Artículo de método

Caracterización del autoensamblaje reversible dependiente del pH de coloides de oro recubiertos de beta amiloide 1-40

DOI:

10.3791/67856

⸱

21 de marzo de 2025

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, State University of New York Geneseo College

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, presentamos un método sistemático que describe el autoensamblaje cuasi-reversible de los agregados de oro de 20 nm recubiertos de beta amiloide 1-40 (Aβ 1-40). La red cuasi-reversible dependiente del tamaño nanométrico entre péptidos se correlacionó con aminoácidos específicos o secciones del monómero Aβ 1-40.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La caracterización de Aβ 1-40 recubierto sobre las superficies de las partículas coloidales de nano-oro se llevó a cabo mediante espectroscopía de resonancia de plasmón de superficie (SPR) y microscopía electrónica de transmisión (TEM). El desplazamiento observado dependiente del pH de la banda SPR de las partículas de oro de 20 nm recubiertas de Aβ 1-40 se correlacionó con la alternancia de agregación y desagregación observada en las imágenes TEM. Un pH de ~4 indujo una conformación desplegada, y un pH de ~10 indujo una conformación plegada de Aβ 1-40 en la superficie del oro. Este proceso de agregación reversible se observó mediante imágenes Raman a medida que el pH cambiaba gradualmente de pH 4 a pH 10. Observamos un cambio en la morfología dependiente del pH en Aβ 1-40 en la superficie de oro, donde se observaron agregados claros a pH 4. Sin embargo, observamos diferencias muy sutiles en el espectro de espectroscopia Raman mejorada en superficie (SERS) entre las condiciones de pH 4 y pH 10, siendo la diferencia más notable la densidad espectral en la región de 250 cm-1 y 1750 cm-1. Específicamente, el análisis modal de la agregación reversible indicó que los agregados se formaron por la conformación desplegada de Aβ 1-40 que involucró la sección del anillo de benceno de tirosina y fenilalanina. Por el contrario, el desensamblaje de los agregados se asoció con cambios conformacionales en el plegamiento de proteínas de Aβ 1-40 que involucran histidina, glutamina, metionina y ácido aspártico.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La fibrilogénesis de los péptidos beta amiloide 1-40 (Aβ 1-40) o 1-42 (Aβ 1-42) ha sido ampliamente investigada como un componente crítico en la formación de placas amiloides que son una causa de la enfermedad de Alzheimer 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. El mecanismo clave en la fibrilogénesis es una oligomerización de los péptidos Aβ 1-40 o Aβ 1-42 para formar un agregado de proteínas neurotóxicas, y se han realizado investigaciones exhaustivas para comprender los mecanismos de cómo los monómeros forman los oligómeros 12,13,14. Hemos adoptado un enfoque de examinar los péptidos amiloidogénicos que forman agregados sobre una superficie de nano-oro e identificar los factores que son responsables de la interconexión entre péptidos que están lejos de la superficie de oro 15,16,17,18,19,20,21,22.

Aβ 1-40 adopta una conformación desplegada (A) en condiciones ácidas (pH ~4) y una conformación plegada (B) en condiciones básicas (pH ~10). Observamos partículas dispersas de coloides de oro recubiertas de Aβ 1-40 a pH ~10 y grandes agregados coloidales de oro recubiertos de Aβ 1-40 a pH ~ 4 (Figura 1)23,24. La conformación desplegada de Aβ 1-40, en condiciones ácidas, favorece la interconexión de péptidos entre los monómeros de Aβ 1-40 sobre la superficie de la nanopartícula de oro, lo que resulta en la formación de agregados coloidales de oro (ver A en la Figura 1). Cuando el monómero Aβ 1-40 mantiene la conformación plegada a un pH básico o neutro, Aβ 1-40, los monómeros no se conectan en red en agregados y las nanopartículas de oro recubiertas permanecen como partículas individuales dispersas (ver B en la Figura 1). Por lo tanto, podemos interrogar el proceso de cómo los péptidos Aβ 1-40 experimentan cambios conformacionales para conectarse en red y formar agregados midiendo el cambio de banda SPR en un rango de condiciones de pH 25,26,27,28,29,30,31.

Probamos varios tamaños diferentes de nanopartículas de oro y descubrimos que el coloide de oro de 20 nm exhibía el proceso de autoensamblaje reversible más prominente de los monómeros Aβ 1-40 en respuesta a un cambio externo en el pH (Figura 2). Esta es una clara indicación de un cambio reversible en la conformación de los péptidos, donde las condiciones ácidas (A) inducen una conformación desplegada, mejorando la red y conduciendo a la agregación de coloides de oro. Se encontró que la condición básica (B) induce una conformación plegada de los monómeros 26,27,28,29,30,31.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparación de nanopartículas de oro recubiertas de Aβ 1-40

  1. Añadir un volumen de 1 mL de agua destilada desionizada a 1 mg de Aβ 1-40 liofilizado (MW: 4,2 kDa, 98% de pureza de HPLC) con una aguja de jeringa. Mezcle la solución con un mezclador de vórtice durante aproximadamente 30 s y asegúrese de que no se observen partículas sólidas en la solución a temperatura ambiente (RT; ~20 °C).
    1. Prepare todas las soluciones madre utilizando agua desionizada y destilada (~18 MΩ·cm).
    2. Identificar espectroscópicamente la concentración mediante el uso de la absorción de tirosina a 275 nm32, la cual tiene un coeficiente de extinción molecular ε275 de 1390 cm-1· M-1.
    3. Almacene soluciones madre de Aβ 1-40 a -80 °C. (Véase la Tabla de Materiales para los productos comerciales de Aβ 1-40.)
  2. Descongele la solución madre de péptidos aproximadamente 5 minutos antes de la recopilación de datos. Mezcle un volumen de 8 μL de la solución peptídica con 800 μL de partículas coloidales de oro en un tubo de centrífuga de 15 mL. Agregue un volumen de 4.2 mL de agua destilada desionizada y luego agite la muestra durante 10 s 30,31,33,34.
  3. Fije la concentración de péptidos Aβ 1-40 en 1,8 nmol y rango la proporción de péptidos Aβ 1-40. El número de coloides de oro osciló entre ~500:1 y ~2000:125.

2. Cambio iterativo de pH y monitoreo del cambio de banda SPR correspondiente

  1. Ajuste la temperatura de la solución a un valor determinado (por ejemplo, 25 °C) utilizando la unidad de control de temperatura del espectrofotómetro ultravioleta-visible-infrarrojo cercano (UV-Vis-NIR).
  2. Controle el pH inicial de la solución de muestra con un medidor de pH y ajústelo a un pH ligeramente inferior a 7. Recoge el espectro de absorción en el rango entre 400 nm y 1000 nm.
  3. Cambie el pH de la muestra a ~pH 4 (es decir, pH 4,0 ± 0,3) agregando volúmenes de 10 μL de HCl de 0,1 M y recoja el espectro de absorción entre 400 nm y 1000 nm.
  4. Cambie el pH de la muestra a ~pH 10 (es decir, pH 10 ± 0,3) agregando volúmenes de 10 μL de 0,1 M de NaOH y recoja el espectro de absorción entre 400 nm y 1000 nm.
  5. Cambie el pH entre pH 4 y pH 10 con HCl y NaOH 10 veces y recoja el espectro de absorción de forma continua a 25 ± 0,2 °C 29,30.
    NOTA: Para todas las soluciones de muestra, la densidad óptica del pico de la banda SPR se mantuvo alrededor de 0,2. Se espera un efecto tampón debido a la solución tampón residual en una solución. Por lo tanto, se determinó el valor final de pH después de que se confirmó el equilibrio. El valor de pH se midió directamente en una celda de cubeta de muestra utilizando un microelectrodo de pH, que tiene una precisión de ±0,005 pH.
  6. Obtenga el conjunto de datos del código estándar americano para el intercambio de información (ASCII) de longitudes de onda en función de la absorbancia. Extraiga la posición media de los picos de banda utilizando el programa Peak Fit .
    1. Represente el conjunto de datos para ver la densidad óptica en función de la longitud de onda (nm) mediante la función Trazar .
    2. Marque las longitudes de onda de pico iniciales λ1, λ2 y λ3 seleccionando sus posiciones aproximadas en los datos trazados y ajuste los datos utilizando la función RUN .
    3. Obtén la gráfica que contiene el pico central de cada (λi), XCi, con el área de cada banda (Ai).
  7. Exporte las posiciones y áreas de pico extraídas a un programa de hoja de cálculo y calcule la posición de pico promedio a un pH dado.
    1. Determine el factor de ponderación ai de cada centro de pico λi comparando el área de la banda (Ai) con el área total de todas las bandas como: figure-protocol-1.
    2. Extraiga la posición media del pico, figure-protocol-2 (pH) utilizando la Ec. (1).
      figure-protocol-3(1)
  8. Genere una gráfica de reversibilidad mediante el siguiente proceso:
    1. Tabular las posiciones medias de los picos, figure-protocol-4, en función de cada número de "operación", n como figure-protocol-5 vs. n. Haga que el número de operación, n, sea 1 para la muestra antes de la adición de ácido a ~pH 7. Aumente el número de operación en 1 cada vez, cambiando el pH a ~pH4 con HCl o el pH a ~pH 10 con NaOH. Haga que n sea par en una condición ácida (es decir, ~pH 4) e impar que sea una condición básica (es decir, pH 10).
    2. Analice la posición del pico en cada n, figure-protocol-6 (n) = λ(n), utilizando la fórmula30
      figure-protocol-7(2)
      NOTA: Represente una posición de pico promedio inicial en n = 1 por A. Exprese los parámetros B y C como el cambio de posición de pico dependiente de n. Haga el parámetro D como una amplitud del factor de amortiguamiento, E, de repetición. Utilice la función seno para mostrar la ondulación de la posición del pico como una función de n.
    3. Transfiera el conjunto de datos de (x, y) al software Origin y tráquelo.
    4. Forme la función personalizada dada en la Ec. (2) en la función de ajuste de curva no lineal del análisis. Escriba los valores iniciales A, B, C, D y E y haga clic en EJECUTAR para completar el ajuste.
  9. Imágenes TEM
    1. Realice las muestras TEM de los coloides de oro de 20 nm recubiertos de Aβ 1-40 con rejillas de cobre recubiertas de Formvar. Examinar las muestras con un TEM operado a 80 kV.
    2. Recopile imágenes con un aumento nominal de 28.000x o 71.000x en una cámara digital CCD (AMT) de 4 megapíxeles modelo XR-40. Recoja las imágenes TEM de oro de 20 nm recubierto de Aβ 1-40 en cada número de operación n = 1 (~pH 7), n = 2, 4, 6, 8 y 10 (pH 4) y n = 3, 5, 7 y 9 (pH 10).

3. Imágenes Raman e investigación de la agregación reversible

  1. Colocar 100 μL de solución en un disco de mica (diámetro de 1 cm) para cada muestra con el número de operación n. Seque las muestras durante la noche antes de la medición.
  2. Recopile imágenes de luz blanca en cada número de operación n. Prepare la muestra separada en un disco de mica, ya que el pH se alteró continuamente entre ~pH 4 y ~pH 10 para cada número de operación n (Figura 3).
  3. Recoja la imagen Raman en cada número de operación n con un láser de una longitud de onda de λ = 633 nm a una potencia de 0,5 ± 0,05 mW con una resolución espacial de ~0,43 μm en una cuadrícula de 100 × 100 píxeles con un tiempo de integración de 500 ms/espectro para la región entre ~200 cm-1 y ~2.800 cm-1 (Figura 4).
  4. Trace el espectro representativo para cada n alineado como una función de n y construya el espectro SERS tridimensional en función de n para Aβ1-40 recubierto de oro de 20 nm (Figura 5A). Utilice la vista superior del espectro tridimensional SERS como un mapa de contorno (Figura 5B) para extraer los modos específicos asociados con una condición de pH particular (es decir, ~pH 4 y ~pH 10). Extraiga las características espectrales mejoradas para solo npares o solo nimpares.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Con la unión de Aβ 1-40 a la superficie de las partículas nanocoloidales de oro, la banda SPR alrededor del máximo de absorción de 530 nm se desplazó significativamente hacia el rojo hasta la posición máxima de ~650 nm cuando la solución se hizo más ácida (pH 4)35. Junto con las imágenes TEM, identificamos que las características espectroscópicas observadas a pH 4 corresponden a la formación de los agregados coloidales de oro con conformación plausiblemente desplegada y en red con los monómeros Aβ 1-40 desplegados circundantes adsorbidos sobre la superficie de oro30. Observamos que los monómeros Aβ 1-40 vuelven a la conformación plegada en condiciones básicas (pH 10), lo que resulta en una deformación de los agregados de manera casi reversible. Este proceso cuasi-reversible fue evidente a partir de la alternancia del pico de banda promedio (figure-results-1(n)), que cambió entre una longitud de onda más corta y más larga, y la morfología dispersa vs. agregada en imágenes TEM entre condiciones básicas (pH = 10) y ácidas (pH = 4). Se ha observado previamente que una parte del monómero Aβ 1-40 permanece desplegada incluso después de que la solución se haya revertido a las condiciones básicas36. El video 1 muestra el cambio de color dependiente del pH del coloide de oro desnudo Aβ 1-40 y 20 nm.

A modo de comparación, se llevó a cabo la investigación del lúpulo de pH de un coloide de oro desnudo de 20 nm (Figura 5C y D). A medida que avanzaba la operación de cambio de pH, mostró el crecimiento de la agrupación de los coloides de oro en la banda SPR, imágenes TEM e imágenes de luz blanca. Curiosamente, había varias líneas espectrales SERS que dependían de npares e impares. Por ejemplo, a npar (pH ~4), se observó intensivamente la línea a 275 cm-1, que se asignó como el modo asociado con Aun (n = 5, 6, 12, 16, 20, 58)37 o el modo de Au-Cl- ligando38. Por otro lado, para npar, a 1008 cm-1 se observó C-N str39 y CH2 wag39, CH2 deformación40 se observaron ampliamente a 1291 cm-1.

En contraste con la clara morfología de agregación reversible y dependiente del pH observada por imágenes de luz blanca, hubo diferencias relativamente sutiles en las características espectrales en el espectro SERS entre npares e impares. Como primera aproximación, la densidad de líneas espectrales en la región comprendida entre 250 cm-1 y 1750 cm-1 fue mayor para n pares que para nimpares. Las líneas espectrales en la región de la huella dactilar, 1250 cm-1 y 1750 cm-1 (bandas de amida I, II y III) para nodd mostraron características espectrales menos resueltas, lo que implica un ensanchamiento o un aumento en las densidades espectrales. En la Figura 6, se organizó un mapa de contorno que se muestra en la Figura 5B (Figura 6B) con las señales SERS a 761 cm-1 (rojo) y 1395 cm-1 (azul), representando los énfasis en npares e impares, respectivamente (Figura 6C). Como espectro SERS representativo para npares e impares, el espectro SERS en n = 7 (rojo) y n = 4 (azul) se muestra en la parte superior (Figura 6A). Con el fin de mostrar la correspondencia con el cambio de banda SPR para Aβ1-40 recubierto de oro de 20 nm, el gráfico de cambio de banda en la Figura 3 se muestra en el lateral (Figura 6D).

Si bien tenemos datos preliminares sobre la asignación completa del espectro SERS observado, observamos aquí varias características notables de cambio Raman. Las líneas espectrales y (asignaciones plausibles) aumentadas en nimpares se encuentran principalmente en la región inferior a 1000 cm-1: 394 cm-1 (Trp)41,42,43, 761 cm-1 (His, Ala)39,44,45,46,47, 875 cm-1 (desplazamiento de NH indol, estiramiento C-C de Met)39, 974 cm-1 (Glu, C-COO- estiramiento del áspid, modo asociado al citrato)39,48,49. El desplazamiento Raman mejorado en nincluso mostró características espectroscópicas significativas en la región de la huella dactilar (Amida I, II y III): 1166 cm-1 (deformación N-H+ de Tyr)39,41, 1227 cm-1 (Ala-Pro-Gly, Amide III)39,50,51, 1395 cm-1 (COO- estiramiento simétrico o CH2- CH3- tijera de Glu)39,48, 1585 cm-1 (estiramiento del anillo CC de Phe, estiramiento asimétrico del carboxilato -Au, COO- estiramiento del citrato, deformación del anillo de benceno)39,41,45,46,47,49,52, 1592 cm-1 (Phe, Tyr, C=C estiramiento de Tyr, estiramiento CC del anillo en Phe, estiramiento del anillo de benceno y COO- estiramiento en Phe y Tyr, y estiramiento asimétrico de OH)39,41,48,50,51 y 1628 cm-1 (subpico de amida I distintivo para estructuras intermoleculares de β láminas53, C=O y los modos vibracionales CN/NH acoplados de la columna vertebral de la proteína que se originan en estructuras paralelas de tipo β lámina, acumulación de Aβ 54 agregado, bobinas aleatorias, β vueltas, horquillas de β48. Las secuencias que aparecen para n pares oimpares se muestran en la Figura 7. En general, para nincluso correspondiente a la agregación reversible o conformación desplegada de Aβ 1-40, el anillo que contiene benceno Phe/Tyr, el estiramiento simétrico de COO-, el modo de tijera CH2- CH3- de Glu y la deformación -NH+ de Tyr estuvieron significativamente involucrados en el cambio conformacional del péptido. Durante el desensamblaje de la agregación que se observó cuando los péptidos adoptaron la conformación plegada correspondiente a los modos prominentes en nimpar, Glu, Asp, Met, His y Ala parecieron estar involucrados.

figure-results-2
Figura 1: Absorbancia y morfología dependientes del pH. Se muestra el espectro de absorción a pH 4 (A) y pH 10 (B) para nanopartículas de oro recubiertas de Aβ 1-40 (20 nm), y las correspondientes imágenes TEM, bocetos de agregación/partículas dispersas e imágenes de soluciones en viales. A es la conformación desplegada de los monómeros Aβ 1-40 en condiciones ácidas, y B es la conformación plegada en condiciones básicas. Junto a las imágenes TEM se muestran diagramas de monómeros Aβ 1-40 en cada conformación y morfologías de agregación/dispersión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-3
Figura 2: Reversibilidad del autoensamblaje dependiente del tamaño nanométrico. El desplazamiento de la posición media del pico de la banda SPR, figure-results-4, en función del número de operación, n, para todos los tamaños probados de partículas coloidales de oro. También se dan los valores aproximados de pH y la etapa correspondiente de los agregados que se muestran en la Figura 1 . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-5
Figura 3: figure-results-6 e imágenes TEM/luz blanca en cada número de operación. El figure-results-7 número en función de la operación, n, se trazó conjuntamente para Aβ 1-40 recubierto de oro de 20 nm (círculos cerrados) y coloide de oro de 20 nm (círculos abiertos) y se muestra con imágenes representativas de TEM (A y C)/luz blanca (B y D) en números de operación seleccionados (n = 1, 2, 3, 7 y 8 marcados con flechas decodificadas) para Aβ 1-40 recubierto de oro de 20 nm (A y B) y coloide de oro de 20 nm (C y D). La fuente negra indica pH 7, la fuente azul indica pH 4 y la fuente roja indica pH 10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-8
Figura 4: Luz blanca representativa e imagen Raman. La imagen de luz blanca, la imagen Raman y el espectro SERS para (A) n = 2 y (B) n = 3; i) imagen de luz blanca en un campo de visión amplio, ii) imagen de luz blanca en el área donde se recogió la imagen Raman (etiquetada con un cuadrado rojo en i)), iii) la imagen Raman de dos componentes combinados, iv) imagen Raman del componente 1 y su v) espectro SERS de iv), vi) imagen Raman del componente 2, y vii) espectro SERS de vi). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-9
Figura 5: Mapa de contorno del espectro SERS para nimpar, npar y ntodo. (A) El mapa tridimensional del espectro SERS en la región de 250 cm-1 y 1750 cm-1 en función de n para Aβ1-40 recubierto de oro de 20 nm con un mapa de contorno que se muestra en (B) en la parte superior. (C) El mapa tridimensional del espectro SERS en la región de 250 cm-1 y 1750 cm-1 en función de n para 20 nm de oro con un mapa de contorno mostrado en (D) en la parte superior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-10
Figura 6: Mapa de contorno del espectro SERS. Mapa de contorno del espectro SERS en función de n (1-10). (A) Absorbancia a 1395 cm-1 (azul) y 761 cm-1 (rojo). (B-D) El panel inferior muestra el espectro SERS y el panel derecho muestra la amplitud del cambio de intensidad de la señal SERS en cada n. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-11
Figura 7: Secuencias notables de Aβ1-40. Las secuencias asignadas para tener una participación significativa en npar (correspondientes a la formación de la conformación plegada) se indican con flechas rojas hacia abajo, y las asignadas para tener una participación significativa en npar (correspondientes a la formación de la conformación desplegada) se indican con flechas azules. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Video 1: Cambio de color dependiente del pH de Aβ1-40 y coloide de oro desnudo de 20 nm. Haga clic aquí para descargar este video.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Una consideración crítica en los estudios de conformación de péptidos es el mantenimiento de la muestra, ya que las muestras se deteriorarán si se almacenan incorrectamente. Las muestras de péptidos se recibieron en forma liofilizada y comenzaron a desnaturalizarse una vez que se rehidrataron con agua destilada desionizada, incluso cuando se almacenaron a -80 °C. La pureza de los coloides de oro se verificó mediante análisis de control de calidad. Para mantener la estabilidad de los coloides, se almacenaron a 4 °C y no se congelaron. Las soluciones de coloide de oro se prepararon frescas para cada experimento porque la solución tampón de sales desestabilizaría el coloide de oro. Las soluciones de HCl y NaOH se prepararon frescas para cada experimento.

Los desafíos técnicos de leer y registrar manualmente el pH de la solución con instrumentos delicados mientras se cambia el pH entre 4 y 10 limitan la precisión de los resultados informados. Por lo tanto, no observamos resultados consistentes en la intensidad de las señales SERS. Es probable que esto introdujera un error en la amplitud que se utilizó para el trazado de contorno. El trabajo futuro para verificar los modos asociados con npares on pares podría introducir mutaciones para sustituir los aminoácidos en la secuencia Aβ 1-40 que informamos que están involucrados en el cambio conformacional de la proteína, como los residuos individuales de tirosina o asparagina.

"La interacción entre el monómero Aβ1-40 y la superficie de oro se considera una interacción dipolar, y el nivel de enlace de hidrógeno fue hipotetizado en el trabajo de H. Schmidbauer et al.55. En un trabajo separado, hemos investigado la espectroscopia SERS en función de la cantidad de Aβ1-40 en la condición ácida, extrajo la formación de adsorción dependiente del tamaño nanométrico56. Para el oro de 20 nm, se especuló que el enlace C=C o -C-N de la histidina (His) inició la adsorción; sin embargo, para el oro de 80 nm, un modo de respiración del anillo de benceno de fenilalanina (Phe) o tirosina (Tyr) alcanzó la superficie del oro para iniciar la adsorción. Se consideró que el proceso de adsorción de Aβ1-40 sobre la superficie de oro en condiciones neutras o básicas (pH ~ 10) mantenía el coloide de oro recubierto de Aβ1-40 como hidrófilo ya que no se formaron precipitados en la condición acuosa. Sin embargo, los precipitados se observaron a pH 4, lo que implica que los agregados eran hidrofóbicos.

Las imágenes TEM y las imágenes de luz blanca solo muestran indirectamente evidencia de la agregación. Hemos intentado realizar espectroscopía de dicroísmo circular (CD) para correlacionar la morfología observada en la agregación reversible con las estructuras secundarias. Sin embargo, las líneas de base de dispersión nos impidieron obtener señales de CD reproducibles. Por lo tanto, en su lugar, utilizamos la espectroscopia Raman, centrándonos más en los modos mejorados cuando la agregación (conformación desplegada de Aβ1-40) tuvo lugar bajo pH ~4 o cuando la desagregación (conformación desplegada de Aβ1-40) bajo pH ~10. Por lo tanto, la mejor especulación para identificar la estructura secundaria en este trabajo se limitó al monitoreo de los nodos asociados con las estructuras secundarias. Esto se demostró en la observación de la hoja de β a 1628 cm-1, particularmente en condiciones de pH 4.

Este estudio solo observó el cambio en la conformación peptídica para los coloides de oro de 20 nm de diámetro y solo investigó n hasta 10. Las propiedades de conformación y agregación del péptido Aβ 1-40 podrían verse alteradas por el tamaño de la partícula que adsorben a56. Por lo tanto, se necesita más trabajo para comprender las propiedades de los péptidos que se basan en la interconexión entre monómeros y aquellos que se ven afectados por las características físicas de la superficie de adsorción. En las condiciones que probamos, solo los coloides de oro de 20 nm de diámetro mostraron reversibilidad de la morfología de agregación, y se desconocen los mecanismos de cómo el diámetro del coloide afecta la reversibilidad de esta propiedad. El aumento de n hasta 20 podría proporcionar más información sobre el grado de reversibilidad de la morfología de la agregación dependiente del modo. Estas investigaciones sobre cómo el tamaño del coloide de oro afecta a la agregación del péptido beta amiloide aportarán información importante sobre los mecanismos moleculares de la patología de la enfermedad de Alzheimer.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses con este trabajo para divulgar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

K.Y. cuenta con el apoyo de la subvención NSF-MRI #2117780. La Fundación Geneseo apoyó la etapa inicial de este proyecto. A. I. agradece a la Beca de Investigación de Verano para Ex Alumnos del Departamento de Química de SUNY Geneseo (Premio Rhodes '19 y Premio Lipkowitz '20) y a la Beca de Investigación de Verano para Pregrado de la Fundación Dreyfus por su apoyo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Péptido beta amiloide 1-40 (A y beta; 1– 40 péptido)r-Péptido (Bogart, GA, EE. UU.)A-1156-2
Cámara digitalCCD AMTXR-40 4 megapíxeles CCD 
Agua destilada desionizada del sistema de agua Milli-QMillipore Sigma (Burlington, MA, EE. UU.)Milli-Q IQ 7000
Freezer -86 oCThermo ScientificRevco Chilly Willy  ID de unidad de la serie RLE 187004 Número de compilación 40.04
Coloide de oro (10 nm)Ted Pella, Inc. (Redding, California, EE. UU.)15703-20
Coloide de oro (100 nm)Ted Pella, Inc. (Redding, California, EE. UU.)15711-22
Coloide de oro (15 nm)Ted Pella, Inc. (Redding, California, EE. UU.)15704-20
Coloide de oro (20 nm)Ted Pella, Inc. (Redding, California, EE. UU.)15705-20
Coloide de oro (30 nm)Ted Pella, Inc. (Redding, California, EE. UU.)15706-21
Coloide de oro (40 nm)Ted Pella, Inc. (Redding, California, EE. UU.)15707-21
Coloide de oro (50 nm)Ted Pella, Inc. (Redding, California, EE. UU.)15708-21
Coloide de oro (60 nm)Ted Pella, Inc. (Redding, California, EE. UU.)15709-22
Coloide de oro (80 nm)Ted Pella, Inc. (Redding, California, EE. UU.)15710-22
Discos de mica V1AFM de mayor grado 10 mmTed Pella Inc.#50
Solución estándar de ácido clorhídrico, loteFlukaN# SHBB4705V        318949-2L
Macro cuarzo quvette Light Path 10 mmFire Fly Science Tipo1-MC-PathMicro
HORIBAModelo 9618S (MFG No. 9Y8E0050)
Programa Peak FitOrigin (Northampton, MA, EE. UU.)OrigenPro2018b (64 bits) b9.5.5.409 (Académico)
pH 4.00 Solución tampón VWRCat No. 34170-127
pH 7.00 Solución tampón Fisher ChemicalSB107-4 Lote 191041
medidor de pHHORIBAModelo F-72G (MFG No. B27M0017)
Puntas de pipeta   Maxi Puntas 1– 5mL Fisher   02-707-467
Puntas de pipeta 10 mLFisher02-717-135
Puntas de pipeta 1000mL Fisher02-717-156
Puntas de pipeta 1– 200 mLFisher02-717-143
Pipeta Fisher Brand Elite 0.5– 5 mLPipeta FisherQU05317
Fisher Brand Elite 100– 1000 mLPipeta FisherQU01672
Fisher Brand Elite 10– 100 mLPipeta FisherMU10985
Fisher Brand Elite 1– 10 mLFisherMU08178
Solución de Hidróxido de Sodio 1.0 MFlukaLote#05096BPV    319511-2L
TEMFEI CoMorgagni modelo 268 
TempAssure Tubos de PCR, tapones planos, naturales científico de EE. UU. Tubos individuales de pared delgada de 0,2 mL con tapas planas esmeriladas adjuntas
Espectrofotómetro UV-Vis-NIRVarian CARY5000 UV1106M074
WI Tec alpha300R Microscopio Raman ConfocalWITec-Oxford InstrumentXMB3000-3001
1.0 electrodo de pH de 10 mm de Polipropileno

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kirschner, D. A., et al. Synthetic peptide homologous to beta protein from Alzheimer disease forms amyloid-like fibrils in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (19), 6953-6957 (1987).
  2. Lomakin, A., Chung, D. S., Benedek, G. B., Kirshner, D. A., Teplow, D. B. On the nucleation and growth of amyloid -protein fibrils: detection of nuclei and quantitation of rate constants. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (3), 1125-1129 (1996).
  3. Walsh, D. M., Lomakin, A., Benedek, G. B., Condron, M. M., Teplow, D. B. Amyloid -protein fibrillogenesis. J Biolog Chem. 272 (3), 22364-22372 (1997).
  4. Lambert, M. P., et al. nonfibrillar ligands derived from Ab1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (11), 6448-6453 (1998).
  5. Bucciantini, M., et al. Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases. Nature. 416 (6880), 507-511 (2002).
  6. Walsh, D. M., et al. Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature. 416 (6880), 535-539 (2002).
  7. Rocha, S., et al. Adsorption of amyloid beta-peptide at polymer surfaces: A neutron reflectivity study. ChemPhysChem. 6 (12), 2527-2534 (2005).
  8. Attanasio, F., et al. Carnosine inhibits Ab1-42 aggregation by perturbing the H-bond network in and around the central hydrophobic cluster. ChemBioChem. 14 (5), 583-592 (2013).
  9. Politi, J., Spadavecchia, J., Iodice, M., de Stefano, L. Oligopeptide-heavy metal interaction monitoring by hybrid gold nanoparticle based assay. Analyst. 140 (1), 149-155 (2015).
  10. Moshe, A., Landau, M., Eisenberg, D. Preparation of Crystalline samples of amyloid fibrils and oligomers. Methods Mol Biol. 1345, 201-210 (2016).
  11. Scarff, C. A., Ashcroft, A. E., Radford, S. E. Characterization of amyloid oligomers by electrospray ionization-ion mobility spectrometry-mass spectrometry (ESI-IMS-MS). Methods Mol Biol. 1345, 115-132 (2016).
  12. Sabaté, R., Gallardo, M., Estelrich, J. Temperature dependence of the nucleation constant rate in β amyloid fibrillogenesis. Int J Biol Macromol. 35 (1-2), 9-13 (2005).
  13. Niraula, T. N., et al. Pressure-dissociable reversible assembly of intrinsically denatured lysozyme is a precursor for amyloid fibrils. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (12), 4089-4093 (2004).
  14. Miller, A. E., et al. Behavior of β-Amyloid 1-16 at the air-water interface at varying pH by nonlinear spectroscopy and molecular dynamics simulations. J Phys Chem A. 115 (23), 5873-5880 (2011).
  15. Majzika, A., et al. Functionalization of gold nanoparticles with amino acid, -amyloid peptides and fragment. Colloids Surf B Biointerfaces. 81 (1), 235-241 (2010).
  16. Liu, L., et al. Electrochemical detectionof β-amyloid peptides on electrode covered with N-terminus-specific antibody based on electrocatalytic O2 reduction by Aβ(1-16)-heme-modified gold nanoparticles. Biosens Bioelectron. 49, 231-235 (2013).
  17. Elbassal, E. A., et al. Gold Nanoparticles as a Probe for Amyloid-β Oligomer and Amyloid Formation. J Phys Chem C Nanomater Interfaces. 121 (36), 20007-20015 (2017).
  18. Olmedo, I., et al. How changes in the sequence of the peptide CLPFFD-NH2 can modify the conjugation and stability of gold nanoparticles and their affinity for beta-amyloid fibrils. Bioconjug Chem. 19 (16), 1154-1163 (2008).
  19. Xu, Y., et al. Attenuation of the aggregation and neurotoxicity of amyloid peptides with neurotransmitter-functionalized ultra-small-sized gold nanoparticles. Eng Sci. 6, 53-63 (2019).
  20. John, T., Gladytz, A. K., Martin Clemens, L. L., Risselada, H. J., Abel, B. Impact of nanoparticles on amyloid peptide and protein aggregation: A review with a focus on gold nanoparticles. Nanoscale. 45, 20894-20913 (2018).
  21. Li, J., et al. Reduced aggregation and cytotoxicity of amyloid peptides by graphene oxide/gold nanocomposites prepared by pulsed laser ablation in water. Small. 10 (21), 4386-4394 (2014).
  22. Araya, E., et al. Gold nanoparticles and microwave irradiation Inhibit beta-amyloid amyloidogenesis. Nanoscale Res Lett. 3, 435(2008).
  23. Barrow, C. J., Yasuda, A., Kenny, P. T., Zagorski, M. G. Solution conformations and aggregational properties of synthetic amyloid beta-peptides of Alzheimer's disease. Analysis of circular dichroism spectra. J Mol Biol. 225 (4), 1075-1093 (1992).
  24. Wood, S. J., MacKenzie, L., Maleeff, B., Hurle, M. R., Wetzel, R. Selective inhibition of Ab fibril formation. J Biolog Chem. 271 (8), 4086-4092 (1996).
  25. Yokoyama, K. Nanoscale Surface Size Dependence in Protein Conjugation. Advances in Nanotechnology. , Nova Science Publishers. New York, NY. (2010).
  26. Yokoyama, K. Nanoscale Protein Conjugation. Advances in Nanotechnology. , Nova Science Publishers. New York, NY. (2010).
  27. Yokoyama, K. Modeling of Reversible Protein Conjugation on Nanoscale Surface in Computational Nanotechnology: Modeling and Applications with MATLAB. , CRC Press. Boca Raton. (2011).
  28. Yokoyama, K. Nano Size Dependent Properties of Colloidal Surfaces. Colloids: Classification, Properties and Applications. , Nova Science Publishers. New York, NY. (2012).
  29. Yokoyama, K. Controlling Reversible Self-Assembly Path of Amyloid Beta Peptide over Gold Colloidal Nanoparticle's Surface. Nanoscale Spectroscopy with Applications. , CRC Press, Taylor and Francis Group, LLC. (2013).
  30. Yokoyama, K., et al. Nanoscale size dependence in the conjugation of amyloid beta and ovalbumin proteins on the surface of gold colloidal particles. Nanotechnology. 19, 375101(2008).
  31. Yokoyama, K., Welchons, D. R. The conjugation of amyloid beta protein on the gold colloidal nanoparticles' surfaces. Nanotechnology. 18, 105101(2007).
  32. Edelhoch, H. Spectroscopic determination of tryptophan and tyrosine in proteins. Biochemistry. 6 (7), 1948-1954 (1967).
  33. Yokoyama, K., et al. Examination of adsorption orientation of amyloidogenic peptides over nano-gold colloidal particles surfaces. Int J Mol Sci. 20 (21), 5354-5380 (2019).
  34. Yokoyama, K., Ichiki, A. Oligomerization and Adsorption Orientation of Amyloidogenic Peptides over Nano-Gold Colloidal Particle Surfaces. Advances in Chemistry Research. , NOVA Science Publishers. New York, NY. (2020).
  35. Fan, X., Zheng, W., Singh, D. J. Light scattering and surface plasmons on small spherical particles. Light Sci Appl. 3, e179(2014).
  36. Yokoyama, K., et al. Microscopic investigation of reversible nanoscale surface size dependent protein conjugation. Int J Mol Sci. 10 (5), 2348-2366 (2009).
  37. Vishwanathan, K. Symmetry of gold neutral clusters Au3-20 and normal modes of vibrations by using the numerical finite difference method with density-functional tight-binding (DFTB) approach. Arch Chem Res. 2 (1), 4(2017).
  38. Gao, P., Weaver, M. J. Metal-adsorbate vibrational frequencies as a probe of surface bonding: halides and pseudohalides at gold electrodes. J Phys Chem. 90, 4057-4063 (1986).
  39. Stewart, S., Fredericks, P. M. Surface-enhanced raman spectroscopy of peptides and proteins adsorbed on an electrochemically prepared silver surface. Spectrochim Acta AMol Biomol Spectrosc. 55 (7-8), 1615-1640 (1999).
  40. Palings, I., et al. Assignment of fingerprint vibrations in the resonance Raman spectra of rhodopsin, isorhodopsin, and bathorhodopsin: Implications for chromophore structure and environment. Biochem. 26 (9), 2544-2556 (1987).
  41. Szekeres, G. P., Kneipp, J. SERS probing of proteins in gold nanoparticle agglomerates. Front Chem. 7, 30(2019).
  42. Lin, V. J. C., Koenig, J. L. Raman studies of bovine serum albumin. Biopolymers. 15 (1), 203-218 (1976).
  43. Hornemann, A., Drescher, D., Flemig, S., Kneipp, J. Intracellular SERS hybrid probes using BSA-reporter conjugates. Anal Bioanal Chem. 405 (19), 6209-6222 (2013).
  44. Dong, J., et al. Metal binding and oxidation of amyloid-beta within isolated senile plaque cores: Raman microscopic evidence. Biochemistry. 42 (10), 2768-2773 (2003).
  45. Carey, P. R. Biochemical Applications of Raman and Resonance Raman Spectroscopies. , Academic Press. New York, NY. (1982).
  46. Harada, I., Takeuchi, H. Raman and Ultraviolet Resonance Raman Spectra of Proteins and Related Compounds. Spectroscopy of Biological Systems : Advances in Infrared and Raman Spectroscopy. , Wiley. Chichester, UK. (1986).
  47. Overman, S. A., Thomas, G. J. Jr Raman markers of nonaromatic side chains in an α-helix assembly: Ala, Asp, GGly, Ile, Leu, Lys, Ser, and Val residues of phage fd subunits. Biochemistry. 38 (13), 4018-4027 (1999).
  48. Talaga, D., et al. Total internal reflection tip-enhanced Raman spectroscopy of tau fibrils. J Phys Chem B. 126 (27), 5024-5032 (2022).
  49. Grys, D. -B., et al. Citrate coordination and bridging of gold nanoparticles: The role of gold adatoms in AuNP aging. ACS Nano. 14 (7), 8689-8696 (2020).
  50. Guo, T., et al. Full-scale label-free surface-enhanced Raman scattering analysis of mouse brain using a black phosphorus-based two-dimensional nanoprobe. Appl Sci. 9 (3), 398-408 (2019).
  51. Walther, M., Plochocka, P., Fischer, B., Helm, H., Uhd Jepsen, P. Collective vibrational modes in biological molecules investigated by Terahertz time-domain spectroscopy. Biopolymers. 67 (4-5), 310-313 (2002).
  52. Lochocki, B., et al. label-free fluorescence and Raman imaging of amyloid deposits in snap-frozen Alzheimer's disease human brain tissue. Commun Biol. 4 (1), 474-486 (2021).
  53. Palombo, F., et al. Detection of Aβ plaque-associated astrogliosis in Alzheimer's disease brain by spectroscopic imaging and immunohistochemistry. Analyst. 143 (4), 850-857 (2018).
  54. Khoury, Y. E., et al. Raman imaging reveals accumulation of hemoproteins in plaques from Alzheimer's diseased tissues. ACS Chem Neurosci. 12 (15), 2940-2945 (2021).
  55. Schmidbaur, H., Raubenheimer, H. G., Dobrzańska, L. The gold-hydrogen bond, Au-H, and the hydrogen bond to gold Au∙∙∙H-X. Chem Soc Rev. 43 (1), 345-380 (2014).
  56. Yokoyama, K., et al. Protein corona formation and aggregation process of amyloid beta 1-40 coated gold nano-colloids. Langmuir. 40 (3), 1728-1746 (2024).

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Reversible AggregationPH Dependent Self AssemblySurface Plasmon ResonanceTransmission Electron MicroscopySurface Enhanced Raman SpectroscopyProtein FoldingColloidal AggregationPeptide Conformation

Artículos relacionados