Aquí, proporcionamos un método para el análisis de imágenes de células vivas que se puede utilizar para rastrear manualmente los linajes de los queratinocitos de paso 0 y que permite la recopilación de métricas de proliferación, incluido el destino de la división celular y la duración del ciclo celular.
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Artículo de método
Imágenes de células vivas con fotografía de lapso de tiempo para estudiar la cinética de proliferación de queratinocitos epidérmicos
En este artículo
Resumen
Resumen
La obtención de imágenes de células vivas es un método en evolución y algo desafiante para estudiar el comportamiento de los queratinocitos in vitro. Históricamente, el comportamiento de la división de los queratinocitos se investigó mediante métodos como el análisis clonal, la inmunotinción y el análisis del ciclo celular. Ninguno de estos métodos permite analizar el comportamiento de los queratinocitos a nivel de una sola célula en tiempo real. Durante la última década, los grupos han utilizado imágenes de células vivas para identificar células madre de queratinocitos y progenitores comprometidos sin necesidad de etiquetado. Se han identificado diferencias en el comportamiento de división, la tasa de diferenciación terminal y la duración del ciclo celular de cada grupo respectivo. En este trabajo se describe un método para la obtención de imágenes de células vivas de queratinocitos con fotografía time-lapse y su análisis. Se recomienda el uso de queratinocitos no transitados para que este método imite más de cerca el comportamiento in vivo . Las imágenes de células vivas proporcionan una capacidad única para estudiar el comportamiento de las células madre y los progenitores comprometidos a nivel de una sola célula y para determinar los destinos de la división, la duración del ciclo celular, así como otras métricas de proliferación.
Introducción
La capacidad de visualizar poblaciones de células in vitro en tiempo real a medida que se expanden durante largos períodos de tiempo es un beneficio único de las imágenes de células vivas. Las imágenes de células vivas permiten evaluar la motilidad, la migración y la proliferación de las células a nivel de una sola célula. El objetivo de este protocolo es optimizar la visualización de los cultivos de queratinocitos a través de la fotografía de lapso de tiempo, produciendo videos que luego se pueden rastrear manualmente para obtener datos granulares sobre el comportamiento celular.
Nos centramos en ....
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Protocolo
Este estudio se realizó de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Todo el tejido humano se obtuvo después de la aprobación de la junta de revisión institucional (IRB) de la Universidad de California, San Francisco (UCSF), y se obtuvo el consentimiento para todo el tejido utilizado.
1. Fotografía de lapso de tiempo de queratinocitos humanos de pasaje 0
NOTA: Este protocolo es específico para IncuCyte S3 y SX5.
- Asegurarse de que se hayan obtenido las aprobaciones apropiadas del comité de investigación en seres humanos de la institución para utilizar te....
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Resultados
Los queratinocitos primarios crecen de forma estereotipada, lo que se puede rastrear a través de imágenes de células vivas. El reproductor multimedia VLC se utiliza para inspeccionar grabaciones. El tiempo hasta la primera división es variable y puede ser de varios días dependiendo de las características del donante, como la edad, el estado de salud o los factores de crecimiento presentes en el ambiente in vitro . Tras la siembra inicial, los queratinocitos tienen un aspecto peq.......
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Discusión
La obtención de imágenes de células vivas de queratinocitos es un método sin etiquetas para rastrear el comportamiento de división de las células madre y los progenitores comprometidos. Dado que el mantenimiento de la epidermis depende de la cinética de proliferación de las células madre y de los progenitores comprometidos10, tener una comprensión granular de los cambios en estas poblaciones de queratinocitos y cómo se ven afectados en diversas condiciones facilit.......
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Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Premio de Revisión al Mérito Número I01 CX001816 de los Estados Unidos (EE. UU.) Servicio de Investigación y Desarrollo de Ciencias Clínicas (CSRD) del Departamento de Asuntos de Veteranos. El contenido no representa los puntos de vista del Departamento de Asuntos de Veteranos de EE. UU. ni del Gobierno de los Estados Unidos. Agradecemos al Dr. Michael Rosenblum por proporcionarnos acceso a su microscopio de lapso de tiempo para realizar nuestros experimentos.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placa de bloqueo de imagen de 96 pozos | Sartorio | BA-04856 | Se recomienda una microplaca compatible con la máquina si usas una placa de 96 pozos. |
| Placa de 24 pozos | Corning | 3524 | Se recomienda una microplaca compatible con la máquina si se usa una placa de 24 pozos. |
| Anfotericina B, 50 mL | Corning | 30-003-CF | Diluye a 5x (viene en 100x de serie) para 5x PSA - 1x para cambios de media |
| Epilife, 50 mL | Gibco | MEP1500CA | Añade S7, considera la primocina |
| IncuCyte S3 | Sartorio | 4637 | Imager (alternativas aceptables para Zoom/SX5) |
| Penicilina/Estreptomicina, 100 mL | Corning | 30-002-Cl | Diluir a 5x (viene en 100x de stock) |
| Primocin | Invivogen | ANT-PM-05 | 1 mL por medio de 500 mL |
| Suplemento S7 | Gibco | S0175 | Añadido a epilife |
Referencias
- Mateu, R., et al. Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro. Int J Mol Med. 38 (4), 1063-1074 (2016).
- Handl, J., Čapek, J., Majtnerová, P., Báčová, J., Roušar, T.
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Reimpresiones y permisos
