Aquí, proporcionamos un método para el análisis de imágenes de células vivas que se puede utilizar para rastrear manualmente los linajes de los queratinocitos de paso 0 y que permite la recopilación de métricas de proliferación, incluido el destino de la división celular y la duración del ciclo celular.
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Artículo de método
Imágenes de células vivas con fotografía de lapso de tiempo para estudiar la cinética de proliferación de queratinocitos epidérmicos
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Resumen
Resumen
La obtención de imágenes de células vivas es un método en evolución y algo desafiante para estudiar el comportamiento de los queratinocitos in vitro. Históricamente, el comportamiento de la división de los queratinocitos se investigó mediante métodos como el análisis clonal, la inmunotinción y el análisis del ciclo celular. Ninguno de estos métodos permite analizar el comportamiento de los queratinocitos a nivel de una sola célula en tiempo real. Durante la última década, los grupos han utilizado imágenes de células vivas para identificar células madre de queratinocitos y progenitores comprometidos sin necesidad de etiquetado. Se han identificado diferencias en el comportamiento de división, la tasa de diferenciación terminal y la duración del ciclo celular de cada grupo respectivo. En este trabajo se describe un método para la obtención de imágenes de células vivas de queratinocitos con fotografía time-lapse y su análisis. Se recomienda el uso de queratinocitos no transitados para que este método imite más de cerca el comportamiento in vivo . Las imágenes de células vivas proporcionan una capacidad única para estudiar el comportamiento de las células madre y los progenitores comprometidos a nivel de una sola célula y para determinar los destinos de la división, la duración del ciclo celular, así como otras métricas de proliferación.
Introducción
La capacidad de visualizar poblaciones de células in vitro en tiempo real a medida que se expanden durante largos períodos de tiempo es un beneficio único de las imágenes de células vivas. Las imágenes de células vivas permiten evaluar la motilidad, la migración y la proliferación de las células a nivel de una sola célula. El objetivo de este protocolo es optimizar la visualización de los cultivos de queratinocitos a través de la fotografía de lapso de tiempo, produciendo videos que luego se pueden rastrear manualmente para obtener datos granulares sobre el comportamiento celular.
Nos centramos en la cinética de la proliferación. A partir del análisis de los videos de imágenes de células vivas, se pueden dilucidar los árboles de linaje y se puede evaluar el tiempo entre divisiones (un indicador de la duración del ciclo celular), así como las proporciones de divisiones que conducen a una mayor división frente a la diferenciación de las células hijas.
Existe una variabilidad sustancial de donante a donante cuando se trata de queratinocitos primarios y frecuentes intentos fallidos de propagación celular. Debido a esto, muchos investigadores optan por utilizar queratinocitos altamente proliferativos, como las células HaCaT o los queratinocitos neonatales, a menudo después de haber pasado por múltiples deposiciones in vitro1. El cultivo de queratinocitos primarios de piel adulta o envejecida con el fin de rastrear el linaje puede ser un desafío. Sin embargo, existen problemas con el uso de células pasadas de líneas celulares o del prepucio masculino. El paso repetido da como resultado células que son significativamente diferentes de su estado in vivo 2. Además, se ha demostrado que las células HaCaT reaccionan de manera diferente a los queratinocitos primarios en múltiples ensayos 3,4,5. Para utilizar las células que más se parecen a sus contrapartes in vivo, se utilizan queratinocitos de paso 0 de donantes humanos adultos. Las células madre de queratinocitos y los progenitores comprometidos exhiben claras diferencias en el comportamiento, que permiten distinguir las colonias de cualquiera de las poblaciones a través de imágenes de células vivas6. Esta capacidad relativamente novedosa para visualizar el comportamiento de los queratinocitos individuales a largo plazo se ha utilizado solo en unos pocos estudios previos que utilizan técnicas similares 6,7,8. Este protocolo describe la obtención de imágenes de células vivas de queratinocitos primarios utilizando el sistema de análisis de células vivas IncuCyte S3. A partir de los árboles de linaje que se construyen, se puede determinar el tipo de colonia (célula madre frente a progenitora comprometida), así como la duración del ciclo celular y la proporción de divisiones de diferenciación.
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Protocolo
Este estudio se realizó de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Todo el tejido humano se obtuvo después de la aprobación de la junta de revisión institucional (IRB) de la Universidad de California, San Francisco (UCSF), y se obtuvo el consentimiento para todo el tejido utilizado.
1. Fotografía de lapso de tiempo de queratinocitos humanos de pasaje 0
NOTA: Este protocolo es específico para IncuCyte S3 y SX5.
- Asegurarse de que se hayan obtenido las aprobaciones apropiadas del comité de investigación en seres humanos de la institución para utilizar tejido humano para el estudio.
- Aislar los queratinocitos de la piel fresca como se describió anteriormente9.
- Determine la densidad de siembra para el ensayo. Llevar a cabo estudios piloto con muestras en múltiples diluciones de diferentes donantes para comprender la densidad de células necesaria con el fin de garantizar colonias adecuadas para el estudio, pero evitar colonias excesivas que resulten en una superposición de colonias durante el período de observación. Ejecute estos pilotos en condiciones experimentales idénticas (mismas placas, reactivos, etc.), ya que estos factores pueden alterar los resultados.
NOTA: Una densidad de siembra demasiado baja da como resultado un crecimiento insuficiente, mientras que una densidad de siembra demasiado alta da como resultado la incapacidad de rastrear con precisión las células debido al hacinamiento de células en el campo.- Para los queratinocitos de paso 0 de prepucios neonatales de menos de 48 h de una colección almacenada a 4 °C en medios de recolección, asegúrese de que la densidad de siembra sea de 1000-5000/cm2. Para los queratinocitos P1, utilizar 500-2000 células/cm2. Cuanto más lejos esté el paso, menor será la densidad de siembra.
- Celdas de placa en el tamaño de placa seleccionado.
NOTA: Las placas y microplacas de 96 pocillos tienen un efecto de menisco, lo que da como resultado una distribución celular no uniforme, con gran parte del crecimiento fuera del campo del generador de imágenes. Las placas con pocillos más grandes (placas de 24 pocillos, por ejemplo) permiten capturar más datos. Las placas de 24 pocillos permiten la visualización de hasta 36 campos, mientras que las placas de 96 pocillos permiten la visualización de solo 5 campos. Sin embargo, el número de campos capturados en un instrumento es finito y más campos consumirán más capacidad del generador de imágenes. Por lo general, se utiliza una placa de 24 pocillos.- Para lograr una distribución uniforme de las células en la placa, se pueden utilizar varias técnicas. En primer lugar, en lugar de sembrar individualmente cada pocillo, alícuota el medio total necesario para todos los pocillos en una dilución específica en un microtubo. A continuación, pipetee el número total de células necesarias para que la alícuota alcance la densidad deseada e invierta suavemente el tubo para distribuir homogéneamente las células.
- Después de colocar el plato, mueva la placa en un patrón de cruz tres veces (arriba-abajo, izquierda-derecha) y luego transfiérala a la incubadora con cuidado.
PRECAUCIÓN: Si utiliza una microplaca, evite las filas y columnas exteriores de los pocillos, ya que el microscopio de lapso de tiempo genera calor al obtener imágenes y puede causar la evaporación de los medios en esos pocillos. Los pozos experimentales deben agruparse en el centro de la placa y rodearse de pocillos que contengan PBS u otro fluido estéril a su máxima capacidad para reducir los efectos de evaporación y borde.
- Incubar las células durante 24 h a 37 °C y 5% de CO2 para permitir la adherencia.
- Cambie el soporte después de 24 h.
NOTA: No moleste la monocapa en crecimiento al aspirar. Utilice siempre medios calentados (37 °C) y haga fluir suavemente los medios hacia los pocillos utilizando la pared lateral. Los medios utilizados aquí son Epilife/Supplement S7/Primocin. Se recomienda el uso de antibióticos en medios para la obtención de imágenes de células vivas a largo plazo para esta aplicación. El cultivo extendido en una máquina que se utiliza para múltiples experimentos simultáneos tiene un alto riesgo de contaminación. La penicilina y la estreptomicina se usan comúnmente. - Abra la incubadora presionando el botón triangular grande en la parte inferior izquierda para abrir la bandeja cuando la luz esté verde. Coloque la embarcación en una bahía abierta. Luego, cierre la bandeja usando el mismo botón en la parte inferior izquierda. Nunca abra la bandeja cuando el botón para abrir esté rojo, ya que eso significa que está escaneando activamente y el escaneo se interrumpirá.
PRECAUCIÓN: Asegúrese de que no haya escaneos que comiencen mirando la pantalla en el módulo del controlador. Indica el tiempo hasta el próximo escaneo y la duración del escaneo. Si el escaneo ha comenzado, le dará el tiempo hasta que se complete el escaneo. - Abra la aplicación en la computadora e inicie sesión con el ID de usuario y la contraseña adecuados. Seleccione Programar.
- Presione el botón + en la esquina superior izquierda debajo del horario para agregar el plato al horario.
- Seleccione Analizar según programación y, a continuación, haga clic en Siguiente.
- Seleccione Nuevo y, a continuación, haga clic en Siguiente.
NOTA: Si esta placa es idéntica a un experimento anterior o en ejecución, se puede utilizar Copiar anterior o Copiar actual para acelerar el formato del experimento. - Seleccione Estándar para el tipo de análisis y, a continuación, haga clic en Siguiente.
NOTA: Image Lock es una placa patentada de 96 pocillos que ayuda a minimizar la ocurrencia de pérdida de enfoque / salto de imagen, lo que puede ser útil si se enfrentan estos problemas. Los otros tipos de escaneo no son particularmente útiles para el rastreo de linaje. - Para la configuración de escaneo, seleccione Adherent Cell-by-Cell usando el canal de fase en el objetivo 10x y, a continuación, haga clic en Siguiente.
NOTA: Siempre que se elija el canal de fase, no es necesario seleccionar ninguna opción de análisis en este punto, ya que el análisis se puede iniciar después de capturar los datos. - Seleccione la embarcación y, a continuación, haga clic en Siguiente. La mayoría de los recipientes comunes son compatibles con la máquina, aunque las no microplacas pueden necesitar accesorios especiales para encajar en las bahías del microscopio de lapso de tiempo.
- Seleccione una bahía vacía para colocar la embarcación y, a continuación, haga clic en Siguiente.
- Seleccione los pocillos que desea escanear, así como las imágenes por pocillo y, a continuación, haga clic en Siguiente. La duración estimada del escaneo se proporcionará en la parte inferior izquierda de la pantalla.
- Asigne un nombre al experimento con la convención de nomenclatura deseada. Crea un mapa de placas del experimento para futuras referencias, luego presiona Aceptar. Finalmente, haga clic en Siguiente.
- Aplace el análisis hasta después de la recopilación de datos, ya que el análisis celda por celda debe iniciarse después de que se haya completado el escaneo. Haga clic en Siguiente.
- Por último, establezca la frecuencia de las imágenes. Con el fin de realizar un seguimiento fiable de las mitosis, que se producen durante 30 minutos, se realiza una exploración a intervalos de 20 minutos en busca de queratinocitos. Presione Siguiente y confirme la configuración para comenzar el experimento.
NOTA: Los tiempos de escaneo no pueden superponerse, y los fabricantes recomiendan que la máquina esté en reposo durante todo el tiempo que esté escaneando. Con intervalos de 20 minutos, eso significa que se deben dedicar un máximo de 10 minutos a escanear. Si se toman imágenes de 12 pocillos de una placa de 24 pocillos a 36 vistas por pocillo, el escaneo tarda 7 minutos en completarse, por lo que siempre debe tener en cuenta los recursos disponibles para el experimento al planificar.- Hay una notificación si no hay tiempo suficiente para que la máquina descanse, y si los tiempos de escaneo se superponen, entonces el recipiente no se puede agregar al horario. Si la embarcación no puede caber en el horario a intervalos regulares, haga clic en Reservar ubicación de la bandeja y presione Siguiente.
- Haga doble clic en el horario en la parte superior de la pantalla y seleccione el barco en reserva, luego haga clic manualmente para agregar imágenes en las franjas horarias abiertas. Como alternativa, haga clic con el botón derecho una vez que la programación esté abierta para eliminar todas las horas de análisis programadas y haga clic con el botón derecho para establecer nuevas horas de análisis para un grupo de análisis a intervalos regulares.
NOTA: Esto interrumpiría todos los experimentos actualmente en la máquina hasta que se establezcan nuevos tiempos. No olvide presionar el ícono del disquete para guardar o la X roja para cancelar los cambios en el horario. La selección de los pozos o vistas deseados es un proceso sencillo, ya que la máquina proporciona inmediatamente el tiempo estimado de escaneo tras la selección de parámetros. La duración del escaneo depende del tipo y la marca de placa seleccionada, así como del número de pocillos o vistas que se van a escanear. Esto permite a los usuarios ajustar los parámetros de escaneo para que coincidan con la capacidad de la máquina.
- En el caso de los queratinocitos, cambiar de medio cada 48 h. Para garantizar la orientación correcta de la placa, espere a que se complete el primer escaneo cada vez que se coloque un recipiente en la máquina (si el tiempo lo permite). Es un error sencillo de cometer. Coloque la placa en la máquina de modo que las letras que denotan las filas estén en el lado izquierdo de la bahía.
- Para ver los exámenes, presione el botón Ver con el icono del ojo y, a continuación, haga doble clic en el experimento. Considere cambiar el medio temprano si hay un cambio repentino en el color del medio (los medios que contienen rojo de fenol se vuelven amarillos debido a la acidificación), si hay un exceso de células muertas presentes (puede interferir con la proliferación de colonias vivas) o si se observa una morfología anormal.
- Una vez que todos los pozos se hayan vuelto inactivos o hayan alcanzado la confluencia, exporte el experimento. Seguimiento de las colonias adultas durante ~2 semanas y neonatales durante ~10 días, momento en el que el hacinamiento provoca rendimientos decrecientes para los análisis.
- Para exportar, haga clic en la pestaña Vista y haga doble clic en el experimento en la lista de exámenes recientes (el valor predeterminado es que se ordenen desde el más reciente hacia atrás). Haga clic en el icono Horizontal con la flecha y espere a que se inicie la herramienta de exportación.
- Haga clic en "Como se muestra" y, a continuación, haga clic en Siguiente.
- Haga clic manualmente en cada campo de vista para exportar y, a continuación, haga clic en Siguiente.
- Seleccione si desea una película o una serie de imágenes y, a continuación, seleccione los tiempos de escaneo que desea exportar. Para el rastreo del linaje de queratinocitos, use la opción de película y seleccione todos los escaneos (hay un ícono rápido de Seleccionar todo con una línea discontinua para acelerar esto). Haga clic en Siguiente.
- Exporte a 1 fotograma por segundo con la máxima calidad (configúrelo usando la barra junto a calidad). Haga clic en Siguiente.
- Elija la carpeta de destino y el tipo de archivo. Asigne un nombre al archivo y, a continuación, haga clic en Exportar.
NOTA: La exportación de vídeos puede llevar mucho tiempo, dependiendo de la velocidad de la conexión a Internet y del ordenador de que se trate. Prepárese para esperar varios días para exportar todos los archivos de video para experimentos más grandes. Tener la capacidad de iniciar sesión en el microscopio de lapso de tiempo de forma remota es extremadamente conveniente.
2. Uso de imágenes de lapso de tiempo para construir árboles de linaje y generar hojas de datos
- Abra el archivo de video con un reproductor multimedia. Se recomienda el reproductor multimedia VLC.
- Desplácese por los videos e identifique las colonias en crecimiento. Con VLC, usa la tecla de flecha para saltar fotogramas hacia adelante y hacia atrás. Tome una captura de pantalla de la colonia que se va a rastrear y etiquete la colonia.
- Identifique una colonia de interés al final o después de algunos días de grabación de video, luego rebobine el video e identifique la célula formadora de colonias.
NOTA: Aquí es donde es importante tener la densidad de siembra adecuada. Si se desarrollan demasiadas colonias una al lado de la otra, se expanden y se fusionan entre sí, lo que hace imposible realizar un seguimiento preciso de las divisiones celulares. - Cuando una célula está a punto de dividirse, parece condensarse (Figura 1). Pausa el vídeo cuando se produzca la división. Registre la hora de la división (hay una marca de tiempo en la esquina inferior izquierda). Haz una captura de pantalla de esta división inicial y ponle la misma etiqueta que a la colonia. Registre las divisiones en un diagrama de linaje dibujado a mano (consulte Resultados representativos). Continúe rastreando y documentando tantas generaciones como sea posible.
NOTA: Se ha desarrollado/se está desarrollando el seguimiento automatizado de células para acelerar este proceso y realizar un seguimiento más preciso de las células7. Incluso en condiciones de cultivo con bajo contenido de calcio con una diferenciación mínima, los modelos de aprendizaje automático carecen actualmente de la sensibilidad necesaria para realizar un seguimiento preciso de las divisiones de los queratinocitos. - Transcriba el árbol de linaje manual en hojas de datos, llamadas "hojas verdes" debido al color de la hoja de cálculo (Archivo complementario 1).
- Utilice las hojas verdes para calcular las proporciones de divisiones proliferativas y de diferenciación, identificar las colonias de células madre y progenitoras comprometidas, y la duración del ciclo celular (ver resultados representativos).
NOTA: La máquina es capaz de analizar datos a través de sus propios analizadores básicos y célula por celda para ejecutar muchos otros ensayos (confluencia, rasguño). Sin embargo, esto está más allá del alcance de este protocolo.
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Resultados
Los queratinocitos primarios crecen de forma estereotipada, lo que se puede rastrear a través de imágenes de células vivas. El reproductor multimedia VLC se utiliza para inspeccionar grabaciones. El tiempo hasta la primera división es variable y puede ser de varios días dependiendo de las características del donante, como la edad, el estado de salud o los factores de crecimiento presentes en el ambiente in vitro . Tras la siembra inicial, los queratinocitos tienen un aspecto peq...
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Discusión
La obtención de imágenes de células vivas de queratinocitos es un método sin etiquetas para rastrear el comportamiento de división de las células madre y los progenitores comprometidos. Dado que el mantenimiento de la epidermis depende de la cinética de proliferación de las células madre y de los progenitores comprometidos10, tener una comprensión granular de los cambios en estas poblaciones de queratinocitos y cómo se ven afectados en diversas condiciones facilit...
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Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Premio de Revisión al Mérito Número I01 CX001816 de los Estados Unidos (EE. UU.) Servicio de Investigación y Desarrollo de Ciencias Clínicas (CSRD) del Departamento de Asuntos de Veteranos. El contenido no representa los puntos de vista del Departamento de Asuntos de Veteranos de EE. UU. ni del Gobierno de los Estados Unidos. Agradecemos al Dr. Michael Rosenblum por proporcionarnos acceso a su microscopio de lapso de tiempo para realizar nuestros experimentos.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placa de bloqueo de imagen de 96 pozos | Sartorio | BA-04856 | Se recomienda una microplaca compatible con la máquina si usas una placa de 96 pozos. |
| Placa de 24 pozos | Corning | 3524 | Se recomienda una microplaca compatible con la máquina si se usa una placa de 24 pozos. |
| Anfotericina B, 50 mL | Corning | 30-003-CF | Diluye a 5x (viene en 100x de serie) para 5x PSA - 1x para cambios de media |
| Epilife, 50 mL | Gibco | MEP1500CA | Añade S7, considera la primocina |
| IncuCyte S3 | Sartorio | 4637 | Imager (alternativas aceptables para Zoom/SX5) |
| Penicilina/Estreptomicina, 100 mL | Corning | 30-002-Cl | Diluir a 5x (viene en 100x de stock) |
| Primocin | Invivogen | ANT-PM-05 | 1 mL por medio de 500 mL |
| Suplemento S7 | Gibco | S0175 | Añadido a epilife |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
