Artículo de método

Medición de citometría de flujo de alto rendimiento del mecanotipo celular basada en la ruptura y la entrega de sondas de tensión de ADN en las células

DOI:

10.3791/67852

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13 de junio de 2025

 , 
1College of Biological Sciences, University of Minnesota

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este método mide la propensión de una célula a romper dúplex de ADN inmovilizado que presentan ligandos para informar sobre las fuerzas de tracción celular relativas. Los oligonucleótidos fluorescentes rotos se introducen en la célula y se analizan mediante citometría de flujo, registrando la historia mecánica de la célula. Esto permite la medición de alto rendimiento de la generación de fuerza celular en el contexto del mecanofenotipado celular.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las fuerzas mecánicas guían muchos procesos celulares críticos, y el fenotipo mecánico celular, o mecanotipo, se interrumpe en muchas enfermedades. El método más utilizado para cuantificar las fuerzas celulares es la microscopía de fuerza de tracción, que tradicionalmente captura las fuerzas que las células ejercen sobre su entorno mediante microscopía de alta resolución de células que deforman sustratos elásticos que contienen perlas fluorescentes, micropostes desviados o alteran la conformación de sensores de tensión molecular inmovilizados. Presentamos aquí un método de alto rendimiento para medir las fuerzas relativas de tracción celular utilizando sondas de tensión de ADN establecidas y cuantificadas mediante citometría de flujo. Hay cinco pasos generales involucrados en este método que se describen a continuación. En primer lugar, la expresión y purificación del ligando de integrina de alta afinidad, la equistatina, fusionada con una etiqueta HUH de enlace al ADN; en segundo lugar, la preparación de las sondas dúplex de ADN que contienen reporteros y ligando; tercero, la preparación de la superficie y la inmovilización de las sondas; cuarto, la ejecución del experimento de correa de manómetro de tensión "Rupture and Deliver" y la lectura de flujo. Finalmente, describiremos el análisis de datos y la interpretación de los resultados experimentales.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las fuerzas mecánicas guían muchos procesos celulares críticos, desde la migración1 hasta la diferenciación de las células madre2 y la capacidad de una célula T para unirse y ser activada por la célula presentadora de antígeno3 correcta. Las variables mecánicas están desreguladas en la enfermedad, lo que resulta en diferencias medibles en el fenotipo mecánico celular, o mecanotipo, de las células 4,5. La mecanotipia es un término general para las propiedades mecánicas de las células y los tejidos y puede incluir parámetros como la contractilidad, la migración, la adhesión y la deformabilidad. La rigidez de las células o tejidos es el aspecto más común del mecanotipo medido, ya que se puede medir en un alto rendimiento. Por ejemplo, las células cancerosas suelen ser más rígidas que las células normales, mientras que las células metastásicas suelen ser más dóciles 6,7. La generación de fuerza por parte de las células es un aspecto importante del mecanotipo alterado en la enfermedad8 porque sondea las interacciones específicas entre la célula y el entorno. La microscopía de fuerza de tracción es el método más común para medir la generación de fuerza celular e implica el recubrimiento de células en sustratos elásticos deformables incrustados con perlas fluorescentes o en matrices de micropostes y el seguimiento de los cambios en el movimiento del cordón o la deflexión posterior para calcular las fuerzas ejercidas por las células. Los sensores de tensión molecular también se han utilizado para medir fuerzas de tracción y ofrecen la ventaja de la sensibilidad a magnitudes más pequeñas de fuerza y la medición de fuerzas generadas por pares específicos de ligando-receptor 9,10. Sin embargo, la medición de las fuerzas celulares con sensores tradicionales de TFM y tensión molecular se basa en imágenes de alta resolución, lo que limita el rendimiento de la medición.

Recientemente adaptamos las sondas de tensión dúplex de ADN en una lectura de alto rendimiento de la generación de fuerza celular en el contexto del mecanofenotipado celular11 (Figura 1). Brevemente, los dúplex de ADN adaptados de las sondas de tensiómetro (TGT)ampliamente utilizadas 12 se inmovilizan en los pocillos de placas de 96 pocillos mediante la química de biotina-neutravidina de la hebra "ancla"13. La fuerza de ruptura requerida de los dúplex TGT se puede ajustar variando la posición de la biotina en la hebra de anclaje, lo que altera la geometría del dúplex, lo que da como resultado una conformación de descompresión de baja fuerza de ruptura (Figura 2A) o una conformación de corte de alta fuerza de ruptura (Figura 2B). La hebra de anclaje contiene biotina y un extintor de fluorescencia, mientras que la hebra de "ligando" del ADN contiene una sonda fluorescente y un ligando que reconoce un receptor de la superficie celular involucrado en la mecanodetección, como una integrina. El ligando se une covalentemente al ADN (Figura 3) mediante el uso de una etiqueta de fusión de enlace de ADN llamada etiqueta HUH fusionada con el ligando14,15. Las etiquetas HUH son pequeños dominios de endonucleasa HUH involucrados en la replicación viral y otros procesos que reconocen una secuencia/estructura de 9 pb de ADN monocatenario, la cortan y forman un aducto covalente de fosfotirosina en el extremo 5' del ADN mellado.

Las células colocadas encima de estas sondas se unen al ligando y rompen un porcentaje de las sondas proporcional a las fuerzas que generan. La hebra de ligando fluorescente unida a su receptor se introduce posteriormente en la célula. Por lo tanto, la historia mecánica de las células se registra en las células de interés a través de la magnitud de su fluorescencia. La fluorescencia se puede cuantificar mediante citometría de flujo. A este método lo llamamos Rupture and Deliver-TGTS o RAD-TGTs. Este método no solo mide la fluorescencia y, por lo tanto, la fuerza relativa generada por miles de células a la vez, sino que también la lectura de citometría de flujo ofrece el potencial de clasificar las células por su mecanotipo, lo que permite lecturas ómicas posteriores, así como CRISPR-KO o pantallas de fármacos que podrían identificar genes o fármacos que alteran el mecanotipo celular.

En el siguiente protocolo, demostramos cómo preparar y ejecutar un experimento RAD-TGT. Destacaremos la expresión y purificación de un tipo de HUH conocido como WDV (por el virus del enanismo del trigo) por sí solo para que sirva como control negativo y fusionado con la equistatina, un ligando que se une estrechamente a una familia de receptores de adhesión que transducen la fuerza entre la célula y el entorno conocida como integrinas de unión a RGD, para servir como condición experimental. A partir de esto, demostraremos cómo preparar RAD-TGT para uso experimental. Explicaremos cómo proceder con los experimentos y cómo analizar los datos resultantes. También destacaremos una aplicación de RAD-TGTs midiendo cómo un inhibidor de ROCK altera las fuerzas mediadas por integrinas en células CHO-K1 (Figura 4). En resumen, esperamos que este protocolo sirva como una entrada a la mecanobiología independientemente de la experiencia previa; El campo se encuentra en su etapa incipiente y todos los antecedentes son esenciales para una mayor comprensión.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Expresión y purificación de HUH

  1. Transforme Escherichia coli con plásmido WDV (± Echistatin), aproximadamente 1,5 μL de plásmido de ~50 ng/μL por transformación, y crezca en placas de agar ampicilina.
  2. Inocular 5 mL de LB con una sola colonia y crecer durante la noche a 37 °C.
  3. Inocular 1 L de LB con el cultivo nocturno y crezca hasta que OD600 alcance ~0.8.
  4. Bajar la temperatura a 18 °C, inducir con 500 μM de isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) e incubar durante la noche.
  5. Granular las células por centrifugación a 3.750 × g durante 30 min. Vuelva a suspender el pellet con 40 mL de tampón de lisis (300 mM de NaCl, 50 mM de Tris pH 7,5, 1 mM de EDTA).
  6. Lisar las células con sonicación de 3 x 90 s sobre hielo al 70% del ciclo de trabajo, potencia 7. Girar a 24.000 × g durante 30 min a 4 °C y verter el sobrenadante en un nuevo tubo de 50 mL.
  7. Coloque la suspensión de resina Ni-NTA en un tubo cónico de 15 mL (1 mL de suspensión de perlas/L de cultivo), centrifugue a 700 × g durante 2 min y retire el sobrenadante.
  8. Añade 6 mL de agua a la resina y repite el proceso de lavado en el paso 1.7.
  9. Repita el lavado dos veces con tampón de lavado (300 mM de NaCl, 50 mM de Tris [pH 7,5], 1 mM de EDTA, 20 mM de Imidazol) en lugar de agua. Vuelva a suspender las perlas en 5 ml de tampón de lavado.
  10. Agregue la suspensión de perlas (paso 1.9) a las células lisadas (paso 1.6) y mezcle bien. Gire las células lisadas y las perlas durante al menos 1 h a 4 °C.
    NOTA: Durante el resto de este protocolo, nunca dejes que la resina se seque y recoge todas las muestras que fluyan a través de la columna.
  11. Vierta la mezcla en una columna de 20 ml y recoja el flujo. Lave la columna con 4 x 25 mL de tampón de lavado.
  12. Eluir con 1 x 10 mL de tampón de elución (300 mM de NaCl, 50 mM de Tris [pH 7,5], 1 mM de EDTA, 250 mM de Imidazol) en un tubo fresco de 15 mL, recogiendo la elución temprana y tardía por separado (la elución temprana es el primer 1 mL, la elución tardía es el 1 mL final).
  13. Analice todas las fracciones recolectadas mediante electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) para asegurarse de que la HUH se recolectó durante la elución (consulte la figura complementaria S1). Para obtener los mejores resultados, cargue un gel al 4-20% y hágalo funcionar durante 45 minutos a 35 W y 200 V.
  14. Añada la proteína eluida en el tubo de diálisis e incube durante la noche en un tampón de diálisis (igual que el tampón de lisis) a 4 °C. Para eliminar la etiqueta HIS, agregue ULP1 sin agente reductor directamente a la proteína eluida antes de colocar la proteína en el tubo de diálisis.
  15. A la mañana siguiente, prepare la resina Ni-NTA como se describe en los pasos 1.7-1.9 e incube con la proteína dializada. Vierta la mezcla de la proteína y la resina Ni-NTA en una columna y recoja el flujo. Lave la columna con 10 ml de tampón de diálisis y recoja cualquier flujo.
  16. Evalúe la fracción recolectada en SDS-PAGE siguiendo la configuración anterior para asegurarse de que la proteína esté presente y concéntrese a la concentración deseada utilizando un filtro ultracentrífugo de 15 mL con un límite de peso molecular de 10 kDa (consulte la Figura complementaria S1).
    NOTA: La concentración ideal de proteína final está entre 40 μM y 100 μM.

2. Preparación de RAD-TGT

  1. Ensamble dúplex en una proporción molar de 1,1:1 de hebra de anclaje (con extintor) a hebra de ligando (con fluoróforo) a una concentración final de 40 μM de hebra de ligando en una solución de 10 mM de Tris (pH 7,5), 50 mM de NaCl y 1 mM de EDTA.
  2. Recocido mediante incubación a 98 °C durante 5 min seguido de enfriamiento a temperatura ambiente durante 1 h; Proteger de la luz.
    NOTA: Las muestras de bajo volumen se evaporan fácilmente y pueden ser difíciles de recuperar por completo. Prepare un volumen mayor del necesario.
  3. Reaccionar los dúplex recocidos con HUH (utilizando la concentración de la hebra menos abundante al recocer; en este caso, la hebra del ligando) en una proporción molar de 1:2 a una concentración final de 10 μM dúplex y 20 μM de HUH en una solución que contenga 1 mM MnCl2, 50 mM HEPES (pH 8), 50 mM NaCl.
  4. Incubar la reacción durante 30 minutos a 37 °C en un termociclador o bloque de calor protegido de la luz. Después de la incubación, retírelo del fuego y use un minifuger de sobremesa para centrifugar los TGT ahora ensamblados. Coloque los TGT inmediatamente en una placa o guárdelos a 4 °C en la oscuridad.

3. Preparación de la superficie

  1. Inmediatamente después de abrir una placa inferior de vidrio de 96 pocillos, cubra todos los pocillos con una placa de PCR adhesiva para preservar los pocillos no utilizados para su uso posterior. Use una hoja de afeitar para cortar el papel de aluminio sobre los pocillos de interés (preferiblemente pocillos sin borde) y agregue 100 μL de PBS frío a los pocillos deseados.
    NOTA: Una vez que se agrega líquido a los pozos, no deje que los pozos se sequen. Si se produce un secado, la adsorción no específica de biomoléculas a la superficie tendrá un impacto negativo en los datos. Mantenga 100 μL de exceso de volumen continuamente en el pozo para evitar que se seque.
  2. Agregue 200 μL de PBS frío a los pocillos, mezcle suavemente con pipeta 2-5x y retire 200 μL de PBS. Repita durante un total de tres lavados.
    NOTA: Al agregar y eliminar líquido de los pocillos, mantenga la punta de la pipeta en el borde del pocillo en un ángulo de 45° para evitar alterar la superficie. Haga esto para toda la manipulación de la placa, excepto cuando se enchapan las celdas.
  3. Para los pocillos experimentales, prepare una solución de 0,1 mg/mL de Biotinilado-BSA en PBS y agregue 80 μL de la solución a los pocillos deseados. Para los pocillos de control, prepare la misma solución con la adición de 18,75 μg/mL de fibronectina y agregue 80 μL a los pocillos respectivos. Mezcle suavemente con pipeta todos los pocillos utilizados, coloque la tapa en el plato y cubra con papel de aluminio. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
  4. Retire 80 μL de volumen de los pocillos y lávelos repitiendo el paso 3.2. Añadir 80 μL de neutravidina 0,1 mg/mL en la solución de PBS de la misma manera que en el paso 3.3.
  5. Después de la incubación, retire 80 μL de volumen de los pocillos y repita el paso 3.2. Diluir los TGT ensamblados (paso 2 de la preparación RAD-TGT) a 0,1 μM en PBS y 80 μL de solución en los pocillos de manera similar al paso 3.3. Cubra los pocillos con una lámina adhesiva y guárdelos en la oscuridad a 4 °C o protéjalos de la luz e incube a temperatura ambiente durante 1 h antes de continuar con los experimentos.
    NOTA: Recomendamos tratar el paso 3.5 como un punto de parada y esperar hasta el día siguiente para continuar con los experimentos.

4. Protocolo experimental RAD-TGT

  1. Después de que los TGT hayan tenido tiempo suficiente para adherirse, lavar los pocillos (ver paso 3.2) 3 veces con PBS, seguido de dos lavados con medios sin suero. Deje los medios en los pozos después del lavado final. Agregue 200 μL de PBS a los pocillos periféricos para mitigar cualquier efecto de borde y transfiera la placa a una incubadora a 37 °C para precalentar la placa.
  2. Recupere las células de interés con una confluencia de ~80% y aspire el medio seguido de la adición y aspiración de PBS para lavar las células. Añadir un volumen adecuado de tripsina y colocar la placa en una incubadora de cultivo celular a 37 °C hasta que las células se disocien (~5-10 min).
  3. Una vez disociadas las células, añada a la placa el volumen original de medios celulares completos utilizados para mantener las células y vuelva a suspender con una pipeta serológica. Agregue la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mL.
  4. Centrifugar las células a 300 × g durante 4 minutos, aspirar el medio y volver a suspender el pellet en PBS. Repita la centrifugación y la aspiración, luego vuelva a suspender en 5 ml de medio sin suero y repita la centrifugación y la aspiración. Vuelva a suspender las células en ~ 2 mL de medio sin suero.
  5. Determine la densidad de las células resuspendidas y ajuste la concentración como desee.
    NOTA: Nuestro objetivo es colocar ~ 15,000 células por pocillo, por lo que preparamos las celdas para que estén en una concentración de 150,000 celdas / mL, lo que permite que 15,000 celdas se siembren con 100 μL de celdas resuspendidas.
    1. Opcional: Si se va a probar el efecto de los medicamentos u otros agentes farmacológicos, agregue la concentración adecuada de medicamento a las células y devuélvalas a la incubadora. Permita un tiempo de preincubación adecuado antes de continuar con el siguiente paso.
  6. Recupere la placa de la incubadora (paso 4.1) y elimine el volumen de medios que queda del lavado de los pocillos experimentales en la placa precalentada. Lavar una vez con el medio deseado. Pipetear cuidadosamente 100 μL de las células resuspendidas en los pocillos deseados. Transfiera las celdas plateadas a la incubadora durante 90 minutos.
    NOTA: Pipetea suavemente las celdas en el centro de los pocillos, tratando de mantener la pipeta vertical.
  7. Después de la incubación, retire ~ 125-170 μL de volumen de los pocillos. Si es necesario, lave las células suavemente con 200 μL de PBS caliente. Agregue 50 μL de tripsina a cada pocillo y devuelva la placa a la incubadora hasta que las células comiencen a disociarse (5-10 min).
    NOTA: Asegúrese de que el pozo nunca se seque y que no ocurra una sobretripsinización.
  8. Añada 160 μL de tampón de flujo recién preparado (1 mM de EDTA, 2% p/v de albúmina sérica bovina, en PBS frío) a los pocillos. Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para disociar las células, añadir 196 μL de esta suspensión celular a los tubos de PCR seguidos de 4 μL de yoduro de propidio y mezclar suavemente. Prepare una muestra de control sin yoduro de propidio para que sirva como control para la compuerta de viabilidad.
  9. Coloque los tubos en una cubitera con la tapa bloqueando la luz y proceda a medir la intensidad de fluorescencia con un citómetro de flujo.

5. Recopilación y análisis de datos

  1. Analice cada muestra con un citómetro de flujo. Trate de recolectar al menos 2,000 células individuales vivas por muestra.
    NOTA: Minimice la exposición a la luz para las muestras que aún no se han analizado y manténgalas en hielo.
  2. Una vez que se hayan recopilado todos los datos, transfiera los archivos al software de su elección y bloquee las celdas.
    1. Puerta para celdas por área de dispersión directa (FSC-A) frente a área de dispersión lateral (SSC-A).
    2. Puerta para singletes dentro de la población de células por FSC-A frente a la altura de dispersión directa (FSC-H).
    3. Puerta para células vivas de la población singlete estableciendo una puerta vertical en el histograma de la intensidad de la zona de yoduro de propidio al valor más alto para el control sin yoduro de propidio preparado en el paso 4.8. Cualquier evento que no exceda la puerta son celdas vivas
    4. Establezca una puerta vertical en un histograma de intensidad de área Cy5 (Cy5-A) de los singletes para eliminar cualquier evento no fluorescente en el canal Cy5-A causado por desechos celulares. Asegúrese de que esta puerta vertical esté en un valor inferior al de las células no marcadas analizadas, pero superior a 0 de intensidad fluorescente.
    5. Para analizar las poblaciones de células, establezca una puerta bisectriz enel percentil 99 de cada control negativo respectivo.
    6. Aplique una puerta a la misma intensidad que las condiciones experimentales correspondientes y recoja el porcentaje de células que exceden la puerta de control negativa para cada condición.
      NOTA: Los porcentajes se pueden comparar directamente entre las réplicas biológicas mediante un análisis estadístico adecuado; Ver datos representativos.
  3. Analice los datos utilizando la fluorescencia Cy5 mediana, dividiendo la intensidad mediana del ligando-WDV por la mediana del WDV solo y compare estos valores entre réplicas.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para demostrar la utilidad y facilidad de uso de los RAD-TGT, analizamos los efectos de los inhibidores de la Rho quinasa (ROCK) en el mecanotipo de las células CHO-K1. La vía ROCK está involucrada en la organización de la actina y la activación de la miosina. Estudios previos con TGTs han demostrado que la inhibición de ROCK disminuye la ruptura de los TGTs de cizallamiento 16,17,18. Los TGT de cizallamiento o de alta fuerza in...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hemos proporcionado protocolos sobre cómo configurar y realizar experimentos RAD-TGT con el objetivo de animar a los científicos de las ciencias de la vida a incorporar el mecanotipado en su flujo de trabajo. Una ventaja clave de los RAD-TGT, particularmente para aquellos con capacidad de producción de proteínas, es el uso de endonucleasas HUH para ligar ligandos a dúplex de ADN con alta fidelidad sin ningún tipo de reticulación química y/o purificación. Las endonucleasas HUH abarcan una...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W.R.G. reconoce la financiación de los NIH R35GM119483. Se utilizó Biorender para hacer esquemas de figuras.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubo cónico de 15 mLSarstedt62.554.205
Placa inferior de vidrio de 96 pocillosCellvisP96-1.5H-N
Placa adhesiva de PCRlámina Thermo Fisher ScientificAB-0626
AmpicilinaApex Bioresearch Products 25-530
Bio-Rad Columna de 20 mLBio-Rad7321010
Biotinilado BSAThermo Fisher Scientific29130
BL21 (DE3) Competente E. coliNew England BiolabsC2527H
Albúmina sérica bovinaThermo Fisher ScientificBP9703100
Incubadora de cultivo celularThermo Fisher Centrífuga 51030284
Scientific Thermo Fisher Scientific75009521
CHO-K1ATCCCCL-61
Tubo de diálisisThermo Fisher ScientificPI88242
DMSOThermo Fisher ScientificD12345
EDTAThermo Fisher ScientificS311-100
Flow CitómetroBDAccuri C6 Plus
FlowJo BDFlowJo v10.10
HEPESThermo Fisher ScientificBP310-1
ImidazolThermo Fisher ScientificO3196-500
IPTGIBI ScientificIB02125
LB agar FisherScientificBP1425-500
Ligando StandTecnologías de ADN integradas Oligodiseñado por el usuarioGCT ATA AAC TCA CCG TAA TTT TTT GGC CCG CAG CGA CCA CCC TTT /3Cy5Sp/
Lisogenia Caldo (LB)Thermo Fisher ScientificBP1426-500
MnCl2Thermo Fisher ScientificM87-100
NaClThermo Fisher ScientificBP358-212
NeutrAvidin ProteinThermo Fisher Scientific31000
Nickel-NTA resina Thermo Fisher Scientific88222
PBSCorning21-031-CV
Placa de PetriVWR25384-342
Solución de yoduro de propidioCayman Chemicals10008351
SDS-PAGE gelBio-Rad4561096
Serum Free MediaThermo Fisher ScientificA4124801Gibco Optimem Usados, medios alternativos sin suero son adecuados para usar
Filamento de anclaje de cizallamientoTecnologías de ADN integradasOligo/5IAbRQ//iBiodT/G GGT GGT CGC TGC GGG CC
SonicatorThermo Fisher Scientific15-345-139
TermocicladorBio-Rad1861096
TrisThermo Fisher ScientificBP152-500
TrypinThermo Fisher Scientific12605036
, corte de 10 kDaAmikon
Tecnologías de ADN integradas Diseñadopor el usuario oligo/5IAbRQ/GG GTG GTC GCT GCG GGC C/3Bio/
WDV PlásmidoAddGene226983
WDV-Echistatin PlasmidAddGene226985
Y-27632Selleck ChemicalsS1049reconstituido en DMSO
Filtro ultracentrífugo Filamento de anclaje de descompresión

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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