza para dar forma a la agarosa y cultivar las células.
Matraz Erlenmeyer (25 mL)	Laborglas	91 216 14	Un recipiente utilizado para disolver 1– 2% de agarosa en solución salina tamponada con fosfato (PBS) u otro medio adecuado, generalmente calentado en un microondas.
Tubo de centrífuga de poliestireno Falcon 15 mL	Corning	352099	Se utiliza para mantener las células en suspensión y realizar posibles diluciones.
Suero fetal bovino (FBS)	Vitrocell Embriolife	005/19	Aditivo para medio de cultivo.
Solución PBS (tampón de fosfato salino)	Hecho en laboratorio	/A	diluido 1x con agua ultrapura MiliQ. Se utiliza para disolver la agarosa del 1 al 2% y para lavar los pocillos ya producidos.
Frasco de reactivo con tapón azul - Schott	Laborglas	21801545	Se utiliza para preparar y almacenar el medio de cultivo.
Dispositivo de sellos	NUCEL Group	N/A	Link: este enlace proporciona acceso al archivo .stl del dispositivo de sellos. Basta con cortarlo con el software adecuado e imprimirlo con una impresora 3D compatible. https://drive.google.com/drive/folders/1gTYComnJWzHpN6ZKOyK EChKS3Qns0rOA?usp=sharing
Matraz de cultivo tratado con filtro 25 cm²	Corning 430639		Se utiliza para el cultivo y mantenimiento de células adherentes.
Tripsina	Merck	07-07-9002	Para la disociación de las células antes de la siembra.
Luz ultravioleta (UV)	/A	N/A	Se utiliza para esterilizar el sello y las placas.