Artículo de método

Desarrollo y Evaluación de Modelos de Infección Intracelular por Staphylococcus aureus

DOI:

10.3791/67834

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17 de enero de 2025

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1Medical Research Institute, Southwest University, 2National Engineering Research Center of Immunological Products, Third Military Medical University, 3School of Pharmacy, University of South China

En este artículo

Resumen

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El Staphylococcus aureus (S. aureus) tiene la capacidad de diseminarse por todo el cuerpo, causando infecciones persistentes y recurrentes. Para comprender mejor estos procesos, este estudio establece un modelo de infección intracelular para S. aureus. Este modelo proporcionará una base crucial para investigar los mecanismos detrás de las infecciones intracelulares.

Resumen

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El S. aureus puede invadir y persistir dentro de las células huésped, incluidas las células inmunitarias, lo que le permite evadir la detección y eliminación inmunitaria. Esta persistencia intracelular contribuye a infecciones crónicas y recurrentes, complicando el tratamiento y prolongando la enfermedad. En consecuencia, existe una necesidad crítica de un modelo de infección intracelular para comprender, prevenir y tratar mejor las infecciones causadas por S. aureus. Este estudio indicó que los antibióticos eliminaban eficazmente las bacterias extracelulares, pero no podían erradicar las que habían entrado en las células. Así, se estableció una infección intracelular estable in vitro mediante RAW264.7 infectado con S. aureus y co-cultivándolos con antibióticos. Posteriormente, se estableció un modelo de infección intracelular en ratones mediante la inyección de macrófagos peritoneales que contenían la infección intracelular. La vancomicina eliminó eficazmente las cargas bacterianas en ratones desafiados con S. aureus planctónico; sin embargo, fue ineficaz contra ratones infectados con niveles iguales o inferiores de bacterias intracelulares dentro de los macrófagos peritoneales. Esto indica que el modelo de infección intracelular de S. aureus se estableció con éxito, ofreciendo información potencial para la prevención y el tratamiento de infecciones intracelulares.

Introducción

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S. aureus es un patógeno altamente contagioso que puede causar una variedad de infecciones, incluidas infecciones de la piel y los tejidos blandos, sepsis, meningitis, neumonía y endocarditis1. El mal uso clínico de los antibióticos ha provocado un aumento de la resistencia en S. aureus y la aparición de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM), que supone una importante amenaza para la salud pública en muchos países2.

Aunque S. aureus no se clasifica tradicionalmente como un patógeno intracelular, la evidencia emergente sugiere que puede colonizar persistentemente las células huésped después de la invasión3. La capacidad de S. aureus para sobrevivir intracelularmente dentro de los fagocitos del huésped es cada vez más reconocida como un mecanismo que facilita la infección metastásica y la diseminación a través del huésped 4,5,6. S. aureus segrega varios factores de virulencia, que crean un ambiente inmunológico que promueve su supervivencia y complica la capacidad del huésped para eliminarlo por completo7. El regulador de genes accesorios (agr) y los elementos auxiliares estafilocócicos (Sae) son dos importantes reguladores de virulencia que están estrechamente relacionados con la supervivencia de Staphylococcus aureus en fagocitos 8,9. El sistema agr es un mecanismo de detección de quórum que regula la expresión de numerosos factores de virulencia en S. aureus. Controla la producción de toxinas y otros factores que facilitan la supervivencia y diseminación bacteriana. Durante la infección intracelular, el sistema agr desempeña un papel fundamental en la regulación de los factores de virulencia que son esenciales para la capacidad de la bacteria para evadir las respuestas inmunitarias del huésped y sobrevivir dentro de las células del huésped. Los estudios han demostrado que el sistema agr influye en la capacidad de la bacteria para escapar de los fagosomas y persistir dentro de los macrófagos. La ausencia de agr puede conducir a una reducción de la supervivencia bacteriana dentro de las células huésped y a una disminución de la virulencia10,11. El sistema Sae es un sistema regulador de dos componentes que controla la expresión de varios factores de virulencia en S. aureus. Está involucrado en la regulación de toxinas y enzimas que contribuyen a la capacidad de la bacteria para invadir y dañar los tejidos del huésped. El sistema Sae también desempeña un papel crucial en la supervivencia intracelular de S. aureus. Influye en la capacidad de la bacteria para resistir la muerte de los fagocitos del huésped y evadir la degradación autofágica12,13.

Cuando los patógenos invaden, los macrófagos tienen funciones fagocíticas, que pueden engullir y matar patógenos extraños y activar la respuesta inmune adaptativa14. La mayoría de las bacterias invasoras son fagocitadas por los macrófagos, que luego activan varios mecanismos de eliminación para eliminarlas. Sin embargo, algunas bacterias S. aureus pueden sobrevivir dentro de los macrófagos, lo que lleva a una infección persistente del huésped. Además de las proteínas bacterianas, el huésped también influye en la supervivencia y proliferación de S. aureus dentro de los macrófagos mediante la secreción de citocinas 15,16,17. Algunos estudios indican que S. aureus puede evadir la degradación al residir en los autofagosomas, creando un nicho intracelular que promueve la diseminación18. S. aureus escapa a la degradación autofágica bloqueando el flujo de autofagia (por ejemplo, LC3-II, p62) y aumentando el pH dentro de los autolisosomas después de la invasión de macrófagos19. Esta evasión inmunitaria se logra a través de la regulación de los factores de virulencia y autofagia de S. aureus, lo que conduce a infecciones persistentes y ocultas.

La eliminación de las infecciones intracelulares por S. aureus es crucial para el tratamiento de las infecciones persistentes y latentes en la práctica clínica. En la actualidad, los antibióticos son el tratamiento primario para las infecciones por S. aureus, y la vancomicina es la última línea de defensa para las infecciones por SARM20,21. Sin embargo, numerosos estudios han demostrado que los antibióticos existentes son ineficaces para eliminar el S. aureus intracelular, tanto in vivo como in vitro 22,23,24.

Actualmente no existe un estándar unificado para los diversos modelos de infección intracelular de S. aureus 25,26,27, ya que las condiciones de cada modelo difieren significativamente. En consecuencia, no se pueden aplicar los mismos criterios para evaluar la eficacia de estos modelos. En este estudio, establecimos un modelo de infección intracelular universal de Staphylococcus aureus mediante la optimización de las condiciones experimentales. Este modelo ofrece una mayor comodidad en comparación con otros, ya que permite la infección inicial de bacterias en células in vitro, seguida de la entrega de estas células infectadas en el cuerpo.

Para comprender mejor los mecanismos de la infección intracelular por S. aureus y desarrollar fármacos relacionados, establecimos modelos in vitro e in vivo . Se creó con éxito un modelo de infección intracelular estable in vitro infectando RAW264.7 y cocultivándolos con antibióticos. Luego, se extrajeron los macrófagos peritoneales y se formaron en infecciones intracelulares. Se estableció un modelo de infección intracelular en ratones mediante la inyección de estos macrófagos peritoneales.

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Protocolo

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Los animales de experimentación, ratones hembra BALB/c de 6-8 semanas de edad, libres de patógenos específicos (SPF), se compraron a Beijing HFK Bioscience Co., Ltd (Beijing, China). Todos los estudios con animales fueron aprobados por el Comité de Ética y Bienestar de los Animales de Laboratorio de la Tercera Universidad Médica Militar y se realizaron de acuerdo con las políticas y directrices institucionales y nacionales para el uso de animales de laboratorio. Los ratones se mantuvieron y vacunaron en instalaciones de SPF y se les proporcionó acceso gratuito a alimentos y agua estériles. Los animales se dividieron aleatoriamente en grupos y se les concedió un tiempo de adaptación de al menos 7 días antes del comienzo de los experimentos.

1. Preparación para S. aureus

  1. Recuperación de cepas: Obtener un tubo de MRSA252 congelada, cauterizar y enfriar el anillo de inoculación para obtener un anillo de solución bacteriana, inocular las bacterias en placas de agar tríptico de soja (TSA) (ver Tabla de Materiales) por el método de la placa de rayas28, y cultivar durante la noche a 37 °C.
  2. Activación bacteriana: Al día siguiente, tome un matraz agitador de 50 mL y agregue 20 mL de medio de Caldo de Soja Tríptico (TSB) (ver Tabla de Materiales). Elija una sola colonia con una punta de pipeta de 10 μL y añádala al agitador. Incubar las colonias durante la noche a 220 rpm, 37 °C.
  3. Activación secundaria: Al día siguiente, tome un matraz agitador de 50 mL que contenga 15 mL de medio TSB. Retirar 200 μL de solución bacteriana del agitador que contiene las primeras bacterias activadas, añadir a un nuevo matraz que contenga 20 mL de medio TSB e incubar a 220 rpm, 37 °C durante 4 h.
  4. Recoja la solución bacteriana activada secundaria en un tubo de centrífuga de 50 ml, centrifugue a 3.000 x g durante 10 minutos y deseche el sobrenadante.
  5. Resuspender las bacterias precipitadas en 10 mL de solución salina y centrifugar a 3.000 x g durante 10 min. Repita este paso 2 veces.
  6. Mida el valor OD600 de la solución bacteriana y ajústelo a 1.0 con solución salina. En este momento, la cantidad bacteriana de MRSA252 en este experimento fue de 1,0 x 109 UFC/mL.
    NOTA: La solución bacteriana se añade a un medio sin antibióticos y se diluye hasta la concentración deseada; Todas las bacterias utilizadas en este experimento fueron preparadas por el método anterior.

2. Establecimiento de un modelo de infección intracelular in vitro

  1. Preparación de células RAW264.7
    NOTA: Las líneas celulares utilizadas en este estudio se obtuvieron de ATCC. Todas las líneas celulares dieron negativo para la contaminación por micoplasma. Todos los experimentos se realizaron en células en la fase de crecimiento logarítmico.
    1. Retire las células del nitrógeno líquido y descongélelas en un baño de agua a 37 °C.
    2. Coloque las células RAW264.7 en un tubo centrífugo de 15 mL, agregue 2 mL del medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM; consulte la Tabla de Materiales) suplementado con 10% de suero fetal bovino (consulte la Tabla de Materiales), penicilina (100 unidades/mL) y estreptomicina (100 μg/mL; consulte la Tabla de Materiales; medio completo) a 37 °C en 5% de CO2. Centrifugar a 300 x g durante 5 min.
    3. Semilla 3 x 106 células RAW264.7 en placas de 100 mm con 10 mL de medio completo. Mantener durante 12 h en una incubadora de cultivos celulares a 37 °C en CO2 al 5% para que la confluencia de las células esté entre el 50%-60%.
  2. Infección intracelular in vitro
    1. Tome 10 μL de suspensión celular y agréguelo al contador de células para calcular la concentración celular. Cuente y siembre 2 x 105 células RAW264.7 en una placa de 24 pocillos (ver Tabla de Materiales) utilizando 1 mL de medio completo para cada pocillo y manténgalo en una incubadora de cultivo celular durante 10-12 h.
    2. Retire el sobrenadante y agregue 1 mL de medio completo que contenga 2 x 106 UFC de solución bacteriana (paso 1.6) a cada pocillo. Colóquelo en la incubadora de cultivos celulares durante 2 h. El MRSA252 infectado multiplicidad de infecciones
      (MOI) es 10. (Para verificar la correlación entre varios valores de multiplicidades de infección (MOI) y la fagocitosis de las bacterias por las células, establecimos grupos experimentales con valores de MOI de 20, 30, 40 y 50).
      NOTA: El medio completo utilizado para infectar las células no contiene penicilina ni estreptomicina.
    3. Retire el sobrenadante y lave las celdas 2 veces con PBS (consulte la tabla de materiales). Añadir 800 μL por pocillo de DMEM con 100 μg/mL de gentamicina (ver Tabla de Materiales) y colocar en la incubadora de celdas a 37 °C en 5% CO2 durante 2 h.
  3. Evaluación de un modelo de infección intracelular in vitro
    1. Ensayo de eliminación intracelular de S. aureus
      1. Recoja las celdas RAW264.7 (pasos 2.2.2 y 2.2.3) por separado en tubos de centrífuga. Lave las celdas 2 veces con PBS, agregue una solución de Triton X-100 al 0,1% (consulte la tabla de materiales) a cada tubo durante 5 minutos y recoja el lisado en los tubos de centrífuga.
      2. Utilice PBS para diluir el lisado en serie. Tome 20 μL de lisado y añádalo a un tubo de microcentrífuga que contenga 180 μL de PBS, luego mezcle bien mediante pipeteo. Diluir paso a paso siguiendo este procedimiento. Localice cada dilución del lisado en placas de TSA e incube durante la noche a 37 °C. Cuente las colonias en las placas de TSA para el lisado (Figura 1A).
        NOTA: Además, investigamos las condiciones experimentales óptimas para la infección intracelular de MRSA252 en macrófagos peritoneales. La carga bacteriana en macrófagos peritoneales infectados con MRSA252 y tratados con concentraciones variables de gentamicina se muestra en la Figura 1B, mientras que la carga bacteriana después del tratamiento con 100 μg/mL de gentamicina durante diferentes duraciones se muestra en la Figura 1C.
      3. Diluya el sobrenadante y el lisado en serie con PBS como se describe en la Sección 2.3.1.2, y observe las colonias en las placas TSA para el sobrenadante y el lisado (Figura 2A).
    2. Microscopio de barrido láser confocal (CLSM)
      1. Diluir las células RAW264.7 (paso 2.2) en 2 x 105 células/ml en una placa de Petri confocal (ver Tabla de materiales) y colocarlas en una incubadora de células para su adhesión durante la noche a 37 °C en CO2 al 5%. Agregue 1 mL de medio completo que contenga 2 x 106 UFC y 4 x 106 solución bacteriana (paso 1.6) a cada placa de Petri confocal y colóquela en la incubadora de celdas durante 2 h, haciendo el MOI 10 y 20, respectivamente.
      2. Retirar el sobrenadante y lavar las células 3 veces con PBS, añadir 100 μg/mL de gentamicina DMEM durante 2 h y eliminar las bacterias extracelulares. A continuación, retire el sobrenadante y lave las celdas 2 veces con PBS, añada el líquido de trabajo DIL (véase la tabla de materiales) e incube a 37 °C durante 5 min en la oscuridad.
      3. Retire el líquido de trabajo DIL y lave 3 veces con PBS, y fije con una solución de paraformaldehído al 4% (consulte la tabla de materiales) durante 20 minutos.
      4. Retire la solución de paraformaldehído y lave 3 veces con PBS, agregue el tinte DAPI (consulte la Tabla de materiales) e incube durante 5 minutos en la oscuridad. Retire la solución de tinte DAPI y lave 5 veces con PBS. Utilice CLSM para observar las celdas (Figura 2B).
        NOTA: Este trabajo utilizó MRSA252 diseñado con una proteína fluorescente verde (GFP), que se construyó utilizando el método de recombinación homóloga29.

3. Establecimiento de un modelo de infección intracelular in vivo

  1. Adquisición de macrófagos peritoneales en ratones
    1. Prepara un caldo de almidón al 6%. De acuerdo con la relación de masa 3:10:5 (p/p), agregue tres tipos de excipientes (extracto de carne de res en polvo, triptona, cloruro de sodio; ver Tabla de Materiales) sucesivamente en el recipiente de vidrio. Agregue 1 L de ddH2O a un recipiente de vidrio, revuelva para derretir y caliente en el microondas. Agregue almidón soluble (ver Tabla de Materiales) con una proporción de masa de 6, revuelva para derretir y asegúrese de esterilizar el recipiente de vidrio en autoclave a 121 °C durante 30 min. Conservar en el frigorífico a 4 °C hasta que se convierta en una pasta.
    2. Recoja los macrófagos peritoneales de ratón siguiendo los pasos que se describen a continuación.
      1. Escoge dos ratones Balb/c. Usa la mano izquierda para agarrar el cuello del ratón y controlar la cola. Voltee el mouse y deje la cabeza hacia abajo y el abdomen hacia arriba (Figura 3A). Administrar inyección intraperitoneal de caldo de almidón al 6%, 3 mL por ratón (Figura 3B).
        NOTA: Debido a la gravedad, los órganos de la cavidad abdominal caerán hacia atrás hasta el pecho, evitando que la jeringa lesione otros órganos.
      2. Después de 72 h, anestesiar a los ratones con isoflurano al 3% y luego sacrificarlos por luxación cervical. Desinféctalos con alcohol etílico al 75%. Use una tijera oftálmica para abrir el abdomen del ratón y exponer completamente su peritoneo (Figura 4A-C).
      3. Inyectar 10 mL de medio DMEM en los ratones para lavar la cavidad abdominal mediante inyección intraperitoneal (Figura 4D). Después de inyectar DMEM en la cavidad abdominal de los ratones, frote suavemente el abdomen de los ratones durante aproximadamente 1 minuto para lavar el abdomen más a fondo. Use una jeringa para recolectar el líquido de lavado en un tubo de centrífuga de 50 mL (Figura 4E).
      4. Centrifugar el líquido de lavado a 300 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante.
      5. Use 10 ml de DMEM suplementado con suero fetal bovino al 10%, penicilina (100 unidades/ml) y estreptomicina (100 μg/mL; medio completo) para soplar y succionar las células recolectadas, contarlas y diluir la concentración celular a 2 x 106/mL y aplicar en placas de 6 pocillos (ver Tabla de materiales), 1 mL por pocillo.
      6. Colocar la placa de 6 pocillos a 37 °C en 5% de CO2, incubar durante 4 h y luego retirar el sobrenadante. Lave las células 2 veces con PBS estéril y cultive durante la noche con 1 mL de DMEM por pocillo a 37 °C en 5% de CO2.
  2. Preparación de bacterias intracelulares
    1. Incubar los macrófagos peritoneales (paso 3.1.2) con MRSA252 durante 2 h. Retire el sobrenadante y lave las celdas 2 veces con PBS. Añadir medio completo DMEM con 100 μg/mL de gentamicina (1 mL por pocillo) e incubar durante 2 h a 37 °C en 5% de CO2.
    2. Retire el sobrenadante y lave las celdas 3 veces con PBS. Utilice un raspador de células para recoger macrófagos peritoneales de ratón en tubos de centrífuga de 50 ml, centrifugar a 300 x g durante 5 min. Las bacterias intracelulares de MRSA252 se prepararon con éxito en macrófagos peritoneales.
    3. Para el cálculo de bacterias intracelulares, a los macrófagos peritoneales infectados con MRSA252 intracelular, añadir lisozima (10 μg/mL, ver Tabla de Materiales) a 37 °C durante 10 min y luego lavar con PBS 2x. A continuación, añada 1 ml de PBS para resuspender las células. Lisar las células añadiendo Triton X-100 al 0,1% durante 5 min.
    4. Diluya la lisis con diluciones en serie y colóquela en una placa TSA. Cultivo durante la noche a 37 °C. Calcule las bacterias intracelulares de MRSA252 en macrófagos peritoneales, que fueron 1,8 x 106 UFC por ratón, contando las colonias bacterianas.
      NOTA: Cuando el raspador de células recolecta células, la acción debe ser suave. Las células se raspan en una dirección para evitar la rotura de las células, lo que podría afectar al experimento posterior.
  3. Infección bacteriana intracelular en ratones
    1. Divida aleatoriamente 20 ratones Balb/c en cuatro grupos (n = 5, Figura 5A).
    2. Para el grupo I, inyecte 3 x 106 UFC planctónica MRSA252 por ratón mediante inyección intravenosa. Para el grupo II, inyecte 3 x 106 UFC planctónica MRSA252 y vancomicina (110 mg/kg; ver tabla de materiales) por ratón mediante inyección intravenosa. Para el grupo III, inyecte las bacterias intracelulares (preparadas en el paso 3.2) por inyección intravenosa. Para el grupo IV, inyectar las bacterias intracelulares (preparadas en el paso 3.2) y vancomicina (110 mg/kg) por ratón mediante inyección intravenosa.
    3. Coloque a los ratones bajo la lámpara infrarroja de fisioterapia hasta que las venas de su cola se dilaten.
    4. Inyectar por vía intravenosa 3 x 106 UFC planctónica MRSA252 ratón del Grupo I y del Grupo II. Inyectar por vía intravenosa las bacterias intracelulares (preparadas en el paso 3.2) por ratón del Grupo III y del Grupo IV.
      NOTA: Cuando se utiliza una jeringa para recoger líquido que contiene bacterias intracelulares, se recomienda primero mezclar suavemente el líquido de manera uniforme con una pipeta para garantizar niveles de infección constantes en todos los ratones.
    5. Después de 30 min, inyecte vancomicina por vía intravenosa en los grupos II y IV por ratón.
  4. Evaluación de un modelo de infección intracelular in vivo
    1. Evaluar el modelo de infección intracelular de ratones mediante el recuento de la colonización de bacterias en los riñones. Después de 24 h de inyección, anestesiar a los ratones con isoflurano al 3% y sacrificarlos por luxación cervical. Desinféctalos con alcohol etílico al 75%.
    2. Inmovilizar a los ratones, levantar la piel abdominal con pinzas con una mano, cortar la piel abdominal del ratón con tijeras oftálmicas con la otra mano, encontrar los riñones en la cavidad abdominal y quitar completamente los riñones. Póngalos en PBS.
    3. Agregue 1 mL de PBS al tubo de molienda de tejidos. Transfiera los riñones de cada ratón a tubos de molienda separados y muela hasta que no quede tejido sólido. Vierta el tejido homogeneizado en tubos electrofisiológicos individuales y etiquete cada tubo con la identificación del ratón correspondiente.
    4. Utilice PBS para diluir en serie el homogeneizado del tejido. Localice cada dilución en placas TSA separadas e incube durante la noche a 37 °C. Cuente las colonias y analice los datos (Figura 5B).

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Resultados

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Los modelos de infección intracelular de S. aureus se establecieron con éxito tanto in vitro como in vivo. Al optimizar las condiciones experimentales para la fagocitosis y extender tanto la concentración como la duración del tratamiento con antibióticos, algunos S. aureus sobrevivieron dentro de los macrófagos (Figura 1). Para evaluar aún más la resistencia a los antibióticos de S. aureus, los macrófagos infectado...

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Discusión

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S. aureus, como patógeno intracelular facultativo, puede invadir y sobrevivir en varios tipos de células, utilizando esta capacidad para evadir los antibióticos y las respuestas inmunitarias durante la infección30. Este estudio estableció un modelo de infección intracelular de S. aureusin vivo para proporcionar una base para investigar los mecanismos de infección intracelular del patógeno. Al explorar el impacto de varios valores de MOI en la fag...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NSFC, Subvención No.32300779, NO.32270989), la Fundación de Ciencias Naturales de Chongqing (CSTB2022NSCQ-MSX0156), el Proyecto de Investigación de Ciencia y Tecnología de la Comisión de Educación de Chongqing (KJQN202312802) y la Fundación de Ciencias Postdoctorales de China (2024M754250).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Placa de 24 pocillosCorning Incorporated, EE. UU.3524
Solución de paraformaldehído al 4 %BBI, Reino UnidoE672002-0500
Placa de 6 pocillosCorning Incorporated, EE. UU3516
Extracto de carne de vacunoen polvo BBI, Reino UnidoA600114-0500
Equipo de seguridad contra riesgos biológicosFuerza de curación, ChinaVS-1300L-u
Incubadora de célulasESCO, SingapurCCL-170B-8
Raspador de célulasNest710001
Centrífuga M1416RRWD, ChinaM1416R
Tubo de centrífugaGuanghou Labselect, ChinaCT-002-50A
Microscopio de barrido láser confocal (CLSM)Zeiss, Alemania880
Placade Petri ConfocalBiosharp, ChinaBS-20-GJM
DAPI tinteShanghai Beyotime, China  Fluido de trabajo C1006
DILShanghai Beyotime, China  C1991S
Dulbecco' s Águila modificada MedioThermo Gibco, EE. UU.C11995500BT
Hiclónsuero bovino fetalSV30208.02
GentamicinaShanghai Sangon, ChinaB540724-0010
IncubadoraShanghai Hengzi, ChinaHDPF-150
LysozymeBeijing Solarbio, ChinaL9070
MRSA252Tercera Militar Universidad de Medicina, Chinanula
MRSA252(GPF)Tercera Universidad Médica Militar, Chinanula
Penicilina y EstreptomicinaShanghai Beyotime, China C0222
Solución tampón de fosfatoShanghai Beyotime, China  ST476
Solución salinaSichuan Kelun, Chinanulo
Cloruro de sodioShanghai Macklin, ChinaS805275
Almidón solubleShanghai Sangon, ChinaA500904-0500
Triton X-100Shanghai Beyotime, China  P0096-100ml
Placas de agar de soja tríptica (TSA)Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD, China02-130
Caldo de soja tríptico (TSB) medioBeijing AOBOX Biotechnology Co., LTD, China02-102K
TriptonaOXOID, Reino UnidoLP0042B
VancomicinaShanghai Beyotime, China  ST2807-250mg
RAW264.7 célulaEE. UU., ATCCnulo
. de

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sutton, J. A. F., et al. Staphylococcus aureus cell wall structure and dynamics during host-pathogen interaction. PLoS Pathog. 17 (3), e1009468(2021).
  2. Yang, H., et al. Lateral flow assay of methicillin-resistant Staphylococcus aureus using bacteriophage cellular wall-binding domain as recognition agent. Biosens Bioelectron. 182, 113189(2021).
  3. Howden, B. P., et al. Staphylococcus aureus host interactions and adaptation. Nat Rev Microbiol. 21 (6), 380-395 (2023).
  4. Guo, H., et al. Biofilm and small colony variants-an update on Staphylococcus aureus strategies toward drug resistance. Int J Mol Sci. 23 (3), 1241(2022).
  5. Huitema, L., et al. Intracellular escape strategies of Staphylococcus aureus in persistent cutaneous infections. Exp Dermatol. 30 (10), 1428-1439 (2021).
  6. Pidwill, G. R., et al. Clonal population expansion of Staphylococcus aureus occurs due to escape from a finite number of intraphagocyte niches. Sci Rep. 13 (1), 1188(2023).
  7. Wang, M., et al. Autophagy in Staphylococcus aureus infection. Front Cell Infect Microbiol. 11, 750222(2021).
  8. Arya, R., et al. Identification of an antivirulence agent targeting the master regulator of virulence genes in Staphylococcus aureus. Front Cell Infect Microbiol. 13, 1268044(2023).
  9. Münzenmayer, L., et al. Influence of sae-regulated and agr-regulated factors on the escape of Staphylococcus aureus from human macrophages. Cell Microbiol. 18 (8), 1172-1183 (2016).
  10. Chin, D., et al. Staphylococcus lugdunensis uses the agr regulatory system to resist killing by host innate immune effectors. Infect Immun. 90 (10), e0009922(2022).
  11. Podkowik, M., et al. Quorum-sensing agr system of Staphylococcus aureus primes gene expression for protection from lethal oxidative stress. Elife. 12, RP89098(2024).
  12. Purves, J., et al. Air pollution induces Staphylococcus aureus usa300 respiratory tract colonization mediated by specific bacterial genetic responses involving the global virulence gene regulators agr and sae. Environ Microbiol. 24 (9), 4449-4465 (2022).
  13. Wittekind, M. A., et al. The novel protein scra acts through the saers two-component system to regulate virulence gene expression in Staphylococcus aureus. Mol Microbiol. 117 (5), 1196-1212 (2022).
  14. Pidwill, G. R., et al. The role of macrophages in Staphylococcus aureus infection. Front Immunol. 11, 620339(2020).
  15. Lang, J. C., et al. A photoconvertible reporter system for bacterial metabolic activity reveals that Staphylococcus aureus enters a dormant-like state to persist within macrophages. mBio. 13 (5), e0231622(2022).
  16. Li, M., et al. Interactions between macrophages and biofilm during Staphylococcus aureus-associated implant infection: Difficulties and solutions. J Innate Immun. 15 (1), 499-515 (2023).
  17. Sun, L., et al. Staphylococcal virulence factor hlgb targets the endoplasmic-reticulum-resident e3 ubiquitin ligase amfr to promote pneumonia. Nat Microbiol. 8 (1), 107-120 (2023).
  18. Mulcahy, M. E., et al. Manipulation of autophagy and apoptosis facilitates intracellular survival of Staphylococcus aureus in human neutrophils. Front Immunol. 11, 565545(2020).
  19. Cai, J., et al. Staphylococcus aureus facilitates its survival in bovine macrophages by blocking autophagic flux. J Cell Mol Med. 24 (6), 3460-3468 (2020).
  20. Ahmad-Mansour, N., et al. Staphylococcus aureus toxins: An update on their pathogenic properties and potential treatments. Toxins. 13 (10), 677(2021).
  21. Davis, J. S., et al. How I manage a patient with MRSA bacteremia. Clin Microbiol Infect. 28 (2), 190-194 (2022).
  22. Fait, A., et al. Staphylococcus aureus response and adaptation to vancomycin. Adv Microb Physiol. 85, 201-258 (2024).
  23. Kelly, J. J., et al. Measurement of accumulation of antibiotics to Staphylococcus aureus in phagosomes of live macrophages. Angew Chem Int Ed Engl. 63 (3), e202313870(2024).
  24. Rowe, S. E., et al. Recalcitrant Staphylococcus aureus infections: Obstacles and solutions. Infect Immun. 89 (4), e00694-e00720 (2021).
  25. Lehar, S. M., et al. Novel antibody-antibiotic conjugate eliminates intracellular S. aureus. Nature. 527 (7578), 323-328 (2015).
  26. Peyrusson, F., et al. Intracellular Staphylococcus aureus persisters upon antibiotic exposure. Nat Commun. 11 (1), 2200(2020).
  27. Pollitt, E. J. G., et al. Staphylococcus aureus infection dynamics. PLoS Pathog. 14 (6), e1007112(2018).
  28. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J Vis Exp. 11 (63), e3064(2012).
  29. Qin, L., et al. Antibody-antibiotic conjugate targeted therapy for orthopedic implant-associated intracellular S. aureus infections. J Adv Res. 65, 239-255 (2024).
  30. Andie, S. L., et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Nat Rev Dis Primers. 31 (4), 18034(2018).

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