Método novedoso y eficiente para la tinción de fluorescencia cardíaca de Drosophila con criosección

Resumen

El protocolo de imágenes de fluorescencia y seccionamiento cardíaco de Drosophila simplifica el estudio de la estructura y las patologías del corazón. Este enfoque implica secciones, tinciones e imágenes sencillas, sin pasar por la experiencia técnica necesaria para la disección tradicional. Mejora la accesibilidad, lo que convierte a Drosophila en un modelo más ampliamente utilizable para la investigación relacionada con el corazón dentro de la comunidad científica en general.

Resumen

Los modelos de corazón de Drosophila se emplean ampliamente en el estudio del envejecimiento cardíaco y el modelado de enfermedades cardíacas humanas. Sin embargo, la disección de los corazones de Drosophila antes de la obtención de imágenes es un proceso meticuloso que requiere mucho tiempo y habilidades motoras avanzadas. Para abordar estos desafíos, presentamos un protocolo innovador que utiliza la criosección para la obtención de imágenes de fluorescencia del tejido cardíaco de Drosophila . El protocolo se ha demostrado en imágenes del corazón adulto de Drosophila , pero podría adaptarse a las etapas de desarrollo. El método mejora tanto la eficiencia como la accesibilidad de la tinción de fluorescencia, al tiempo que preserva la integridad del tejido. Este protocolo simplifica el proceso sin comprometer la calidad de las imágenes, reduciendo así la dependencia de técnicos con formación y habilidades motoras altamente desarrolladas. En concreto, sustituimos técnicas complejas, como la succión capilar al vacío, por métodos más sencillos como la incrustación de tejidos. Este enfoque permite la visualización de las estructuras cardíacas con mayor facilidad y reproducibilidad. Demostramos la utilidad de este protocolo mediante la detección efectiva de marcadores cardíacos clave y el logro de imágenes de fluorescencia e inmunotinción de alta resolución que revelan detalles intrincados de la morfología del corazón y la organización celular. Este método proporciona una herramienta robusta y accesible para los investigadores que exploran la biología cardíaca de Drosophila , facilitando análisis detallados del desarrollo, la función y los modelos de enfermedad del corazón.

Introducción

Las enfermedades cardiovasculares (ECV) son la principal causa de muerte a nivel mundial, responsable de aproximadamente 17,9^{millones de muertes} cada año, lo que representa casi 1/3 de todas las muertes mundiales. Drosophila melanogaster (comúnmente conocida como mosca de la fruta) ha sido ampliamente utilizada como organismo modelo para estudiar las bases genéticas, celulares y moleculares del desarrollo cardíaco, la fisiología, el metabolismo, el envejecimiento y las miocardiopatías 1,2,3,4,5,6,7,8,9. Los modelos de Drosophila también se han utilizado para estudiar el papel del músculo cardíaco en la regulación sistémica de la obesidad¹⁰, un factor de riesgo importante para la morbimortalidad cardiovascular. Los estudios de secuenciación del genoma de Drosophila ¹¹ han revelado una conservación significativa de los genes en los seres humanos, incluidos los asociados con el desarrollo de varios órganos, incluido el corazón. Entre estos genes altamente conservados, algunos están implicados en la disfunción cardíaca, como las miocardiopatías o las canalopatías³. El reciente desarrollo de técnicas efectivas para estudiar el rendimiento cardíaco ha ampliado las aplicaciones del modelo para explorar los cambios a largo plazo en la fisiología cardíaca adulta debido a factores como el ejercicio, la dieta y el envejecimiento⁸. Sin embargo, los desafíos técnicos y logísticos a menudo dificultan el uso de este sistema modelo. Uno de los desafíos con el uso de Drosophila en estudios cardíacos es una disección precisa del corazón de una manera que preserve la citoarquitectura y los elementos miocárdicos.

El corazón de Drosophila o el vaso dorsal consiste en una estructura en forma de tubo formada por una sola capa de cardiomiocitos, células pericárdicas colocadas a lo largo de la pared del corazón, sostenidas por músculos alares, y en los adultos, acompañadas por una capa de células musculares longitudinales ventrales¹². La disección precisa para acceder a estas delicadas estructuras es un proceso que requiere mucho tiempo y trabajo. La norma actual implica una disección y una aspiración capilar al vacío técnicamente desafiantes, lo que requiere formación avanzada y habilidades motoras 13,14,15,16. Por lo general, la disección comienza con una incisión en la pared ventral del cuerpo, y los desafíos se presentan rápidamente con la minuciosa anatomía del corazón, su estructura frágil y su ubicación dorsal de difícil acceso. Esto, combinado con las técnicas tradicionales de disección, permite un análisis preciso de la estructura y función del corazón, proporcionando una herramienta mejorada para el estudio de las enfermedades cardiovasculares en Drosophila¹³. Por ejemplo, utilizando esto, Alayari et al. proporcionaron un protocolo para el marcaje fluorescente de estructuras cardíacas de Drosophila, lo que facilita la visualización de la morfología y la estructura cardíacas. A pesar de estos esfuerzos, la disección y tinción cardíaca tradicional enfrentan varios desafíos, incluida la dificultad de mantener la integridad del tejido y la capacitación especializada requerida para una tinción cardíaca efectiva.

El método ofrece una solución innovadora a este problema al reemplazar todo el procedimiento con un protocolo más simple que utiliza la crioinclusión del tórax y el abdomen de Drosophila , seguida de inmunotinción e imágenes de fluorescencia. Este enfoque fácil de aprender garantiza una visualización más rápida y sencilla de las estructuras cardíacas con una mayor reproducibilidad. Además, describimos un método simple que involucra hielo seco que asegura una alineación uniforme de la cutícula abdominal de Drosophila en el mismo plano z, lo que agiliza el paso de criosección aguas abajo. Demostramos la efectividad de este protocolo en la detección de marcadores cardíacos importantes, morfología cardíaca y organización celular con microscopía inmunofluorescente y confocal. La facilidad y la alta eficacia de este enfoque son particularmente útiles para los estudios cardíacos de alto rendimiento basados en Drosophila.

Protocolo

1. Preparación del equipo

1. Asegúrese de que el criostato esté encendido y ajustado a -20 °C. Deje que transcurra el tiempo adecuado para que la temperatura alcance este punto. Si la máquina está a temperatura ambiente, el enfriamiento a la temperatura óptima de corte puede tardar unas 5 h.
2. Encienda el calentador de portaobjetos o la incubadora, asegurándose de que esté ajustado a 37 °C. Asegúrese de que los portaobjetos tengan tiempo suficiente para alcanzar la temperatura deseada.
   NOTA: En esta etapa, los portaobjetos etiquetados se pueden colocar en el calentador o la incubadora y dejarlos indefinidamente hasta que se seccionen.
3. Asegúrese de que el hielo seco esté listo para su uso. El hielo puede retirarse del almacenamiento a -80 °C una vez que se ha alcanzado el paso 5.

2. Preparación de soluciones

1. Prepare 50 mL de PBS. Prepare 10 mL de ácido tetraacético de etilenglicol 10 mM en PBS. Prepare una solución de paraformaldehído al 4% en PBS donde el volumen final sea igual a 100 μL multiplicado por el número de grupos experimentales.
2. Prepare una solución de limpieza de etanol al 70% en agua en una botella rociadora. Prepare todas las soluciones de tinción fluorescentes.
   NOTA: Este protocolo detallará cómo realizar tinciones simples utilizando tinciones o tintes fluorescentes simples. En este caso, describiremos el uso de 1x Phalloidin 594 en una proporción de 1:250 en PBS. Las concentraciones de tinción fluorescente variarán según el reactivo y los objetivos experimentales. Se deben realizar pruebas preliminares para encontrar la concentración adecuada. La tinción de anticuerpos no se detallará aquí, pero debe ser aplicable utilizando métodos de tinción convencionales.

3. Recolección de tejido

1. Anestesiar de 5 a 10 moscas con una colchoneta de moscas de CO₂ y colocar las moscas a la vista bajo el microscopio con un aumento de 1x-2x. El regulador de CO₂ debe registrar entre 1 y 5 kPa en la mata de CO₂ .
   NOTA: Existen otros métodos para anestesiar (por ejemplo, FlyNap²), y estos métodos no afectan significativamente los resultados.
2. Con unas tijeras de resorte, decapita, corta las alas y quita las patas de 5 a 10 moscas. Lo que queda es el tórax y el abdomen, juntos se denominarán el cuerpo.
   NOTA: Para alinear los cuerpos de las moscas correctamente en el paso 5, las longitudes restantes de las alas o las patas no deben interferir con una alineación plana a lo largo de la parte inferior del molde. Para ello, recorta las alas y las patas lo más cerca posible del tórax.
3. Con un cepillo, coloque suavemente los cuerpos en tubos etiquetados de 1,5 ml sobre hielo hasta que se hayan recogido todos los grupos experimentales.

4. Fijación de tejido entero

1. Después de retirar los tubos del hielo, agregue 100 μL de 10 mM de EGTA, pH 8, en cada tubo para relajar el tejido cardíaco dentro del abdomen. Asegúrese de que todos los cuerpos estén sumergidos durante 10 minutos y colocados en el agitador orbital. La centrífuga de mesa se puede utilizar para facilitar la inmersión de los cuerpos.
2. Retire y deseche la solución en el tubo. Pipetear 100 μL de PBS en cada tubo para lavar el tejido durante 10 min, colocándolo en el agitador orbital. Retirar y desechar una vez transcurrido el tiempo.
3. Pipetear 100 μL de paraformaldehído al 4% en solución de PBS en cada tubo. Asegúrese de que todos los cuerpos estén sumergidos en la solución.
4. Coloque en un agitador orbital durante 15 minutos, ajustando la velocidad a alrededor de 100 unidades. Asegúrese de que el ajuste no agite los tejidos fuera de contacto con la solución.
5. Una vez transcurrido este tiempo, deseche el PFA y reemplácelo con 1x PBS durante 10 minutos, asegurándose nuevamente de que todos los cuerpos estén en contacto con la solución. Regrese los tubos al agitador orbital a una velocidad similar a la del paso 4.4 para cada lavado restante.
6. Desechando la solución anterior cada vez, lave el pañuelo con PBS 2x durante 10 minutos cada uno, para un total de 3 lavados.
7. Después de desechar el lavado final, transfiera los cuerpos a una sacarosa al 10% en una solución de PBS, asegurándose de que entren en contacto con la solución dentro del tubo. Para una saturación óptima, déjelos toda la noche o el tiempo suficiente para que los cuerpos se hundan hasta el fondo.
   NOTA: Se prefiere la crioprotección durante la noche, pero si es necesario tomar imágenes el mismo día, permita el mayor tiempo posible para que el crioprotector se infiltre en el tejido.

5. Preparación del molde

1. En este punto, recupere el hielo seco del almacenamiento y seleccione algunas piezas para colocarlas en una pequeña bandeja de metal o plástico. Las dimensiones de la bandeja deben ser tales que se pueda insertar el molde, colocándolo directamente encima de un solo trozo de hielo seco grande y preferiblemente plano.
2. Llene un molde etiquetado aproximadamente el 50% con compuesto de temperatura óptima de corte (OCT). Intenta reducir la introducción de burbujas dejando que el compuesto fluya lentamente.
3. Con un cepillo, coloque con cuidado los cuerpos en la superficie del OCT dentro del molde. Múltiples grupos experimentales deben estar claramente separados en esta etapa.
   NOTA: Es importante evitar la dilución del compuesto OCT a través de la contaminación con la solución de sacarosa por el cepillo. Además, la colocación profunda en la OCT con el cepillo puede crear muchas burbujas de aire. Evite estos errores para evitar problemas de seccionamiento más adelante.
4. Con pinzas, empuje cada cuerpo hasta el fondo del molde con la pared dorsal del tórax y el abdomen, generalmente a lo largo de la parte inferior. Luego, ajuste el cuerpo de manera que el abdomen tenga prioridad como plano a lo largo de la parte inferior del molde. Alinee todos los cuerpos en las dimensiones X, Y y Z de modo que cada sección contenga todos los sujetos simultáneamente.
5. Puede haber una curvatura del abdomen, particularmente en los machos; Aplanar esto lo mejor que pueda el técnico. Esto es esencial para que se recojan secciones más largas en el plano coronal. Evite perforar o aplastar los cuerpos contra el fondo del molde durante este proceso. Trabaja metódicamente para alinear cada tema correctamente.
6. Una vez que todos los sujetos estén en su lugar, tome el molde y coloque la parte inferior directamente encima de un trozo de hielo seco. Verifique si la OCT comienza a congelarse después de unos momentos después del contacto. Deje que esto continúe hasta que todos los sujetos estén envueltos en la parte congelada del molde.
7. Una vez alcanzada esta etapa, transfiera el molde a -20 °C para congelar por completo. Llene la porción restante del molde cuando la primera porción esté completamente congelada. A continuación, los moldes pueden almacenarse a -80 °C para su uso posterior envolviéndolos en papel de aluminio o cortarlos inmediatamente.
   NOTA: Evite la exposición al aire libre a -20 °C y -80 °C entre las dos etapas de congelación. Esto puede hacer que se desarrolle humedad entre las capas.

6. Crioseccionamiento de moldes

NOTA: Por lo general, es aconsejable preparar y cortar un molde en blanco antes de cortar los moldes de grupo experimental. Esto nos permite garantizar el correcto funcionamiento de la rueda, la cuchilla y el vidrio estabilizador inmediatamente antes de seccionar el tejido. Además, permita que los moldes que provengan de un almacenamiento más frío se aclimaten en el criostato durante 30 minutos.

1. Fije la broca al molde aplicando una cantidad generosa de OCT al bloque y colocando la broca encima, presionándola para que quede plana. Deje que esto se congele completamente en el criostato, generalmente dentro de los 5 minutos.
2. Suelte la broca y el bloque OCT del molde y colóquelo en el mandril, asegurándose de que el bloque permanezca correctamente orientado de arriba a abajo. Apriete la llave del mandril hasta que la broca esté segura.
3. Alinee el bloque con la hoja usando las perillas de ajuste y los controles de profundidad del mandril. Establezca el ancho de sección en 20 μM o menos.
   NOTA: Las secciones más delgadas son más deseables para aumentar el número de secciones posibles recolectadas. Las primeras 2-6 secciones de cada sujeto deben contener las partes deseadas y sin obstrucciones del corazón, que es una función de la orientación y el ancho de la sección. Hay que intentar conseguir la orientación correcta del mandril antes de cortar las importantes 2-6 secciones.
4. Corte cada rebanada con un movimiento lento pero constante, permitiendo que el vidrio estabilizador capture cada rebanada. Recopile secciones utilizando diapositivas calentadas. Deje que los portaobjetos se sequen a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos, pero no más de 1 hora antes de la primera ronda de lavados.

7. Tinción de fluorescencia

1. Inmediatamente después del período de secado, elimine el exceso de OCT que rodea las secciones con una cuchilla de afeitar. Tenga cuidado de evitar encontrarse con el tejido en esta etapa. Si el portaobjetos está destinado a teñirse en un momento posterior, guárdelo a -80 °C.
2. Delinea este borde en cada diapositiva con un marcador hidrofóbico. Este borde servirá para mantener las soluciones de lavado y tinción en el tejido.
   NOTA: Este protocolo describe cómo realizar la tinción y el lavado utilizando un método de pipeta, también se pueden usar cubos deslizantes y rejillas. Simplemente sustituya el pipeteo de soluciones en la parte superior de los portaobjetos por la inmersión de los portaobjetos en cada una de las soluciones frescas. Al igual que hemos hecho recientemente con las imágenes cerebrales¹⁷, un procedimiento de inmunotinción también se puede aplicar a la tinción cardíaca.
3. Lave todos los portaobjetos 3 veces durante 5 minutos cada uno con PBS pipeteando suavemente sobre el portaobjetos, evitando pipetear directamente sobre el tejido cuando sea posible. Realice esto con la pipeta de 1000 μL y las puntas asociadas. Trate de no inyectar rápidamente la solución, ya que esto puede hacer que los tejidos se desprendan de la superficie del portaobjetos.
4. Deseche el lavado final y pipetee la solución de tinción de fluorescencia (1:250, 1x Phalloidin) sobre los pañuelos. Deje que se incube durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.
5. Después de este punto, los sujetos son sensibles a la luz. Realice todos los pasos posteriores en la oscuridad o cubriendo las diapositivas. Deseche la tinción de fluorescencia y, con la pipeta de 1000 μL, lave 3 veces durante 5 minutos con PBS.

8. Montaje y preparación para la obtención de imágenes

1. Deseche el lavado final, dejando una pequeña cantidad de PBS en el portaobjetos. Pipetee 3-5 gotas de medio de montaje en el portaobjetos con la pipeta de 1000 μL, evitando el despliegue directo sobre el tejido.
2. Coloque el cubreobjetos en la corredera de manera que se minimice la producción de burbujas de aire. Para mayor facilidad, use pinzas para colocar el cubreobjetos en un borde y baje gradualmente el otro lado hasta que quede al ras con el portaobjetos. Manipule las guías recién montadas con cuidado y guárdelas en posición horizontal durante al menos 24 h a 4 °C.
3. Selle los portaobjetos con esmalte de uñas o, si el medio de montaje se está endureciendo, evítelo. No se deben usar esmaltes de uñas que contengan neón o purpurina. Dependiendo de la tinción fluorescente, se pueden realizar imágenes de inmediato o almacenar portaobjetos para su posterior captura.

9. Imágenes

NOTA: Se utilizó un microscopio Olympus BX 63 con lentes de 10x, 40x y 60x para la captura de imágenes. También se utilizaron los filtros adecuados para DAPI, Lipid Spot 488 y Phalloidin 594.

1. Antes de tomar imágenes, inspeccione los portaobjetos y límpielos con una toallita de papel y una solución de etanol al 70% en agua. Si se obtienen imágenes de las guías inmediatamente después del montaje, tenga especial cuidado al limpiarlas para evitar alterar el cubreobjetos.
2. Seleccione los tiempos de exposición adecuados para cada canal en función de los sujetos fluorescentes más brillantes dentro del experimento general. Evite la sobresaturación mientras genera una imagen lo más brillante posible y reduce el fondo. Examine rápidamente a cada grupo experimental con una vista en vivo de cada canal para asegurarse de que las exposiciones se establezcan correctamente.
3. Concéntrese en cada tema, utilizando el mismo canal en todos los temas para mantener la coherencia. Luego, captura cada sujeto. Capture todos los grupos experimentales utilizados para la comparación el mismo día para evitar diferencias en la desintegración fluorescente entre los grupos comparados.
4. Después de la toma de imágenes, guarde las diapositivas en la oscuridad a 4 °C para volver a capturar la imagen más tarde.

Resultados

El método descrito anteriormente facilita el estudio del corazón de Drosophila mediante imágenes de fluorescencia sin disección tediosa. Este es el principal beneficio de este método, ya que el método convencional de disección cardíaca requiere el desarrollo de habilidades motoras complejas. Como se ilustra en la Figura 1, el método es más accesible que la disección cardíaca para los nuevos investigadores y permite la flexibilidad del experimento. Alternativamente, utilizando el alm...

Discusión

Hemos desarrollado un protocolo eficiente para preparar un tubo cardíaco de Drosophila para su visualización utilizando imágenes fluorescentes o confocales. Esto está precedido por una discusión de un método comúnmente utilizado, pero que requiere mucho tiempo y trabajo, para acceder y monitorear la integridad citológica del corazón de Drosophila. Nuestro método innovador y eficiente ofrece una alternativa concisa y eficiente a los enfoques tradicionales mediante la uti...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1000 y micro; L Pipeta	Eppendorf	3123000063
1000 µ L Puntas de pipeta	Olympus Plastics	23-165R
10X Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Fisher	J62036.K7	ph=7.4
Etanol de 200 pruebas	Decon Laboratories	64-17-5
20X Tris Solución salina tamponada	Thermo Scientific	J60877. K2	pH = 7.4
Vidrio estabilizador	IMEB	AR-14047742497
Albúmina de suero bovino	Fisher	9048-46-8
Tubos de centrífuga 1,5 mL	Fisher	05-408-129
Portaobjetos cargados	Globe Scientific	1415-15
Moldes de criosección	Fisher	2363553
Cryostat	Leica	CM 3050 S Cuchillas
de criostato	C.L. Sturkey	DT554N50
Hielo seco
Pinzas finas	Herramientas de ciencia fina	11254-20
Almohadilla para moscas	Tritech Research	MINJ-DROS-FP
Endurecimiento Medios de montaje con Dapi	Vectashield	H-1800
Kimwipes	Kimtech	34120
Microscopio	Olympus	SZ61
Temperatura óptima de corte compuesto	Fisher	4585
Paraformaldehído 20%	Ciencias de la microscopía electrónica	15713
Faloidina 594	Abnova	U0292
Hojas de afeitar	Gravey	#40475
Tijeras de resorte	Herramientas de ciencia fina	15000-10
Sacarosa	Fisher	S5-500