Artículo de método

Aislamiento y cultivo de adipocitos murinos primarios de ratones delgados y obesos

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DOI:

10.3791/67846

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24 de enero de 2025

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1Department of Biochemistry, University of Utah School of Medicine

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

El tamaño y la fragilidad de los adipocitos maduros han limitado las técnicas y herramientas disponibles para su estudio y aislamiento. En este trabajo se describe un protocolo para el aislamiento de adipocitos murinos maduros, que puede adaptarse fácilmente a diferentes depósitos de adiposo y dietas de ratones.

Resumen

El tejido adiposo está compuesto principalmente por adipocitos maduros cargados de lípidos por volumen. Estas células postmitóticas desempeñan un papel fundamental en el almacenamiento y la movilización de energía, la termorregulación y la secreción de factores endocrinos. La expansión del tejido adiposo blanco debido al desequilibrio calórico da lugar tanto al agrandamiento de los adipocitos existentes como a la generación de adipocitos adicionales a partir de células progenitoras de adipocitos. Los cambios provocados por la obesidad en el tejido adiposo blanco, incluidos los que afectan a los adipocitos, se asocian con numerosas comorbilidades, como la diabetes tipo 2 y 13 tipos de cáncer. Un obstáculo importante para estudiar cómo los adipocitos contribuyen a la enfermedad es la incapacidad de aislar y cultivar fácilmente adipocitos maduros. Este artículo describe un protocolo para aislar adipocitos murinos magros y obesos de los depósitos de grasa subcutánea y visceral de ratones C57BL/6 machos y hembras. El protocolo detalla cómo se pueden cultivar adipocitos primarios aislados en un sistema de agregados de adipocitos de membrana durante un máximo de 2 semanas, lo que facilita su análisis funcional en experimentos de cocultivo, ensayos de lipólisis o mediante la recolección de medios condicionados que contienen factores secretados por adipocitos. Además, el protocolo describe los métodos para cultivar explantes de tejido adiposo en domos de matriz de membrana basal y obtener imágenes de adipocitos aislados primarios. Es importante destacar que este enfoque puede integrarse con los protocolos existentes para el aislamiento de células progenitoras de adipocitos residentes en tejido adiposo mediante la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). En conjunto, estos protocolos proporcionan a los investigadores herramientas para estudiar funcionalmente los adipocitos, las células progenitoras de los adipocitos y el tejido adiposo completo de ratones magros y obesos, machos y hembras.

Introducción

Se espera que la prevalencia de la obesidad adulta en los Estados Unidos alcance el 50% para 20301, por lo que es imperativo comprender mejor los efectos celulares y fisiológicos de la obesidad. La obesidad se caracteriza por un desequilibrio calórico que resulta en la expansión del tejido adiposo blanco debido al aumento del almacenamiento de energía en forma de grasa. La expansión del tejido adiposo puede ocurrir tanto a través de la generación de nuevos adipocitos (hiperplasia) como a través de un aumento en el tamaño de los adipocitos existentes (hipertrofia). A pesar de que ambos procesos resultan en la expansión del tejido adiposo, la expansión hipertrófica coincide con una disminución de la salud metabólica y una mayor incidencia de trastornos metabólicos 2,3. Una mejor comprensión de las complejidades del tejido adiposo proporcionará información sobre los mecanismos moleculares que regulan los trastornos metabólicos y otras comorbilidades relacionadas con la obesidad, incluida la diabetes tipo 2 y los cánceres.

El tejido adiposo ha sido apreciado durante mucho tiempo por su papel en el almacenamiento de energía y la termorregulación. Más recientemente, sin embargo, el tejido adiposo se ha convertido en un importante tejido de señalización metabólica, responsable de la secreción de metabolitos, lípidos y péptidos 4,5. Estas moléculas derivadas del tejido adiposo, denominadas adipocinas, señalizan local y sistémicamente y pueden regular la homeostasis energética, la función inmunitaria, la dinámica vascular y más 5,6,7. Los adipocitos maduros constituyen aproximadamente el 50% de las células del tejido adiposo y representan la gran mayoría del volumen del tejido adiposo8. Es importante destacar que los estudios han encontrado que los adipocitos consisten en muchas subpoblaciones 9,10. Como tal, las células progenitoras de adipocitos generan distintas poblaciones de adipocitos maduros en función de factores como el sexo y el depósito de tejido adiposo. Estos adipocitos maduros pueden ser modulados aún más por los cambios en la dieta y la obesidad, creando subpoblaciones de adipocitos que son transcripcionalmente distintos y expresan diferentes firmas paracrinas 9,11,12,13,14,15,16 . A pesar de su complejidad e importancia fisiológica, la capacidad de aislar y cultivar adipocitos maduros sigue siendo una barrera distintiva para el estudio de estas células.

Los métodos disponibles actualmente para aislar adipocitos maduros emplean la diferenciación de las células progenitoras de adipocitos (APC), la clasificación de células activadas fluorescentes y técnicas basadas en la centrifugación, aunque todas ellas tienen sus propios inconvenientes. La diferenciación in vitro o ex vivo de APC en adipocitos maduros se utiliza ampliamente para desarrollar adipocitos maduros. Sin embargo, estas células diferenciadas artificialmente son multiloculares, conteniendo muchas gotas lipídicas pequeñas, en lugar del fenotipo unilocular de los adipocitos maduros in vivo, que contienen una gota lipídica grande17. Además, los estudios han encontrado que las células diferenciadas in vitro son transcripcionalmente distintas de los adipocitos maduros aislados que se encuentran in vivo17. Es importante destacar que la diferenciación in vitro no puede capturar la diferencia entre los adipocitos magros y los obesos. La clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) se usa comúnmente para aislar poblaciones celulares específicas del tejido; sin embargo, los adipocitos maduros pueden reventar fácilmente en condiciones de FACS debido a su gran tamaño y membranas frágiles, lo que lo convierte en un método ineficiente para el aislamiento de adipocitos maduros. Otros protocolos existentes dan lugar a la acumulación de grandes cantidades de lípidos libres, que pueden ser tóxicos para los adipocitos maduros en cultivo con el tiempo.

En este trabajo describimos un protocolo para el aislamiento de adipocitos maduros murinos a partir de tejido adiposo blanco. Este protocolo fue adaptado del protocolo para cultivos agregados de adipocitos maduros establecido originalmente por Harms et al.17; Sin embargo, el enfoque basado en la centrifugación descrito aquí utiliza equipos de laboratorio comunes y es capaz de aislar eficazmente los adipocitos de pequeñas cantidades (~0,5 g) de tejido adiposo. Se trata de un sistema fácilmente adaptable, en el que se incluyen modificaciones para aislar adipocitos murinos maduros de ratones machos y hembras, depósitos de grasa visceral y subcutánea, y diferentes condiciones dietéticas.

Protocolo

Todos los experimentos con animales descritos fueron aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de Utah. Este protocolo se ha optimizado para el aislamiento de adipocitos maduros de ratones machos y hembras C57BL/6 de 8 a 16 semanas de edad, con pesos corporales que oscilan entre 20 y 45 g. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados en este estudio se proporcionan en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de la solución

  1. Prepara el tampón de colagenasa. Añadir 100 mg de colagenasa en polvo, 1 mL de tampón HEPES 1 M, 500 μL de 100x P188, 50 μL de 1 M de CaCl2, 0,05 g de BSA y 48,45 mL de Medium 199. Filtrar la solución estéril, alícuota y almacenar a -20 °C.
  2. Fabricación de medios de cultivo celular. Combine 500 mL de DMEM, 50 mL de FBS, 5 mL de Penicilina-Estreptomicina y 5 mL de suplemento de L-glutamina.

2. Recolección de depósitos de tejido adiposo blanco de ratones

  1. Prepare un plato de 1 x 10 cm con 200 μL de HBSS para cada depósito diferente y acondicione según corresponda y colóquelo en hielo.
  2. Recuperar a los animales del establo y sacrificar a los ratones de acuerdo con los lineamientos del Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Institución. Aquí, los animales fueron sacrificados por dislocación cervical bajo anestesia profunda.
  3. Pese y registre el peso de cada ratón si corresponde.
  4. Esteriliza al ratón rociando etanol al 70% para recubrir el exterior.
  5. Coseche las almohadillas de grasa apropiadas del ratón18,19.
    NOTA: Tenga cuidado de extraer los ganglios linfáticos del depósito subcutáneo antes de colocar el tejido en la placa.
  6. Pesa cada grasa y registra el peso.
  7. Coloque la almohadilla de grasa en el plato preparado de 10 cm sobre hielo.

3. Preparación de explantes de tejido adiposo blanco

NOTA: Este paso es opcional.

  1. Al menos 12 h antes de comenzar la disección, descongele la matriz de la membrana basal (Matrigel) a 4 °C en hielo y enfríe una caja de puntas de pipeta estériles de 200 μL a 4 °C.
  2. Con puntas de pipeta frías, pipetee 80 μL de matriz de membrana basal en el centro de cada pocillo de una placa de cultivo de 24 pocillos para crear una cúpula (Figura 1A). Coloque la placa en la incubadora (37 °C, 5% CO2) durante 30 min para solidificar parcialmente la matriz.
  3. Prepare el tejido: Con unas tijeras de disección estériles, pese 0,1 g de tejido de cada muestra y colóquelo en PBS sobre hielo.
  4. Con pinzas estériles, incruste el tejido previamente pesado en la cúpula de matriz parcialmente solidificada. Añadir 30 μL de matriz de membrana basal sobre el tejido incrustado. Regrese la placa a la incubadora durante 30 minutos para fijar el tejido en la matriz de la membrana basal.
    NOTA: La inclusión de tejido en la matriz de la membrana basal es crucial para garantizar que el tejido permanezca en cultivo en lugar de flotar. Esto preserva la salud y la calidad del tejido (Figura 1B).
  5. Agregue 1 mL de medio de crecimiento (DMEM con 10% de FBS) a cada pocillo y devuélvalo a la incubadora.

4. Tratamiento con colagenasa

  1. Calcula la cantidad de solución de colagenasa necesaria. Ver Tabla 1.
  2. Prepare la solución de colagenasa con DNasa. Añadir 0,00017 g de DNasa por 1 mL de solución de colagenasa. Vórtice para mezclar.
  3. Con una cuchilla de afeitar, picar el tejido adiposo aislado hasta que el tejido parezca homogéneo (Figura 2A). Transfiera el tejido picado a un tubo cónico estéril de 50 mL.
    NOTA: No pique demasiado. La picadura se completa cuando el tejido parece homogéneo y pastoso. El tejido poco picado parece grueso y heterogéneo, y el tejido demasiado picado dará lugar a la liberación de lípidos libres (Figura 2B).
  4. Añadir la solución preparada de colagenasa y DNasa al tejido adiposo picado utilizando los volúmenes calculados en el paso 4.1. Vórtice a velocidad máxima durante 7-10 s para combinar completamente. Coloque los tubos cónicos de 50 ml horizontalmente en un agitador ajustado a 220 rpm, 37 °C.
  5. Incubar agitando durante 10 min, luego en vórtice durante 5 s y revisar las muestras. Las muestras completamente digeridas parecerán homogéneas, sin grumos ni trozos de tejido visibles. Si las muestras no se digieren completamente, continúe la digestión en el agitador, revisando cada 2 minutos (Figura 2C).
    NOTA: No digiera en exceso. El tiempo excesivo en la solución de colagenasa puede provocar la descomposición de los adipocitos y la liberación de lípidos.
  6. Utilice una pipeta serológica para pasar el tejido digerido a través de un tamiz a un nuevo cónico de 50 mL. Agregue un volumen de FBS igual al volumen de tejido + solución de colagenasa a través del tamiz en un cónico para neutralizar la colagenasa.
    NOTA: Una pequeña cantidad de tejido permanecerá en el tamiz después del filtrado.

5. Lavar el pañuelo

NOTA: Complete todos los pasos siguientes en una campana de cultivo de tejidos estéril.

  1. Prepare 1 tubo de 15 mL con 10 mL de medio de cultivo tibio para cada condición.
  2. Girar los tubos desde el paso 4.6 a 300 x g durante 3 min a la temperatura especificada en la Tabla 1.
    NOTA: La temperatura para la centrifugación debe modificarse en función del sexo de los ratones de los que se aisló el tejido adiposo; estas temperaturas se proporcionan en la Tabla 1.
  3. Asegúrese de que después de centrifugar, el tejido se separe en cuatro capas (Figura 3A).
    NOTA: La capa superior son los lípidos libres, la segunda capa es la capa de adipocitos maduros, la tercera capa es la colagenasa y FBS, y la cuarta capa es la fracción vascular estromal (SVF) que se granula hasta la parte inferior20,21.
  4. Deseche cuidadosamente la capa superior de lípidos libres con una pipeta de 200 μL.
  5. Después de retirar la capa superior, utilice una pipeta p1000 con la parte inferior cortada para transferir los adipocitos maduros al tubo preparado de 15 mL con 10 mL de medio de crecimiento (Figura 3B).
    1. Opcional: Para aislar las células progenitoras de los adipocitos primarios (APC), vuelva a centrifugar los tubos a 300 x g durante 10 min. A continuación, se procedió al aislamiento de la célula progenitora de los adipocitos por Liu et al.22, Cho et al.23, o similar.
  6. Invierta los tubos de 15 ml con los adipocitos maduros suavemente de 3 a 5 veces hasta que la capa blanca se haya dispersado por todo el medio.
  7. Deje que los tubos descansen en posición vertical durante 10 minutos a la temperatura indicada en la Tabla 1 para permitir la separación de las capas de adipocitos y medios.
  8. Después del descanso de 10 minutos, gire los tubos a 100 x g durante 1 minuto a temperatura ambiente para promover aún más la separación de las capas. Después del centrifugado, las muestras se separarán nuevamente en cuatro capas, como se muestra en la Figura 3A.
  9. Retire y deseche la capa superior de lípidos libres con una pipeta.
  10. Con una aguja de 21 G conectada a una jeringa de 5 ml, deslice la aguja por el borde del tubo hasta que la parte inferior de la aguja esté libre de la capa de adipocitos maduros (Figura 3C). Asegúrese de que la parte superior de la aguja y la parte inferior de la jeringa no alteren la capa madura de adipocitos.
  11. Tire lentamente de la jeringa para eliminar el medio de cultivo y cualquier residuo celular.
    NOTA: A medida que se retira el medio, asegúrese de que la punta de la aguja esté libre de la capa de adipocitos maduros.
  12. Agregue suavemente 10 mL de medio de cultivo a cada tubo.
  13. Repita los pasos 5.6-5.11. No agregues más medios de cultura.
  14. Con las puntas de pipeta con carga de gel, deslice la punta de la pipeta por el borde del tubo para eliminar los medios restantes por debajo de la capa de adipocitos maduros.

6. Embalaje

  1. Centrifugar las celdas a 100 x g durante 1 min a la temperatura indicada en la Tabla 1. Elimine los lípidos libres (capa de aceite transparente en la parte superior de las células) con una pipeta. Retire el medio de cultivo debajo de los adipocitos con una punta de carga de gel. Tenga cuidado de minimizar la alteración de la capa de adipocitos (Figura 4).
  2. Repita el paso 6.1 hasta que se hayan eliminado todos los medios de cultivo y los lípidos libres (normalmente de 3 a 5 veces). El paquete de células debe ser de color blanco, sin lípidos libres visibles por encima de las células ni medios por debajo de las células (Figura 4).

7. Recubrimiento y ensayos funcionales

  1. Siembra de los adipocitos maduros para el cultivo celular
    1. Retire los insertos de cultivo celular de una placa de 24 pocillos tratada con cultivo de tejidos y colóquelos con el lado de la membrana hacia arriba en la superficie de la campana.
    2. Llene los pocillos alternos de la placa con 1 mL de medio de cultivo tibio.
    3. Con una punta de pipeta p200 cortada, coloque 30 μL de adipocitos maduros empaquetados del paso 6.2 en la parte superior de un inserto transwell (Figura 5A,B).
    4. Recoja e invierta con cuidado el inserto transwell y colóquelo en un pocillo prellenado en la placa de 24 pocillos (Figura 5A). Coloque con cuidado la placa en la incubadora a 37 °C con 5% de CO2.
      NOTA: Los adipocitos correctamente empaquetados deben formar una capa opaca sin gotas de lípidos libres claras visibles cuando se ven desde arriba (Figura 5C).
    5. Cambie los medios de los adipocitos maduros cada 2-7 días durante un máximo de 14 días.
      1. Para retirar los medios de los pocillos, sostenga el transpocillo en su lugar y utilice una pipeta p200 para extraer con cuidado el medio a través de las pequeñas aberturas en el lateral del inserto del transpocillo (Figura 5D).
      2. Una vez que se haya retirado el medio, mientras se mantiene el transpocillo en su lugar, agregue muy lentamente 1 mL de medio a la pared lateral del pocillo.
        NOTA: Tenga cuidado de agregar y quitar medios muy lentamente. Los adipocitos pueden desprenderse fácilmente de la membrana si el medio se cambia rápidamente.
  2. Ensayo de lipólisis
    1. Explantes de tejido adiposo en placa, como se describe en el paso 3.4, o adipocitos maduros, como se describe en el paso 7.1.
      NOTA: Las células o tejidos deben cultivarse en medios libres de rojo de fenol durante al menos 24 horas antes de realizar el ensayo de lipólisis.
    2. Preparación de la solución: Prepare una solución de BSA al 5% en DMEM (sin rojo de fenol) disolviendo 5 g de BSA en 100 mL de DMEM. Invierta suavemente para combinar hasta que BSA se disuelva por completo.
      1. Preparar soluciones de trabajo para medios de control y estimulación. Para los medios de control, combine el 5% de los medios BSA DMEM con el vehículo. Para los medios de estimulación, combine un 5% de medios BSA DMEM con 5 μM de CL-316,243. Calentar los medios de control y estimulación a 37 °C antes de su uso.
    3. Retire los medios de los pocillos y lávelos con 1 ml de DPBS tibio. Llene los pocillos con 500 μL por pocillo de medio de control o estimulación. Incubar a 37 °C, 5% de CO2.
    4. A 1 h, 2 h, 4 h y 24 h después de iniciar el ensayo de lipólisis, recoja 100 μL de medio de cada pocillo en un tubo de microcentrífuga y reemplácelo con 100 μL del medio de control o estimulación adecuado.
      NOTA: Las muestras pueden almacenarse a -20 °C en este punto.
    5. Realice un ensayo colorimétrico de glicerol utilizando un kit de glicerol gratuito disponible en el mercado (consulte la tabla de materiales) o similar.
      1. Prepare los reactivos como se indica en el kit.
      2. Descongele las muestras y mezcle suavemente mediante pipeteo.
      3. Prepare una curva estándar con una dilución en serie de siete puntos y 2 veces utilizando la solución estándar de glicerol.
      4. Transfiera 25 μL de muestra o patrón a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo transparente.
      5. Añada 100 μl de reactivo de ensayo de glicerol libre a cada pocillo que contenga una muestra o solución estándar.
      6. Incube durante 15 minutos a temperatura ambiente, luego lea la absorbancia a 540 nm (Figura 6A-D).
  3. Imagenológico
    1. Prepare los portaobjetos de imagen. Para preparar portaobjetos, retire la capa de papel de soporte de cada espaciador de imágenes y colóquelo en el portaobjetos. Se pueden colocar dos espaciadores de imagen uno al lado del otro en cada portaobjetos.
    2. Con una punta de pipeta cortada de 200 μL, transfiera 30 μL de adipocitos empaquetados del paso 6.2 a un tubo de microcentrífuga.
    3. Prepara la mezcla para manchar. Prepare 200 μL por muestra de solución de tinción de membrana plasmática a 5 μg/mL y Hoechst a 4,5 μg/mL en PBS. Agregue la mezcla de manchas a las muestras y agite suavemente.
    4. Tiñir las muestras durante 30 min a temperatura ambiente. Proteja las muestras de la luz.
    5. Una vez completada la tinción, lave las muestras. Agregue 500 μL de PBS a cada muestra y agite suavemente para combinar. Deje reposar durante 5 min. Centrifugar a 100 x g durante 1 min y, a continuación, retirar el medio de debajo de las células con una punta de pipeta de carga de gel.
    6. Prepara las diapositivas. Retire la película de plástico transparente de la parte superior de los espaciadores de imágenes para exponer la capa pegajosa.
    7. Añadir 500 μL de PBS al tubo de adipocitos teñidos y mezclar suavemente.
    8. Rápidamente, para no dar tiempo a que los adipocitos maduros suban a la superficie, utilice una punta de pipeta p200 cortada para colocar 35 μL de los adipocitos dentro del espaciador en el portaobjetos de imagen.
    9. Coloque un cubreobjetos en el espaciador.
    10. Proceda inmediatamente a la toma de imágenes (Figura 6C). Un retraso en la obtención de imágenes puede provocar sangrado del marcador de membrana.

Resultados

Como se muestra en la Figura 2, la picadura adecuada (Figura 2B) y la digestión (Figura 2C) son importantes para el aislamiento de los adipocitos maduros intactos. La falta de picado y la digestión insuficientes pueden dar lugar a un bajo rendimiento de adipocitos maduros debido a una separación inadecuada del tejido conectivo. Visualmente, esto se puede observar con tejido fibroso que queda después de la picadura y grumos visibles en la solución de colagenasa. Además, el exceso de picado y digestión también da como resultado un bajo rendimiento debido al estallido de los adipocitos maduros. Visualmente, esto da como resultado la pérdida de la capa opaca blanca y una acumulación de una capa lipídica grande, clara y libre. Los niveles inadecuados de picado o digestión darán como resultado un aislamiento deficiente de los adipocitos.

La preparación y digestión adecuadas del tejido adiposo dará como resultado la separación del tejido en cuatro capas distintas, como se ve en la Figura 3. Es inevitable que se produzca un estallido de los adipocitos que dé lugar a la liberación de lípidos libres; Sin embargo, la picadura y la digestión adecuadas asegurarán una ruptura mínima de los adipocitos. El resto de la capa lipídica libre y los medios se eliminarán durante el empaquetamiento de los adipocitos (Figura 4). El empaquetamiento adecuado de los adipocitos es esencial para el aislamiento eficiente de los adipocitos maduros. Los lípidos o medios libres restantes darán lugar a un aislamiento deficiente y tendrán un impacto negativo en los ensayos funcionales posteriores, como la colocación de placas, la lipólisis y la obtención de imágenes celulares.

Este protocolo genera una preparación limpia de adipocitos maduros. Se pueden realizar pruebas de imagen celular y lipólisis para evaluar la función celular y demostrar que los adipocitos maduros conservan la función después del aislamiento y después del cultivo durante un máximo de dos semanas. El ensayo de lipólisis indica que los adipocitos maduros mantienen la capacidad de responder a la señalización celular a través de la liberación de glicerol libre tras la estimulación del receptor adrenérgico β-3 (Figura 6A,B). Esta capacidad se mantiene incluso después de 2 semanas en cultivo y es altamente comparable a la actividad de lipólisis de los explantes de tejido adiposo cultivados durante 24 h (Figura 6C,D). Los adipocitos de mala calidad mostrarán lipólisis atenuada. Las imágenes celulares de los adipocitos aislados muestran adipocitos maduros uniloculares redondos e intactos que contienen una sola gota de lípidos grande. Los aislamientos de adipocitos de mala calidad mostrarán principalmente grandes gotas de aceite extracelular indicativas de adipocitos reventados.

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Figura 1: Inclusión de explantes de tejido adiposo. (A) Imagen de la cúpula de la matriz de la membrana basal parcialmente solidificada antes de la inclusión del tejido. (B) Imágenes representativas de incrustación de tejido inadecuada y adecuada. La incrustación incorrecta es visible ya que el tejido parece flotar parcial o completamente por encima de la cúpula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Esquema de picado y digestión adecuados del tejido adiposo. (A) Representación esquemática de las etapas de picado y digestión de los tejidos 4.2-4.6. (B) Imágenes representativas de tejido subpicado, óptimo y sobrepicado. El tejido poco picado tiene trozos grandes que conservan su forma original. El tejido picado en exceso da como resultado un aumento visible de los lípidos libres que rodean el tejido, que parecen claros y aceitosos. (C) Imágenes representativas de tejido subdigerido, óptimo y sobredigerido. El tejido mal digerido contiene trozos de tejido entero que permanecen en la solución. El tejido sobredigerido exhibe una gran capa de lípidos libres que se separa rápidamente de la solución. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Separación de capas de tejido adiposo digerido. (A) Imagen esquemática y representativa de las capas que están presentes siguiendo el paso 5.3. (B) Uso de una punta de pipeta cortada para eliminar la capa de adipocitos maduros del tubo cónico de 50 mL. (C) Técnica y colocación adecuadas de la aguja y la jeringa para eliminar los medios de cultivo por debajo de la capa de adipocitos maduros. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Empaquetamiento secuencial de adipocitos maduros. Imágenes secuenciales del empaquetamiento de los adipocitos maduros. Se marcan capas de lípidos libres, adipocitos y medios. Después de cada centrifugado, se eliminan los lípidos y medios libres. Esto se repite hasta que no haya medios o lípidos libres que se separen de los adipocitos después de un centrifugado. La imagen final es representativa de adipocitos maduros bien empaquetados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Siembra y cultivo de adipocitos maduros. (A) Esquema de la siembra de adipocitos maduros. Con una punta de pipeta p200 cortada, los adipocitos empaquetados se colocan en la membrana de un inserto de cultivo celular. A continuación, el inserto se invierte en pocillos precargados de medios de cultivo. (B) Una imagen representativa de la placa de adipocitos maduros que representa la punta de la pipeta cortada depositando adipocitos en el inserto transwell. (C) Esquemas e imágenes representativas de adipocitos debidamente empaquetados y mal empaquetados sembrados con transpocillos, vistos desde arriba de los pocillos. Los adipocitos correctamente empaquetados aparecen blancos y opacos, mientras que los adipocitos mal empaquetados dan lugar a la formación de gotas lipídicas transparentes. (D) Esquema de la técnica utilizada para cambiar los medios de cultura. Se utiliza una punta de pipeta p200 para extraer cuidadosamente el medio a través de las aberturas de la pared lateral del inserto transwell. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Imagen de adipocitos maduros y ensayo de lipólisis. (A,B) Liberación de glicerol de los adipocitos maduros subcutáneos (A) y viscerales (B). Los adipocitos se aislaron de ratones machos C57BL/6 de 16 semanas de edad alimentados con una dieta normal de comida. Se sembraron 30 μL de adipocitos como se describe en el paso 7.1 y se cultivaron durante 1 o 10 días. Los adipocitos se trataron con 5 μM de CL-316,243 durante 1 h, 2 h y 4 h, y se recolectaron y analizaron sobrenadantes para glicerol libre. (C,D) Liberación de glicerol de explantes de tejido adiposo subcutáneo (C) y visceral (D). El tejido adiposo se aisló de ratones hembra C57BL/6 de 18 semanas de edad alimentados con una dieta normal de comida. Se sembraron 0,1 g de explantes de tejido adiposo como se describe en los pasos 3.1-3.4 y se cultivaron durante 24 h. Los adipocitos se trataron con 5 μM de CL-316,243 durante 1 h, 2 h y 4 h, y se recolectaron y analizaron sobrenadantes para glicerol libre. N = 3 réplicas técnicas para A-D. Todos los datos son media ± desviación estándar. (E) Imágenes representativas de adipocitos maduros subcutáneos y viscerales aislados. Los adipocitos se aislaron de ratones machos C57BL/6J de 16 semanas de edad alimentados con una dieta normal de comida. Los adipocitos se tiñeron con tinción de membrana plasmática (rojo) y tinción de núcleos de Hoechst (azul). Barras de escala: 50 μm; Aumento: 60x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

SexoDietaDepósitoDificultad de picadoColagenasa: Proporción de tejidosTiempo de digestión sugerido (min)Temperatura de centrifugado.Temperatura de lavado.
HembraComida normalSubcutáneoDuro2:112RT37 °C
VisceralMedio1:18RT37 °C
Dieta alta en grasasSubcutáneoFácil1:18RT37 °C
VisceralFácil1:18RT37 °C
MasculinoComida normalSubcutáneoDuro2:1144 °CRT
VisceralMedio1:1104 °CRT
Dieta alta en grasasSubcutáneoFácil1:1104 °CRT
VisceralFácil1:1104 °CRT

Tabla 1: Sexo, depósito y modificaciones específicas de la dieta. La dificultad de picado de cada tejido, descrita como "Fácil", "Media" o "Dura" en relación con otros depósitos. Tenga en cuenta que el tiempo real de picado variará según el investigador y el tejido. Colagenasa: Proporción de tejido indicada como volumen (mL) de colagenasa + solución de DNasa preparada en el paso 4.1 con respecto al peso del tejido (g). El tiempo de digestión es una estimación aproximada, pero el tiempo de digestión real variará según la picadura y el tejido. Los investigadores deben evaluar la digestión como se describe en el protocolo. La temperatura de centrifugado y la temperatura de lavado difieren entre ratones machos y hembras. RT denota la temperatura ambiente.

Discusión

Los adipocitos primarios son notoriamente difíciles de aislar y cultivar porque se rompen fácilmente, y su gran tamaño impide el uso de herramientas comunes de aislamiento de células primarias, como la citometría de flujo. El protocolo descrito aquí produce adipocitos maduros limpios y funcionales, que se pueden utilizar para una variedad de aplicaciones posteriores. Es importante destacar que este protocolo permite la separación de los adipocitos maduros de otros desechos celulares y la capa de lípidos libres, lo que permite realizar ensayos efectivos de imágenes, cultivo y lipólisis. El protocolo puede combinarse fácilmente con los protocolos publicados22,23 para el aislamiento de la fracción vascular estromal y las APCs. Este protocolo también detalla un procedimiento para la preparación y el cultivo de explantes de tejido entero a partir de tejido adiposo, que se puede utilizar para aplicaciones posteriores como ensayos de lipólisis y la recolección de factores secretados de tejido adiposo completo.

Los aspectos críticos incluyen la picadura adecuada, la digestión y la eliminación de la capa lipídica libre. Para garantizar un picado adecuado, es importante controlar de cerca el aspecto visual del tejido durante todo el proceso. El tiempo y el esfuerzo necesarios para lograr una picadura óptima del tejido variarán según el depósito de tejido adiposo, las intervenciones dietéticas (como una dieta alta en grasas) y el investigador. Se pueden incorporar otras herramientas para picar, como las tijeras, si es necesario, pero esto no se ha explorado aquí. Cabe destacar que se debe evitar el exceso de picazón, ya que romperá los adipocitos, lo que no solo disminuye el rendimiento inmediato, sino que también disminuye el rendimiento total y la calidad de los adipocitos debido al efecto deletéreo que la capa lipídica libre tiene sobre los adipocitos restantes. La digestión adecuada, similar a una carne picada adecuada, dependerá del depósito de tejido adiposo, las intervenciones dietéticas, la edad de los ratones, etc. La adición de DNasa a la colagenasa ayuda a prevenir la agregación de los adipocitos durante la digestión, que puede resultar de los desechos celulares. El tiempo de digestión de los tejidos es, por lo tanto, muy variable. Las estimaciones proporcionadas para los tiempos de digestión sirven como guía, que se pueden encontrar en la Tabla 1. Sin embargo, la mejor manera de asegurarse de que los tejidos se digieran correctamente es inspeccionar visualmente el tejido durante todo el proceso y como se describe en el protocolo. Las diferentes temperaturas de centrifugación y lavado detalladas en la Tabla 1, sugeridas en función del sexo, son esenciales para la correcta separación de los adipocitos maduros tanto de la capa lipídica libre como de los demás residuos celulares y SVF; El uso de temperaturas alternativas puede resultar en la pérdida de los adipocitos maduros debido a la agregación y el estallido de los adipocitos.

La eliminación de la capa lipídica libre en cada paso es de vital importancia, y si no se hace, se presentarán complicaciones posteriores para la siembra, las imágenes y el ensayo de lipólisis. Además, la presencia sostenida de la capa lipídica libre durante todo el procedimiento dará lugar a una muerte adicional de los adipocitos debido a la lipotoxicidad, lo que afectará drásticamente el rendimiento y la calidad generales. Si bien generalmente se desea maximizar la eficiencia del aislamiento de adipocitos maduros, la eliminación de la capa de lípidos libres, incluso a expensas de algunos de los adipocitos maduros, dará como resultado un aumento general en el rendimiento de adipocitos maduros al final del protocolo.

Las limitaciones del procedimiento incluyen el número de muestras. Debido al rigor y el tiempo consumidos por la eliminación de los medios y la capa lipídica libre, el procedimiento generalmente se limita a seis muestras a la vez. El procesamiento de un número significativamente mayor de muestras dará lugar a que los adipocitos primarios estén expuestos a lípidos libres durante demasiado tiempo y disminuirá el rendimiento general. Sin embargo, el personal adicional puede permitir un aumento en el número de muestras. El tiempo que transcurre desde el picado hasta el ensayo funcional es crítico, ya que los retrasos excesivos en la eliminación de los medios y la capa lipídica libre dan lugar a un estallido adicional de adipocitos maduros. El protocolo limita aún más la capacidad de separar subpoblaciones de adipocitos maduros.

Los métodos actuales para estudiar los adipocitos maduros se basan principalmente en el aislamiento de las APC y la posterior diferenciación ex vivo de estas células. Se han comenzado a desarrollar métodos adicionales, como el modelo de órgano en un chip y los cocultivos de pocillos trans18,24. Sin embargo, se ha demostrado que estos adipocitos diferenciados ex vivo son transcripcional y morfológicamente distintos de los adipocitos maduros en el tejido adiposo17. Morfológicamente, los adipocitos diferenciados ex vivo son multiloculares, mientras que los adipocitos aislados in vivo son uniloculares. Este protocolo fue modificado y optimizado a partir de informes anteriores17,25 para aislar y cultivar con éxito adipocitos maduros a partir de tan solo 0,5 g de tejido adiposo en comparación con otros protocolos que requieren al menos 5 g de tejido adiposo25 . Finalmente, este estudio tuvo como objetivo ilustrar visualmente la finalización exitosa de los pasos clave del protocolo en lugar de los tiempos concretos, las temperaturas de centrifugación y las cantidades de colagenasa, aunque las pautas se incluyen en la Tabla 1. Estos parámetros deben ajustarse de acuerdo con factores como el depósito de tejido adiposo, el sexo y la adiposidad del animal, todos los cuales pueden afectar la eficiencia de la digestión y la separación limpia de los adipocitos maduros en este protocolo.

En total, el procedimiento dura entre 3 y 4 horas, dependiendo del número de ratones agrupados y del número de muestras individuales de tejido adiposo. Se anticipa que la capacidad de cultivar y evaluar el papel funcional de los adipocitos maduros permitirá muchas aplicaciones posteriores para el estudio de la biología de los adipocitos en sí misma (por ejemplo, metabolismo, utilización de nutrientes y rastreo) y la interacción de los adipocitos con otros tipos de células, como APC, células cancerosas y células del sistema inmunológico.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer el apoyo de subvenciones de 5 For The Fight y Huntsman Cancer Institute (KIH), la V Foundation for Cancer Research (KIH) y DK133455 (KIH). Esquemas del protocolo creado con Biorender. Además, los autores desean agradecer a Stephanie Giagnocavo y al Cell Imaging Core de la Universidad de Utah por su ayuda en materia de imágenes, y a Mark Lee por sus comentarios sobre el manuscrito.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
100x Poloxámero 188 soluciónSigmaP5556-100mL 15 mL
cónicoCellstar188261
21 G AgujaBD 305165
5 mL JeringaBD 309646
50 mL CónicoCellstar227261
6,5 mm Transwell con 0,4 y micro; m Inserto de membrana de policarbonato para porosCorning3413
Albúmina sérica bovina (BSA)Sigma-AldrichA7906-100G
CaCl2SigmaC1016-500gm
CellMask Tinciones de membrana plasmáticaThermo Fisher ScientificC10045
CL 316243 sal disódicaTocris1499
Colagenasa en polvoSigmaC6885
DMEMGibco11995-040
DMEM sin feonol rojoGibcoA14430-01
DNasa ISigma-Aldrich10104159001
Suero fetal bovino (FBS)GibcoA56708-01
Fisherbrand Tissue Path Superfrost Plus Gold SlidesFisher scientific
Punta de pipeta de carga de gelFisher scientific02-707-181
Suplemento GlutaMAXGibco35050061
Kit de ensayo de glicerolAbcamAB133130
Hanks' Solución salina equilibrada (HBSS)Gibco14025-092
Tampón HEPESSigma83264-100ml-F
Heraeus Centrífuga Megafuge 16RThermo Scientific 
Hoechst 33342 SoluciónThermo Fisher Scientific62249
Mini agitador de incubaciónVWR12620-942
Medio 199Sigma-AldrichM4530
Cubreobjetos de microscopioVWR16004-302
PBSGibco10010023
Penicilina-estreptomicinaGibco15140-122
Espaciadores de imagen SecureSealGrace Biolabs654006
Seive (colador de cóctel de malla fina SteeL)OXO3112000https://www.oxo.com/steel-fine-mesh-cocktail-strainer-660.html
151884875004271

Referencias

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