Aquí, presentamos un protocolo para la fabricación de almohadillas de agar canalizado utilizando moldes PDMS creados a partir de discos de vinilo. Los canales permiten a los usuarios orientar con precisión Caenorhabditis elegans para mejorar el contraste de las imágenes y facilitar la comparación de estructuras. Estas capacidades son particularmente útiles en los estudios de neurorregeneración.
Artículo de método
Ajuste fino de la orientación de Caenorhabditis elegans en almohadillas de agar canalizadas para la neurorregeneración de imágenes
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Resumen
Resumen
Caenorhabditis elegans es un organismo modelo ampliamente utilizado para el estudio de procesos biológicos. Su transparencia y pequeño tamaño lo hacen ideal para obtener imágenes de tejidos, células y estructuras subcelulares. Las almohadillas de agar planas tradicionales para obtener imágenes de C. elegans limitan el control sobre la orientación del animal, restringiendo las vistas principalmente a las perspectivas laterales. Esta limitación complica la visualización de las estructuras dorsal-ventrales y reduce la claridad de la imagen, especialmente en animales mayores con mayor pigmentación y diámetros más grandes. Para superar estos desafíos, desarrollamos almohadillas de agarosa canalizadas que permiten un control preciso de la orientación de los animales. Estos canales permiten a los investigadores rotar y fijar C. elegans en posiciones específicas, lo que facilita la obtención simultánea de imágenes de múltiples estructuras y mejora la resolución de la imagen al acercar las células objetivo al objetivo del microscopio. Esto es particularmente útil para obtener imágenes de fibras neuronales regeneradas después de una cirugía, que pueden crecer en direcciones difíciles de capturar con almohadillas de agar planas tradicionales. Este método es accesible, ya que la fabricación de almohadillas de agar canalizadas requiere el mismo tiempo y materiales que las almohadillas planas, lo que la convierte en una opción práctica para la mayoría de los laboratorios.
Introducción
El nematodo Caenorhabditis elegans (C. elegans) es un organismo modelo ampliamente utilizado para estudiar procesos biológicos como el desarrollo y el comportamiento debido a su genética fuertemente conservada con sus homólogos mamíferos1. Los investigadores cultivan C. elegans en una placa de medio de crecimiento de nematodos (NGM) en un entorno estrictamente controlado que estandariza las condiciones experimentales y permite una atribución más precisa de los resultados a las variables experimentales. El animal es transparente, lo que permite obtener imágenes claras de tejidos, células y estructuras subcelulares. C. elegans es pequeño, y los animales adultos miden ~ 1 mm de largo y 80 μm de diámetro, lo que permite la colocación de varios animales en un solo soporte de portaobjetos para obtener imágenes1. Su pequeño tamaño también permite que una sola imagen capture todo el organismo mientras resuelve las células individuales, lo cual es crucial para visualizar la regeneración de las fibras neuronales. En sinérgica a estas ventajas para la microscopía, el rápido desarrollo, la anatomía estereotipada y la fácil genética de C. elegans permiten estudios a gran escala1.
El procedimiento típico para la obtención de imágenes de las células en C. elegans se estableció hace décadas y se ha mantenido en gran medida sin cambios. Los investigadores utilizan almohadillas planas de agar en portaobjetos para montar e inmovilizar a los animales para la visualización desus células. Un cubreobjetos en la parte superior de la almohadilla mantiene a los animales en su lugar y protege la lente del microscopio. Es importante destacar que el cubreobjetos tiene un alto índice de refracción que aumenta la apertura numérica de la luz capturada y mejora la resolución de la imagen. Además, el cubreobjetos reduce la distorsión en la transmisión de la luz. Por lo tanto, un cubreobjetos mejora la visualización de las células y estructuras objetivo.
Sin embargo, cuando se usan con un cubreobjetos, las almohadillas de agar planas a menudo restringen la orientación del animal. C. elegans se dobla a lo largo de su dirección dorsal-ventral (DV), por lo que adopta una orientación lateral en una almohadilla de agar plana. Sin embargo, incluso después de inmovilizar, enderezar y prerrotar a una orientación DV, la colocación de cubreobjetos revierte a casi todos los animales a una vista lateral (Figura 1). Creemos que esta reorientación ocurre porque el cubreobjetos empuja la vulva protuberante de C. elegans hacia un lado. Los animales más jóvenes sin vulva están más orientados al azar. Este control limitado sobre la orientación es problemático al menos por dos razones. En primer lugar, puede que no permita colocar dos estructuras en un solo campo de visión (por ejemplo, bilateral), lo que complica su comparación. En segundo lugar, el ajuste de la orientación es importante para optimizar la calidad de la imagen, ya que las estructuras de interés generalmente se obtienen mejor cuando están cerca del objetivo. Esto se debe a que los objetivos representan una profundidad limitada dentro de la muestra (es decir, la distancia de trabajo) y porque la luz de ubicaciones más profundas experimenta más dispersión y absorción.
En el caso de C. elegans, el control limitado sobre la orientación suele ser más grave en los animales más viejos. Los animales de L1 a L4 tienen un diámetro más pequeño, lo que hace que se pueda obtener una imagen de una fracción más alta del gusano. Estas larvas también tienen menos pigmentación, lo que resulta en una menor absorción de luz visible y dispersión de fotones, lo que mejora la claridad y resolución de la imagen. Por el contrario, los animales adultos tienen un diámetro más grande y más pigmentación, lo que plantea desafíos para la obtención de imágenes en planos z más profundos, ya que el cubreobjetos afecta la orientación inicial.
En 2008, introdujimos una estrategia que utiliza almohadillas de agar con canales para superar estos desafíos manteniendo la orientación de los animales 3,4. Como se describe a continuación, los usuarios rotan a los animales inmovilizados en los canales a una orientación deseada anotando los puntos de referencia anatómicos. Los canales mantienen a los animales en depresiones entre superficies elevadas de agar, minimizando la fuerza sobre el animal durante la colocación de cubreobjetos y eliminando la rotación del animal. Como la fabricación de almohadillas acanaladas y almohadillas planas comunes sigue casi el mismo procedimiento y requiere el mismo tiempo, nuestra técnica es altamente accesible. Muchos laboratorios utilizan nuestra técnica para inmovilizar C. elegans para estudiar las características anatómicas, observar el desarrollo y analizar las contribuciones neuronales al comportamiento 5,6,7,8. La siguiente sección describe todo el proceso para hacer agar canalizado, a partir de un disco de vinilo que se cortó en cuartos con un cuchillo caliente. En primer lugar, describimos la fabricación del molde de polidimetilsiloxano (PDMS) utilizado para fundir agar canalizado. A continuación, mostramos cómo fabricar el agar canalizado paso a paso. Se espera que todo el procedimiento dure 3 horas sin experiencia. Siguiendo el procedimiento de fabricación de PDMS, las almohadillas hechas con el molde tardarán el mismo tiempo que las almohadillas de agar típicas (unos minutos).
Protocolo
1. Preparación de polidimetilsiloxano (PDMS) para la fabricación
- Vierta una proporción de 1:10 del agente de curado rápido en la base en un plato de pesaje desechable. Mezcle el líquido sin curar durante 45 s hasta que el líquido esté completamente integrado y lleno de burbujas.
- Coloque la bandeja en un desecador al vacío inclinado. Cicle la presión entre -0,09 y -0,1 kPa 3 veces para permitir que las burbujas de aire salgan a la superficie.
- Mantenga la aspiradora encendida durante aproximadamente una hora en un rango de presión de -0,09 a -0,1 kPa hasta que queden pocas burbujas visibles, que se puedan eliminar manualmente.
2. Fabricación de moldes PDMS de discos de vinilo
- Enjuague el disco de vinilo y la placa de vidrio con agua desionizada (DI). Asegurar la ausencia de polvo para obtener el mejor molde. Deja que el disco de vinilo se seque al aire hasta que se use.
- Coloque una hoja de papel de aluminio encima de la placa calefactora para atrapar el exceso de PDMS.
- Coloca un portaobjetos de vidrio en cada extremo del disco de vinilo para ajustar el grosor del molde al ancho de los portaobjetos de vidrio. Esto garantiza una altura uniforme al presionar el cristal sobre el PDMS sin curar.
- Vierte el líquido PDMS sin curar en un lado del disco de vinilo.
- Observe las burbujas utilizando el reflejo de la luz en la superficie líquida y elimínelas con la punta de una pipeta. Incline la placa de vidrio y baje la placa lentamente permitiendo que el aire escape, evitando que se introduzcan burbujas.
- Cura el PDMS a 80 °C durante 35 min.
- Retira el disco de vinilo de la placa calefactora y deja que se enfríe. Retire con cuidado el PDMS del disco de vinilo para evitar que se rompa.
- Use un nuevo portaobjetos de vidrio como guía para cortar el PDMS con una navaja afilada para crear un molde de agar canalizado.
3. Fabricación de almohadillas de agar canalizadas con NaN3
NOTA: El procedimiento y los materiales para las almohadillas de agar planas se establecieron previamente9. Este procedimiento es muy similar.
- Añadir 0,6 g de agar y 30 mL de caldo líquidoNGM 9 en un matraz. Añadir una barra agitadora y calentar en una placa caliente a 120 °C.
- Agregue 120 μL de caldo de NaN3 (concentración de caldo de 1 M) después de que el gel se derrita.
- Lave el molde de PDMS con agua y déjelo secar al aire. Coloque el molde PDMS entre dos conjuntos de pares de diapositivas.
- Pipetea el agar hacia arriba y hacia abajo para calentar la punta de la pipeta. Pipetee 300 μL de agar fundido en el molde de PDMS, esparciendo manualmente el agar a través de los canales, ya que la colocación del portaobjetos esparcirá el agar a lo largo de los canales.
- Coloque un portaobjetos de microscopio directamente sobre el agar, descansando sobre los portaobjetos de los lados. Retire el portaobjetos después de que el agar se enfríe.
4. Montaje de C. elegans
- Una vez que los portaobjetos se enfríen, levante el portaobjetos directamente del molde sin cortarlo.
- Mueva a los animales a los canales después de que hayan sido inmovilizados por NaN3
- Gire los animales a la orientación deseada.
- Coloque un cubreobjetos en la almohadilla. Incline la almohadilla y empuje ligeramente hacia abajo de un lado a otro para empujar el aire hacia un lado y evitar la creación de burbujas.
Resultados
Fabricación de moldes PDMS
El ciclo de la presión de vacío durante la fabricación del molde perfora y elimina las burbujas de aire del PDMS sin curar, lo que garantiza un molde sin burbujas. Como se muestra en la Figura 3D , las burbujas suben a la superficie y perforan. Los moldes sin burbujas pueden producir canales limpios.
Solidificación del molde PDMS
Al colocar el panel de vidrio sobre el disco de vinilo, evite crear espacios de aire. Estos espacios pueden dar lugar a un grosor desigual o defectos en la superficie. Las burbujas, si están presentes, se pueden detectar visualmente. Al presionar el panel de vidrio de un lado a otro, se desplaza el aire, lo que minimiza la formación de burbujas y garantiza un grosor de molde uniforme que se muestra en la Figura 4A.
Uso de almohadillas de agar canalizadas para la orientación fina de C. elegans
Las almohadillas de agar canalizadas permiten una orientación precisa de C. elegans. Establecemos la orientación del animal enrollándolo ligeramente con una púa de alambre de platino, mientras verificamos la orientación utilizando puntos de referencia, como la vulva o el intestino en forma de S (Figura 5A, C). Confirmamos la orientación bajo un microscopio de disección fluorescente antes de transferir animales a un microscopio invertido que se muestra en la Figura 5B,D.
Evaluación de la regeneración de fibras neuronales con almohadillas de agar canalizadas
Las almohadillas de agar canalizado mejoran la calidad de la imagen de la regeneración neuronal al orientar de forma óptima al animal. La colocación de las fibras neuronales regeneradas más cerca de la lente del objetivo reduce la dispersión y absorción de la luz, lo que mejora la claridad de la imagen. La figura 5E, F muestra que colocar el sitio de regeneración más cerca del objetivo mejora la calidad de la imagen, lo que facilita un análisis más preciso del recrecimiento neuronal.
Figura 1: Caenorhabditis elegans en almohadillas planas y acanaladas. (A) Animal en una almohadilla de agar plana en orientación DV; Cubreobjetos de la cara de la vulva. (B) La introducción del cubreobjetos empuja la vulva hacia un lado, forzando al animal a orientarse lateralmente. (C) Animal en almohadilla de agar canalizada en orientación DV. (D) El animal permanece en orientación DV después de la introducción del cubreobjetos. (E) Imagen de campo claro de un rodillo mutante en una almohadilla de agar canalizada en orientación DV. (F) Imagen de campo claro con cubreobjetos, el mismo animal que E permanece en orientación DV. Abreviaturas: DV = dorsal-ventral; lat = lateral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Materiales y equipos para la fabricación de PDMS. (A) Kit de elastómero de silicona SYLCAP 284-F. b) Escala. (C) Jeringa de plástico. (D) Desecador de vacío. (E) Placa calefactora. (F) Disco de vinilo de larga duración de 12 pulgadas, separar según sea necesario. (G) Vidrio de vidrio. Abreviatura: PDMS = polidimetilsiloxano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Mezcla y aspiración de PDMS sin curar. (A) Mezcle la base y el agente de curado en la bandeja. (B) Coloque la bandeja en una cámara de vacío. (C) Realice el ciclo de vacío tres veces para permitir que las burbujas salgan a la superficie. (D) Después de una hora, la mayoría de las burbujas explotaron. Obsérvese la mejora de la transmisión a través de PDMS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Introducción de un panel de vidrio a PDMS sin curar sin burbujas. (A) Introducción de un panel de vidrio en el disco de vinilo sin burbujas. (B) Molde de PDMS solidificado retirado del registro, con canales de detalle insertados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Imágenes de campo claro y fluorescencia de C. elegans montadas en agar canalizado. (A) Imagen de campo claro de un animal en orientación DV bilateral. Punto de referencia anatómico para la orientación DV: intestino espiral en forma de S (tejido más oscuro indicado por una flecha) que cruza la línea media ~ 60% de la distancia desde la nariz hasta la cola. (B) Imagen de fluorescencia de neuronas en orientación DV, el mismo animal que A. (C) Imagen de campo claro de un animal en orientación dorsal. Punto de referencia anatómico para la orientación dorsal: lado orientado hacia la vulva. (D) Imagen de fluorescencia de neuronas en orientación dorsal, del mismo animal que C. (E) Orientación con regeneración (flecha) en el lado más profundo (lejano) de un animal. (F) Orientación con regeneración en animales laterales menos profundos más cercanos al objetivo; Regeneración más clara (flecha). Barras de escala = 20 μm. Abreviaturas: DV = dorsal-ventral; lat = lateral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discusión
La principal ventaja de las almohadillas de agar canalizado es su capacidad para mantener la orientación de los animales para la obtención de imágenes. Los canales se adaptan a los animales adultos, lo que permite una rotación controlada que se mantiene tras la introducción del cubreobjetos. Hemos fotografiado con éxito animales de tipo salvaje, rodillos y rechonchos. Orientamos adecuadamente a los animales utilizando puntos de referencia anatómicos, lo que permite la obtención de imágenes y la comparación de múltiples estructuras en un campo de visión y acerca las células objetivo a la superficie. En particular, esta rotación facilita la visualización en la vista dorsal o ventral (bilaterales), que permiten la comparación del lado izquierdo y derecho del animal.
Anteriormente, la visualización y comparación de estas estructuras bilaterales requería pilas z en 3D y la posible normalización de las señales para tener en cuenta la reducción de la transmisión a mayores profundidades. Por lo tanto, la orientación definida habilitada por el agar canalizado permite obtener imágenes más consistentes a través de múltiples gusanos y debería permitir mediciones mejoradas. Esto es particularmente útil para la evaluación postquirúrgica de las fibras neuronales regeneradas, que pueden crecer en direcciones que son difíciles de visualizar, como la circunferencial2.
Además, el agar canalizado reduce el estrés en los animales porque se colocan en una depresión que alivia la presión del cubreobjetos y promueve la fisiología normal5. Si bien las tensiones flácidas pueden retorcerse durante el montaje, los canales fomentan una configuración lineal del animal y la rotación de todo el animal. En una implementación diferente, el patrón también puede restringir el movimientodel animal para reducir la cantidad de anestésico requerido para obtener imágenes u observar al animal.
Por último, la técnica del agar canalizado también es muy accesible. Después de la fabricación del molde, la creación de almohadillas de agar canalizadas requiere aproximadamente la misma cantidad de tiempo, experiencia y costo que la fabricación de almohadillas de agar planas regulares. Todos los componentes necesarios para crear el molde PDMS son comunes a muchos laboratorios académicos o se compran en línea. La durabilidad de los moldes PDMS los convierte en una opción rentable para los laboratorios, capaces de soportar un uso prolongado a lo largo del tiempo. Los moldes PDMS pueden durar años y cientos de usos. Seguimos utilizando un molde de 17 años con degradación moderada. Recomendamos almacenar los moldes a temperatura ambiente en un recipiente para mantenerlos libres de residuos, que se pueden lavar con agua desionizada si es necesario.
A pesar de estas ventajas, existen varias limitaciones asociadas con nuestra técnica. La fuerza del pico utilizado para colocar a los animales en la plataforma puede deformar los canales, lo que puede afectar la posición del animal. Al igual que con cualquier manipulación fina, posicionar y rotar al animal a la orientación deseada puede llevar mucho tiempo, lo que aumenta la exposición del animal al anestésico y potencialmente induce estrés. Los canales también pueden atrapar aire y formar burbujas durante la colocación del cubreobjetos, lo que puede interferir con la claridad de la imagen al dispersar la luz. Discutimos formas de minimizar las burbujas en el protocolo. Nuestra experiencia indica que la mayoría de las desventajas del agar canalizado se evitan en gran medida con un mínimo de entrenamiento y práctica.
Las direcciones futuras para optimizar estos canales incluyen el desarrollo de diseños adaptados a necesidades experimentales específicas, incluyendo diferentes tamaños y formas para diferentes edades y fenotipos de C. elegans. La fabricación de tamaños de canal personalizados mediante nanofabricación10 puede reducir el impacto fisiológico en los animales en comparación con los canales genéricos5. En conclusión, la implementación de almohadillas de agar canalizadas permite obtener imágenes de alta resolución de estructuras oscuras en animales más viejos. Estas almohadillas mantienen la orientación de C. elegans, lo que mejora la calidad de las imágenes y la visualización detallada, al tiempo que reducen el estrés de los animales debido a la estructura de soporte de los canales.
Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
El financiamiento fue proporcionado por NIH R56NS128413. Agradecemos a Noah Joseph (Departamento de Bioingeniería del Noreste) por su ayuda con el procesamiento de discos de vinilo. Agradecemos a los miembros del Laboratorio Chung por sus perspicaces comentarios sobre el manuscrito.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Matraz Erlenmeyer de 125 mL | Corning | 4980-125 | |
| 33 1/2 RPM o disco de vinilo de reproducción larga (LP) de 12 pulgadas; | N/A | N/A | Profundidad de canal individual: 50 µ m, ancho: 200 y micro; m |
| 30 mL jeringa de plástico | Fisher Scientific | 50-793-817 | |
| 90% Platino, 10% Alambre de Iridio | Tritech Research | PT-9010 | utilizado para crear |
| Amazon | N/A | ||
| Cloruro de calcio | Fisher Scientific | AAL131910B | |
| panel de vidrio | N/A | N/A | 7 pulgadas x 5 en panel de vidrio tomado del marco |
| pipeta de vidrio | Fisher Scientific | 13-678-20A | púa de platino |
| Thermofisher | |||
| Fisher Scientific | AA3333736 | ||
| portaobjetos de microscopio | Mckesson | 938360 | |
| agar de grado de biología molecular | Benchmark Scientific | A1705 | |
| Fosfato de potasio dibásico | Fisher Scientific | P290-500 | |
| Fosfato de potasio monobásico | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Azida de sodio | Fisher Scientific | AAJ2161022 | |
| cloruro de sodio | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| cubreobjetos cuadrados | Fisher Scientific | 12-541-016 | |
| SYLCAP 284-F (curado rápido) Kit de encapsulante de elastómero de silicona, transparente, ópticamente transparente, mezcla 10:1, 500 gm/ml (0,5 kg), más rápido que Sylgard 184 y similares | MicroLubrol | N/A | |
| Fisher Scientific | 08-648-100 | ||
| Fisher Scientific | 01-549-750 |
Referencias
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