Este informe describe un método para medir el tiempo de eliminación de Drosophila melanogaster adulto utilizando un monitor de actividad de Drosophila (DAM2) en respuesta a un factor de estrés térmico por conducción de aire dentro de la cámara de una incubadora. El DAM2 mide la actividad registrando los movimientos individuales de las moscas a medida que cruzan un haz infrarrojo. El análisis de los datos se ve facilitado por un novedoso archivo ejecutable creado por los autores.
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Artículo de método
Ensayos de tolerancia al calor utilizando el sistema de monitoreo de actividad de Drosophila : una guía para una aplicación ejecutable para el análisis de datos
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Resumen
Resumen
El estudio de la tolerancia al calor en Drosophila melanogaster ha sido de particular interés para los investigadores durante décadas, con un enfoque común para evaluar la tolerancia al calor que es monitorear el tiempo hasta el derribo (TKD) después de la exposición a una temperatura elevada. Clásicamente, las moscas se alojan en viales individuales y se colocan dentro de un baño de agua caliente. A continuación, los investigadores controlan manualmente el TKD. Si bien están muy bien establecidos, siguen existiendo problemas de subjetividad y de aplicación coherente de una definición tangible de cese de todo movimiento, incluidos los espasmos musculares, al implementar estos ensayos manuales. Hemos desarrollado un método de alto rendimiento para automatizar los ensayos de tolerancia al calor utilizando los monitores de actividad TriKinetics Drosophila (DAM2). Para acompañar el sistema DAM2, hemos escrito un programa y hemos creado un ejecutable fácil de usar para leer automáticamente la última hora de movimiento a partir de los datos de actividad generados. A continuación, este script escribe en un archivo de .csv el tiempo de parálisis por calor (TKD) de cada mosca. Nuestros datos muestran que este método automatizado DAM2 es consistente y confiable. Mientras tanto, los perfiles de actividad creados a partir de los datos de recuento de actividad son de interés. Estos perfiles de actividad se pueden compilar y tienen el potencial de ampliar los ensayos de tolerancia al calor para incluir los componentes conductuales relativamente poco estudiados de la tolerancia al calor. Este protocolo describirá en detalle cómo utilizar el sistema DAM2 y el sistema HoTDAM! software para estimar la tolerancia al calor en D. melanogaster.
Introducción
Los ectotermos suelen responder al estrés por calor con un aumento de la actividad locomotora. Este fenómeno ha sido evidente para los investigadores durante décadas, con la respuesta conductual característica descrita por Cowles y Bogert en 19441. Describieron cómo un organismo sometido a estrés por calor mostrará primero un aumento del movimiento locomotor. A medida que el estrés por calor se acumula, se intercalan breves ráfagas de actividad con períodos de inactividad. La temperatura a la que el organismo ya no puede mostrar un movimiento coordinado es el máximo térmico crítico (CTmax). Siguen espasmos musculares y, finalmente, el organismo colapsa 1,2. Este colapso es difícil de definir y representa algo parecido al "rigor del calor, el coma o la muerte"2. Aquí utilizaremos el término colapso fisiológico para referirnos teóricamente a este punto final borroso del estrés térmico.
Drosophila melanogaster y otros insectos pequeños han sido modelos valiosos para estudiar el estrés por calor. Para estimar al menos una parte de la compleja colección de rasgos que constituyen la tolerancia al calor, muchos investigadores han observado manualmente el tiempo y la temperatura a la que se produce el colapso fisiológico, representando el tiempo hasta el derribo (TKD) y CTmax, respectivamente. Aunque están muy bien establecidos, estos métodos de ensayo manual sufren algunos inconvenientes. Una definición operacional de colapso fisiológico puede ser difícil de establecer y aplicar adecuadamente a todos los casos, especialmente cuando los observadores tienen menos experiencia. Por ejemplo, ¿en qué momento el organismo pasa de los espasmos musculares al colapso? El patrón de espasmos musculares y actividad convulsiva antes del colapso puede ser impredecible y puede complicar la observación precisa 2,3, amenazando la exactitud y precisión. Mientras tanto, la dificultad en la observación también limita el número de organismos que se pueden ensayar a la vez, lo que limita la escalabilidad.
Dado que un aumento en la actividad es una respuesta constante al calor y TKD y CTmax son, en última instancia, el punto en el que cesa la actividad, buscamos emplear los monitores de actividad de Drosophila (DAM2) de TriKinetics para automatizar los ensayos de tolerancia al calor. Recientemente hemos publicado un método para un ensayo automatizado, junto con un software fácil de usar, utilizando el sistema DAM24. El ensayo se validó comparando las medidas de tolerancia al calor en términos de TKD con un ensayo clásico de TKD basado en la observación manual a través de varios factores. También exploramos el componente de la actividad locomotora de los ensayos de TKD para caracterizar aún más el fenotipo de termotolerancia inducible. Llamamos al ensayo y al software que lo acompaña HoTDAM! (Ensayos de tolerancia al calor utilizando el sistema de monitorización de la actividad de Drosophila). Aquí proporcionamos una descripción detallada del método automatizado de ensayo de tolerancia al calor utilizando el sistema DAM2 y el HoTDAM! software. El ensayo es fácil de usar y fácilmente escalable para permitir la medición de muchos organismos a la vez.
En este manuscrito, realizamos ensayos de TKD en moscas mutantes termosensoriales (potencial receptor transitorio anquirina 1; TRPA1) y sus controles genéticos (White1118; w1118). Estos organismos se eligieron para enfatizar la importancia del aumento de la actividad característico observado durante el estrés por calor para el ensayo. Es decir, los organismos TRPA1 no muestran este comportamiento de escape, lo que ilustra la conexión intrínseca entre las respuestas conductuales conservadas y las estimaciones de tolerancia al calor, como el TKD. Realizamos el ensayo tanto para hembras como para machos, junto con la implementación de un pretratamiento de endurecimiento por calor. Los resultados representativos presentados aquí son datos de ensayos completamente nuevos que los utilizados en los ensayos de validación originales publicados anteriormente.
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Protocolo
1. Cría de moscas
- Elija la culata/línea de mosca apropiada para la investigación.
NOTA: Para ilustrar el ensayo, se utilizó el cepo de receptor TRPA1 de potencial transitorio y su control genético, el cepo w1118 . - Mantener las existencias de moscas en condiciones constantes, según corresponda. Para seguir este protocolo, las existencias de la casa a 25 °C en un ciclo diurno de 12:12 con alimentos estándar (harina de maíz, melaza y levadura torula).
- Separe a los hombres y las mujeres con anestesia ligera.
NOTA: Dependiendo del experimento, se pueden utilizar moscas vírgenes o apareadas.- Permita que los machos y las hembras adultos (por separado para ambas poblaciones) se apareen y ovipositen durante 5 días. Retira a los adultos de los biberones.
- A medida que los adultos comiencen a cerrar varios días después, vuelva a limpiar los biberones. Después de 2 días, separe los machos y las hembras con anestesia de éter ligero y permita que maduren por separado a una densidad de 25 moscas por vial.
2. Pretratamiento
- Aplicar el pretratamiento o variable independiente que definirá los grupos experimentales (genéticos, ambientales, farmacológicos, u otros).
- Para seguir este protocolo, separe a los adultos por sexo y, después de 5 días, pretrate a la mitad de los adultos sumergiendo un vial sellado que contenga los microorganismos en un baño de agua a 37 °C durante 1 h. Mantenga los controles de la incubadora a 25 °C. Deje que las moscas se recuperen durante 24 horas después del pretratamiento, antes del ensayo de tolerancia al calor.
3. Configuración del sistema DAM2
- Cargue las moscas en los tubos del monitor DAM2 y cubra los tubos en ambos extremos con algodón. Si se va a evaluar la tolerancia al calor de las moscas de inmediato, no use anestesia mientras carga los organismos en los tubos del monitor para evitar cualquier posible efecto de confusión asociado con la exposición a la anestesia. En su lugar, aspire moscas individuales de los viales de retención a los tubos del monitor.
- Coloque los tubos de ensayo en los monitores de actividad, tomando nota de los números de ranura en los que se cargan los diferentes grupos.
NOTA: Estos pueden ser aleatorios dependiendo del experimento si la ubicación dentro del monitor puede considerarse una variable de confusión. - Software de adquisición de datos DAM2
NOTA: El sistema y el software DAM2 se describen detalladamente en la hoja de datos del software DAMSystem3 disponible en el sitio web de la empresa (consulte la Tabla de materiales). Consulte las instrucciones de DAM2 para obtener información sobre la solución de problemas específicos y la funcionalidad general. Aquí proporcionamos orientación para el uso del sistema en el contexto de nuestro ensayo de tolerancia al calor.- El sistema DAM2 monitorea el número de veces que una mosca individual dentro de cada tubo rompe un haz infrarrojo. A continuación, el software de adquisición de datos indexa y restablece este recuento cada intervalo de tiempo definido. En preferencias, seleccione el intervalo de lectura que se utilizará en el ensayo. Hemos encontrado un intervalo de lectura de 15 s para lograr un buen equilibrio entre la resolución y los errores de lectura.
NOTA: Se recomienda que el intervalo de lectura no sea más corto en segundos que el número de monitores que se utilizan. Un intervalo de lectura más corto proporcionará una mejor resolución temporal al ensayo, pero también aumentará potencialmente los casos de errores de lectura. El software puede retrasarse al intentar indexar las lecturas. Además, una computadora más nueva y rápida contribuye en gran medida a prevenir errores de lectura. - Al considerar los errores de lectura, asegúrese de que el equipo que se utiliza para ejecutar el software de adquisición de datos DAM2 esté configurado para no dormir nunca o hibernar para no interrumpir el ensayo. Además, asegúrese de que las actualizaciones automáticas (incluidas las actualizaciones de red controladas por la institución) estén desactivadas mientras recopila datos.
- Compruebe que todos los monitores estén conectados y se comuniquen con el software. Confirme que el estado de cada monitor es verde en la pestaña de datos actual .
NOTA: Consulte la hoja de datos del software DAMSystem3 para obtener detalles sobre los problemas a los que se refieren los diferentes códigos de color. - El software de adquisición de datos escribirá automáticamente los recuentos de actividad en archivos de texto en la carpeta Datos dentro de los archivos del sistema. Para facilitar el análisis de datos, elimine todos los archivos de texto dentro de esta carpeta de datos antes de iniciar el software de adquisición de datos para cualquier ensayo.
NOTA: Los archivos de texto se completarán automáticamente, por lo que está permitido eliminarlos de esta carpeta para borrar los datos antiguos sin obstaculizar el programa.
- El sistema DAM2 monitorea el número de veces que una mosca individual dentro de cada tubo rompe un haz infrarrojo. A continuación, el software de adquisición de datos indexa y restablece este recuento cada intervalo de tiempo definido. En preferencias, seleccione el intervalo de lectura que se utilizará en el ensayo. Hemos encontrado un intervalo de lectura de 15 s para lograr un buen equilibrio entre la resolución y los errores de lectura.
4. Ensayo de tolerancia al calor
- Cargue los monitores en la incubadora de ensayos.
- Inicie el software de adquisición y deje que el software indexe durante un período de tiempo definido (por ejemplo, 40 índices o 10 minutos si el intervalo de lectura se establece en 15 s) antes de aplicar el estrés térmico.
NOTA: Esto permite cierta aclimatación a los tubos y la recuperación del movimiento de los monitores mientras se configuran. Especialmente si se está analizando la actividad durante el ensayo, este tiempo de aclimatación establecerá una actividad de referencia antes de la inducción del estrés térmico. Dependiendo de la naturaleza específica del ensayo que se esté realizando, se podría omitir esta fase de aclimatación, con los monitores colocados directamente en la incubadora ya a la temperatura de estrés. - Si realiza un ensayo estático (TKD), configure la incubadora para que se acelere lo más rápido posible a la temperatura nociva establecida después del período de aclimatación. La variable de respuesta se operacionalizará como el último tiempo de movimiento registrado (es decir, el último índice distinto de cero) para estimar el TKD.
- Si realiza un ensayo dinámico, determine la velocidad a la que aumentará la temperatura después del período de aclimatación. En este caso, la variable de respuesta medida es técnicamente el tiempo de nuevo. El momento en el que se registra el último movimiento coincidirá con una temperatura (CTmax), en función de la velocidad de rampa.
- Supervise los recuentos de actividad en tiempo real en la pantalla del sistema DAM en el software de adquisición o examine directamente los archivos de texto en la carpeta de datos en los archivos de programa DAMSystem3. Copie los archivos de texto y abra la copia en lugar del archivo original dentro de la carpeta de datos para evitar causar problemas con la grabación de datos en vivo.
- Después de que no se vea movimiento en ninguna de las moscas durante varios minutos, detenga el software de adquisición.
NOTA: Con nuestros ensayos, hemos encontrado que unos pocos o varios minutos de inactividad son indicativos de colapso fisiológico debido al estrés por calor similar al que se observa en los ensayos manuales clásicos de TKD. Sin embargo, esto depende de la conducta de escape espontánea. Como tal, considere las posibles variables de confusión si el tratamiento específico en la investigación podría alterar esta respuesta conductual. Además, dependiendo de los parámetros específicos del ensayo (por ejemplo, temperatura, tratamiento), la longitud del ensayo variará obviamente.
5. Organización y análisis de datos
NOTA: Consulte el video complementario S1 para obtener un tutorial sobre cómo descargar la aplicación ejecutable desde GitHub, así como la funcionalidad básica del software.
- Una vez que se hayan adquirido los datos, escanee los archivos de texto en busca de errores utilizando el software al que se hace referencia (consulte la Tabla de materiales) y seleccione puntos de inicio y finalización específicos para los datos de actividad de agrupación. Si se implementó un intervalo de aclimatación de 10 minutos, inicie el agrupamiento a los 10 minutos de la grabación de la actividad. Consulte la discusión para obtener más detalles sobre la agrupación en bins.
- Abra la página web de HoTDAM! software de análisis e importe los archivos de datos del monitor escaneados haciendo clic en Archivo | cargar datos del monitor.
NOTA: El software y la aplicación ejecutable están disponibles en GitHub (https://github.com/MatthewR47/HoTDAM) o en el sitio web de la empresa dentro de la sección Software de análisis . Tenga en cuenta que la aplicación ejecutable solo es compatible con los sistemas operativos Windows en este momento. - Agregue designaciones de grupo para indicar qué grupos de tratamiento corresponden a qué celda dentro de los monitores DAM2.
NOTA: El diseño de la interfaz del software corresponde al diseño de los monitores. - Haga clic en Iniciar definición de varios grupos para abrir un cuadro de diálogo y agregar una designación de grupo que se aplicará a varias celdas. Una vez que se acepta la designación de grupo, haga clic en las celdas para aplicar la designación de grupo, luego haga clic en Detener designación de grupo múltiple.
NOTA: El software organiza y exporta los datos de DAMSystem3 a .csv archivos para analizarlos en el software de estadísticas. - Exporte el TKD (es decir, el último índice distinto de cero) para cada mosca dentro de los monitores a un archivo .csv haciendo clic en Archivo | Exportar datos de derribo | Exportar todos los monitores o exportar los monitores seleccionados. El TKD para cada mosca se organizará en la salida por designación de grupo.
- Exporte los datos de actividad de cada mosca haciendo clic en Archivo | Exportar datos de actividad | Exporte todos los monitores o exporte los monitores seleccionados a un archivo .csv, conservando solo la marca de tiempo y los datos de recuento, lo que facilita el trabajo con el archivo de datos, al tiempo que asigna etiquetas de grupo designadas para cada mosca.
NOTA: Las primeras columnas de los archivos de datos DAMSystem3 corresponden a datos internos de los monitores (por ejemplo, monitorización de luz o mensajes de error) durante la adquisición. Los datos de recuento se encuentran en las columnas 11-42 (consulte la hoja de datos de DamSystem3 para obtener más detalles). Al exportar los datos de actividad con el software de análisis, se eliminarán todas las columnas, excepto la marca de tiempo y las columnas de datos de recuento. - Si realiza un experimento CTmax, utilice el TKD para determinar el CTmax utilizando la tasa de aumento de temperatura.
NOTA: El software de análisis se escribió de manera orientada a objetos en C# (código fuente disponible en GitHub; https://github.com/MatthewR47/HoTDAM) de modo que los aspectos del programa se pueden modificar fácilmente para permitir la personalización para cumplir con propósitos específicos.
6. Estadísticas
NOTA: Se pueden utilizar muchas pruebas diferentes para analizar los datos de TKD, dependiendo de los detalles de la configuración experimental.
- Utilice el análisis de supervivencia (p. ej., regresión de Cox, Kaplan-Meier) para conceptualizar el derribo como un evento que experimentará cada mosca dentro del ensayo.
NOTA: Para una revisión detallada, consulte la serie de 4 artículos de Bradburn y Clark sobre el análisis de supervivencia y su implementación 5,6,7,8. - Utilice el ANOVA para evaluar las diferencias entre grupos y comparar modalidades, especialmente cuando se valida el ensayo automatizado para afecciones específicas.
- Analice los datos de TKD utilizando el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier. Divida el archivo por existencias de modo que el análisis se realice por separado (por ejemplo, para las líneas de existencias TRPA1 y w1118 ). Elija la variable de tiempo como TKD (en min), el derribo como el evento, el pretratamiento como el factor y el sexo como los estratos.
- Realice las pruebas de rango logarítmico, Breslow y Tarone-Ware para comparar el pretratamiento para cada estrato (es decir, el sexo), con fines ilustrativos que muestren varios métodos.
- Construye parcelas de supervivencia.
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Resultados
Los análisis de las poblaciones TRPA1 y w1118 se realizaron por separado. Los percentiles de los tiempos de TKD y otros descriptivos se pueden encontrar en la Tabla 1.
| Percentilesa | ||||||||
| Sexo | Tratamiento | 25.00% | ||||||
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Discusión
El método de ensayo de tolerancia al calor que describimos aquí es versátil y escalable. Anteriormente hemos publicado un estudio de validación en el que comparamos el HoTDAM! método a un ensayo clásico de TKD basado en la observación y encontró que el ensayo automatizado muestra la misma tendencia general en varios factores4 (Figura 3). En otras palabras, de la misma manera que el ensayo manual clásico de TKD, el ensayo automatizado DAM2 pudo diferenciar los organism...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.
Agradecimientos
El proyecto descrito fue apoyado por becas del Premio de Desarrollo Institucional (IDeA) del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud (5P20GM103427 y 1U54GM115458). El Programa de Becarios de Investigación de Pregrado de la UNK y el Programa de Investigación de Verano para Estudiantes de Medicina de la UNMC.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubos de ensayo de poliestireno de 14 mL Falcon | 352057 | ||
| Pecera de 30 galones | Wal-mart | ||
| Botellas de 8 oz | Genesee | 32-129F | |
| Memmert | HPP750eco | ||
| harina de maíz | Lab Scientific FLY801010 | ||
| DAM2 Monitor de actividad de Drosophila | TriKinetics | DAM2 | (Hoja de datos de DAMSystem3) https://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Price%20List%202024.7.pdf |
| software de adquisición de datos DAMSystem | Descarga gratuita | TriKinetics | |
| Agar Drosophila | Laboratorio Científico | FLY80201 | |
| etanol | Fisher Scientific | BP82011 | |
| Éter | Fisher Scientific | E134-4 | |
| Software FileScan | TriKinetics | para escanear errores de texto, datos de agrupación y salida | |
| FlyStuff Flugs para botellas | Genesee | 49-100 | |
| FlyStuff Flugs para viales | Genesee | 49-102 | |
| Viales FlyStuff | Genesee | 32-113RL | |
| Software HoTDAM | Github o Trikinetics | https://github.com/MatthewR47/HoTDAM | |
| Calentador de circulación de inmersión | PolyScience | MX-CA11B | |
| melaza | Lab Scientific | FLY80084 | |
| ácido propiónico | Fisher Scientific | A258-500 | |
| Pyrex Tubos de vidrio 5 x 65 mm para DAM2 | TriKinetics | PGT 5x65 | https://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Price%20List%202024.7.pdf |
| pincel pequeño | Wal-mart | ||
| SPSS Estadísticas | IBM | ||
| tegosept | Lab Scientific | FLY55015 | |
| torula yeast | MP Biomedicals | 290308505 | |
| TRPA1 mutant stock | Bloomington Stock center | 26504 | w[1118]; TI{w[+mW.hs]=TI}TrpA1[1] |
| w1118 stock | Bloomington Stock center | 3605 |
Referencias
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- Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: history and critique. Can J Zool. 75, 1561-1574 (1997).
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- Rokusek, B., et al. HoTDAM! An easy-to-use automated assay expands the inducible thermotolerance phenotype in Drosophila melanogaster: Heat hardening reduces motility. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 286, 111522(2023).
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- Clark, T. G., Bradburn, M. J., Love, S. B., Altman, D. G. Survival analysis part IV: Further concepts and methods in survival analysis. Br J Cancer. 89 (5), 781-786 (2003).
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Reimpresiones y permisos
