Análisis de subpoblaciones de plaquetas mediante citometría de flujo multicolor

Resumen

La citometría de flujo multicolor para plaquetas puede identificar nuevos subtipos de plaquetas dentro de las subpoblaciones de plaquetas clásicas, como las plaquetas en reposo, agregativas, procoagulantes y apoptóticas. Esto permite la comparación de diferentes patrones de subpoblación inducidos por varios agonistas plaquetarios. Aquí, se describe en detalle un procedimiento para establecer un panel de citometría de flujo multicolor.

Resumen

Las plaquetas, o trombocitos, son pequeñas células sanguíneas anucleadas que desempeñan un papel crucial en la hemostasia y la trombosis. Los defectos en las funciones plaquetarias pueden causar hemorragias o eventos trombóticos en pacientes con enfermedades cardiovasculares. Por lo tanto, es importante caracterizar las plaquetas fenotípicamente para poder asignar subpoblaciones plaquetarias a la función plaquetaria. La estimulación de las plaquetas humanas con agonistas y activadores plaquetarios induce cambios morfológicos y fisiológicos en las plaquetas, acompañados de cambios en la población de receptores de superficie. Esto conduce a subpoblaciones plaquetarias funcionalmente diversas. Las subpoblaciones plaquetarias clásicamente definidas son las plaquetas en reposo, agregativas, procoagulantes y apoptóticas. Para caracterizar el efecto de los agonistas sobre los subtipos plaquetarios, establecimos un ensayo mediante citometría de flujo multicolor compuesto por 10 anticuerpos y colorantes diferentes (anti-CD62P, anti-CD63, anti-CD61, anti-CD41, anti-CD42b, anti-Integrina_αIIbβ3 (clon: PAC-1), anti-CXCR4, anti-ACKR3, Anexina V, Zombie NIR). Las plaquetas humanas aisladas se incubaron con agonistas plaquetarios y se tiñeron con anticuerpos y colorantes específicos conjugados con fluoróforos. Posteriormente, se midieron mediante citometría de flujo. Esto nos permite definir subtipos específicos de agonistas dentro de las cuatro subpoblaciones clásicas. En conclusión, la combinación de marcadores de activación (anti-CD62P, anti-CD63, anti-Integrina_αIIbβ3 (clon: PAC-1)), marcadores inflamatorios (anti-CXCR4, anti-ACKR3) y marcadores apoptóticos (Anexina V, Zombie NIR) que componen el panel de citometría de flujo de 10 colores descrito en este manuscrito abre la posibilidad de definir otros subtipos plaquetarios que podrían relacionarse con una función plaquetaria específica. Este método se puede aplicar en la investigación básica sobre la función y fisiología de las plaquetas, así como en la definición de nuevos subtipos de plaquetas en modelos de enfermedades y estudios de pacientes.

Introducción

Los trombocitos, también llamados plaquetas, son pequeñas células sanguíneas sin núcleo esenciales para la hemostasia y el desarrollo de la trombosis ^1,2. Pueden ser activados por varios agonistas plaquetarios. Los agonistas plaquetarios fisiológicos clásicos son el difosfato de adenosina (ADP), que se une a los receptores P2Y12 y P2Y1, la trombina que activa las plaquetas a través de los receptores PAR1 y PAR4, y el colágeno que interactúa con la glicoproteína VI. El colágeno puede ser sustituido en experimentos in vitro por el péptido relacionado con el colágeno (CRP-XL)^3,4. Recientemente, se ha demostrado que la hemina induce la activación plaquetaria mediante la interacción del receptor similar a la lectina tipo C (CLEC-2) y la glicoproteína VI (GPVI), estableciendo a la hemina como un nuevo activador/agonista plaquetario endógeno ^5,6. Varias situaciones patológicas pueden conducir a la hemólisis, lo que resulta en la liberación de hemina libre que contiene hierro férrico. Todos estos agonistas plaquetarios alteran la expresión del receptor de superficie en las plaquetas. La alteración de los receptores de superficie y de la membrana plasmática depende de la fuerza y concentración del agonista plaquetario ^7,8,9. Por lo tanto, es importante caracterizar fenotípicamente las plaquetas para poder asignar subpoblaciones plaquetarias a la función plaquetaria.

Los métodos de alta dimensión, como la citometría de flujo, han revelado que las plaquetas forman subpoblaciones con funciones distintas. Las subpoblaciones se pueden clasificar mediante diferentes marcadores de superficie. En la literatura, es bien sabido que están presentes dos subpoblaciones plaquetarias distintas: el procoagulante, que se caracteriza por la externalización de la fosfatidilserina, y el fenotipo agregante que activa la integrina_{α IIIb}β_3. Además de los marcadores de activación clásicos, los colorantes de fluorescencia como el glutatión-S-ariloóxido (GSAO) que detecta la función mitocondrial y el estrés oxidativo se pueden utilizar para una categorización adicional, por ejemplo, las plaquetas procoagulantes por su estado metabólico¹⁰. Esto permite distinguir entre el globo y el fenotipo plaquetario procoagulante¹¹ de la formación de poros de transición de permeabilidad mitocondrial (MPTP).

Heemskerk et al. han demostrado, mediante el análisis de la exposición a fosfatidilserina (PS) y la actividad de la integrina_{α IIb}β₃, que diferentes poblaciones de plaquetas pueden controlar distintos pasos de coagulación y que se requieren activadores fuertes como la trombina y el colágeno para la exposición a la fosfatidilserina¹². Además, la activación de las plaquetas por GPVI con colágeno o el agonista específico de GPVI convulxina es la principal responsable de la formación de plaquetas procoagulantes adherentes. Asimismo, el ácido araquidónico, que conduce a la activación plaquetaria mediante la producción de tromboxano A2 por ciclooxigenasa, induce la exposición a PS¹³. Sin embargo, el ácido araquidónico es, en comparación con la trombina o el colágeno, un activador plaquetario débil¹⁴. Van Velzen et al. también evaluaron antígenos de superficie plaquetaria (CD42a/b, CD36, CD41, CD61) y marcadores de activación (PAC-1, CD63, CD62P) en dos mediciones separadas¹⁵. Además, van Velzen et al. pudieron analizar la sangre de pacientes con trombastenia y compararon las subpoblaciones entre pacientes sanos y enfermos. Hindle et al. midieron la influencia de la prostaciclina en las subpoblaciones plaquetarias después del tratamiento con trombina y PCR-XL con dos paneles individuales formados por cuatro marcadores cada uno (PAC-1, Anexina V, CD62P, CD42b o CDCD154, CD62P, CD63, CD42b)¹⁶. Recientemente, la citometría de flujo multicolor se ha utilizado para definir subpoblaciones plaquetarias procoagulantes (CD42b⁺, PAC1^-, CD62P^-, Anexina V^-), agregatorias (CD42b⁺, PAC1⁺, CD62P⁺, Anexina V^-) procoagulantes (CD42b⁺, PAC1^-, CD62P⁺, Anexina V⁺) y apoptóticas (Cd42b^-, PAC1^-, CD62P^-, Anexina V⁺) ^7,17. Laspa et al. ampliaron/refinaron el enfoque de citometría de flujo multicolor mediante la adición de anticuerpos contra los receptores de quimiocinas CXCR4 y ACKR3¹⁸. Con base en la literatura disponible, este es el primer panel de citómetro de flujo de 10 colores para plaquetas humanas aisladas que permite la detección de 10 antígenos diferentes en una plaqueta individual (a nivel de una sola célula) dentro de una población de plaquetas humanas aisladas en un tubo. Por lo tanto, es posible medir simultáneamente el potencial de activación, adhesión y agregación, los receptores de quimiocinas y el potencial apoptótico de una sola célula para distinguir aún más la subpoblación existente. Así, complementa a Johnson et al., quienes definieron las cuatro subpoblaciones principales con cuatro marcadores (reposo, procoagulante, agregativo, apoptótico)¹⁷. Por lo tanto, el establecimiento de un ensayo de citometría de flujo multicolor permite la comparación de diferentes agonistas plaquetarios en cuanto a su patrón de activación y la formación de subtipos de plaquetas dentro de las subpoblaciones de plaquetas clásicas.

El método se puede utilizar para la investigación básica relacionada con el análisis de la función y la fisiología de las plaquetas. Además, el ensayo de citometría de flujo multicolor establecido para plaquetas humanas se puede realizar con plaquetas obtenidas en estudios de pacientes, por ejemplo, en la investigación de enfermedades cardiovasculares y eventos trombóticos, para decodificar las subpoblaciones de plaquetas inducidas por estas enfermedades y los efectos de los tratamientos sobre estos fenotipos inducidos. Por ejemplo, Mueller et al. han demostrado que las subpoblaciones plaquetarias pueden diferir en los pacientes con estenosis aórtica¹⁹. Los conocimientos adquiridos podrían ofrecer nuevas oportunidades para las intervenciones farmacéuticas.

Protocolo

La recolección y manipulación de sangre con fines de investigación fueron aprobadas por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad Eberhard Karls y el Hospital Universitario de Tübingen (voto de ética 238/2018B02), y las metodologías de estudio se ajustaron a los estándares establecidos por la Declaración de Helsinki. Los donantes sanos dieron su consentimiento informado por escrito para la extracción de sangre. Las características basales de los donantes sanos se enumeran en la Tabla 1. La Figura 1 ofrece una descripción general del protocolo de citometría de flujo.

1. Aislamiento de plaquetas humanas a partir de sangre entera

NOTA: Se siguieron las directrices de la ISTH en cuanto a la toma de muestras, torniquetes y elección del anticoagulante para garantizar la estandarización del aislamiento de las plaquetas²⁰.

1. Preparación del tampón
   1. Tampón anticoagulante ácido-citrato-dextrosa (ACD): Disuelva 12,50 g de Na_3-Citrat (85 mM C₆H₅Na₃O₇ x 2 H₂O), 6,82 g de ácido citrato (71 mM) y 10,00 g de glucosa (111 mM) en 475 mL de aqua destillata. Ajuste el pH con NaOH 1 M a 4,69. Llena hasta 500 mL con aqua destillata. A continuación, filtre, esterilice el tampón y guárdelo a 4 °C hasta su uso.
      NOTA: Todas las soluciones se esterilizan por filtro con un sistema de filtro accionado por vacío, que utiliza una membrana de poliéter sulfona de flujo rápido de 0,22 μm de tamaño de poro.
   2. Tampón Tyrode (10x): Pesar 80,00 g de NaCl, 10,15 g de NaHCO₃ y 1,95 g de KCl y añadir aqua destillata a 1 L. Filtrar esterilizar el tampón y almacenar a 4 °C hasta su uso.
   3. Tampón Tyrode's-HEPES (1x; 137 mM de NaCl, 2,8 mM de KCl, 12 mM de NaHCO₃, 5 mM de glucosa, 10 mM de HEPES): Mezclar 10 mL de tampón Tyrode 10x y 90 mL de aqua destillata. Disuelva 0,1 g de glucosa y 0,1 g de albúmina sérica bovina (BSA). Ajuste el pH con ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanosulfónico (HEPES) a 7,4. Ajuste 10 mL de tampón de Tyrode a pH 7.4 y ajuste el pH de los 90 mL residuales de Tyrode a 7.4 con 1 N HCl a pH 6.5.
      NOTA: BSA podría eliminar algunos productos químicos, como la hemina. En este caso, es importante preparar el búfer de Tyrode 1x sin BSA. Se debe permitir que todos los tampones se calienten a temperatura ambiente o 37 °C antes de su uso.
2. Recolección de muestras de sangre
   1. Prepare para cada donante una jeringa de 10 mL con 2 mL de anticoagulante ACD y deje que se adapte a temperatura ambiente o 37 °C usando una incubadora. Mantener el factor de dilución de 1:5 (ACD: sangre).
      NOTA: Use jeringas más pequeñas o más grandes para extraer muestras de sangre. El tampón ACD frío podría preactivar las plaquetas y perjudicar sus resultados.
   2. Utilice una aguja de mariposa (21 G) para recoger lentamente la sangre del donante en las jeringas ACD precalentadas. Abra la manguera del torniquete antes de llenar la jeringa para evitar la preactivación.
      NOTA: Las jeringas con una aguja de mayor calibre pueden minimizar la activación de las plaquetas inducida por el cizallamiento.
   3. Transfiera lentamente la sangre de ACD a un tubo de reacción de 15 mL. Utilice la sangre inmediatamente para evitar la preactivación de las plaquetas.
3. Aislamiento plaquetario
   1. Centrifugar la sangre ACD durante 20 min a 209 x g (temperatura ambiente, RT) sin frenos. Prepare 25 mL de tampón Tyrode's-HEPES pH 6.5 en un tubo de reacción de 50 mL.
   2. Transfiera suavemente el plasma rico en plaquetas resultante (PRP, capa superior) al tubo de reacción de 50 ml que contiene tampón Tyrode's-HEPES, pH 6,5.
   3. Deje aproximadamente 1 mL de PRP por encima de la capa leucocitaria y los eritrocitos para evitar la contaminación con otras células sanguíneas.
   4. Centrifugar la suspensión a 430 x g durante 10 min a RT para pellets las plaquetas. Vuelva a suspender con cuidado el pellet resultante en 200-300 μL de tampón Tyrode, pH 7,4.
   5. Use un contador de células para determinar el recuento de plaquetas. Ajuste el recuento de plaquetas con el tampón Tyrode-HEPES-pH 7,4 a 200 x 10³ plaquetas/μL. Consulte el paso 3 para obtener más información sobre el tratamiento de la tinción de plaquetas.

2. Selección y valoración de anticuerpos para citometría de flujo

1. Selección de anticuerpos y colorantes
   1. Seleccione los anticuerpos y colorantes con fluoróforos adecuados para el citómetro de flujo²¹. Tenga en cuenta la configuración del filtro recomendada por el fabricante del citómetro de flujo. En la Tabla 2 y la Figura 2 se da un ejemplo de marcadores de plaquetas y configuración de fluoróforos para el siguiente citómetro: BD LSR Fortessa con configuración láser: violeta (402 nm), azul (488 nm), amarillo/verde (561 nm), rojo (640 nm).
      NOTA: Utilice fluorocromos más brillantes para los antígenos de menor expresión. Por ejemplo, los fluorocromos brillantes BV412 y BV650 se utilizaron para los receptores de quimiocinas débilmente expresados (ACKR3 y CXCR4)22,23,24.
2. Titulación de anticuerpos y colorantes
   1. Valore los anticuerpos para encontrar la concentración de trabajo correcta. Para la titulación, utilice plaquetas humanas aisladas del paso 1 y una serie de concentraciones del anticuerpo.
      NOTA: Las concentraciones de trabajo dadas por el fabricante son generalmente un buen punto de partida para la serie de concentraciones.
      1. Si trabaja con antígenos que solo se expresan con tratamiento, active las plaquetas antes de la tinción para asegurarse de que las células negativas y positivas también se puedan detectar. Por ejemplo, PAC-1 se une solo a la integrina activada α_IIbβ₃. Por lo tanto, active fuertemente las plaquetas para obtener una señal brillante y positiva, por ejemplo, con 10 μg/mL de péptido relacionado con el colágeno (PCR; ver Figura 3).
3. Valoración de las muestras
   1. Aísle las plaquetas humanas como en el paso 1 y ajuste el recuento de plaquetas a 1 x 10⁶ plaquetas por muestra.
      1. Para los receptores que no necesitan activación antes de la tinción: CD61, CD42b, CD41, CXCR7, CXCR4, use una muestra sin tinción y una muestra teñida por anticuerpo. En el caso de los receptores/marcadores que deban activarse, por ejemplo, con 10 μg/mL de CRP-XL antes de la tinción: PAC1, CD63, CD62P, Anexina V, Zombie NIR, utilizar una muestra activada y otra no activada 15,25,26.
   2. Activar las plaquetas (1 x 10,⁶ plaquetas por muestra) si es necesario durante 30 min con 10 μg/mL CRP-XL. A continuación, incubar las plaquetas aisladas (1 x 10⁶ plaquetas por muestra) durante 30 min con diferentes concentraciones del anticuerpo o colorante conjugado con fluorocromo y añadir 300 μL de tampón de unión a anexina 1x para diluir la muestra (en la Tabla 3 se dan ejemplos de concentraciones).
   3. Mida 10.000 eventos para cada muestra.
   4. Calcule el índice de tinción que muestra la separación óptima de las poblaciones positivas y negativas para cada anticuerpo, como se muestra en la Figura complementaria 1.
   5. Traza el índice de tinción para cada concentración de anticuerpo para encontrar la concentración óptima.

3. Tinción para citometría de flujo

NOTA: En la Tabla 4 se muestra un ejemplo de tinción con cuatro activadores plaquetarios diferentes (CRP-XL, ADP, trombina, hemina).

1. Hemin necesita ser preparado fresco. Disuelva el polvo en NaOH 1,4 M hasta obtener una solución de 3 M y caliéntelo a 96 °C durante 5 min a 450 rpm. A continuación, diluirlo con H₂O destilado hasta obtener una solución madre de 3 mM.
2. Después de ajustar el recuento de plaquetas (por muestra: 1 x 10⁶ plaquetas), active las plaquetas en un tubo con los activadores de plaquetas durante 30 min en RT como se indica en la Tabla 4.
3. Añadir 43,3 μL de cóctel de anticuerpos a las muestras e incubar las plaquetas durante 30 min a RT en la oscuridad.
4. Después de la incubación, diluir las muestras con 300 μL de tampón de unión a anexina 1x (10 mM HEPES/NaOH, pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl₂) para que la proteína anexina V pueda unirse a la fosfatidilserina en el lado externo de la membrana celular. Mida las muestras inmediatamente.
   NOTA: Mida las muestras inmediatamente después de la preparación. Como las muestras no son fijas, retrasar la preparación y medición de las muestras puede aumentar la variabilidad de los resultados. La fijación perjudica la unión de la anexina V.

4. Configuración de compensación y medición de fluorescencia menos un control (FMO)

NOTA: Antes de grabar datos, ejecute una configuración de compensación. Un citómetro de flujo calcula automáticamente los ajustes de compensación; Consulte los manuales habituales del citómetro de flujo para conocer el procedimiento de compensación en particular. No obstante, utilice controles de compensación con celdas o con cuentas.

1. Configuración de la compensación
   1. Para la compensación con perlas, prepare 150 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) para cada fluoróforo con una gota de perlas y 1 μL del anticuerpo conjugado con fluorescencia.
   2. Monitoree la reactividad de las cuentas de la especie. Utilice IgGκ anti-ratón y el control negativo de micropartículas de poliestireno. Para compensar la anexina V, marque las perlas de PE/Cy7 con el anticuerpo PE/Cy7 anti-CD62L humano que conjuga el mismo fluoróforo que la anexina V.
   3. Use perlas de compensación reactivas a la amina para el tinte reactivo a la aminas. Utilice dos gotas de perlas positivas y una gota de negativo en 150 μL de PBS con 1 μL del tinte. Compruebe que las perlas de compensación reactivas a las aminas reaccionan con el tinte y muestran una señal positiva. Compruebe que las perlas negativas no reaccionan con el colorante reactivo a la amina y presentan una señal negativa.
      NOTA: Para Zombie NIR APC-Cy7, use perlas reactivas de amina negativas y positivas.
   4. Incubar las muestras de compensación durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
   5. Ejecute cada tubo de compensación por separado y compuerta en la población de cordones singlete según FSC y SSC. La población de cuentas aparece como una pequeña población concentrada. Dibuja una puerta alrededor de esta población.
   6. Visualice los histogramas de cada tubo de compensación y ajuste los valores de compensación hasta que los picos positivos de los diferentes anticuerpos y colorantes no se superpongan. A continuación, mida cada uno de los tubos de compensación y deje que el derrame de los fluoróforos se calcule según el SOP del fabricante.
   7. Proceda con la adquisición del experimento de tinción real con las plaquetas humanas aisladas (consulte el paso 3 y la Tabla 4). Ajuste el voltaje SSC/FSC antes de la medición para encontrar la población de plaquetas. Dado que CD61 se expresa de forma ubicua en las plaquetas, compruebe con este umbral de fluorescencia si se pueden detectar todos los tamaños de las plaquetas.
   8. A continuación, mida 20.000 eventos por muestra.
2. Medición de FMO
   1. Prepare para cada marcador un control FMO según la Tabla 5. Para poder determinar los solapamientos de todos los marcadores, prepare muestras estimuladas y no estimuladas.

5. Análisis de datos

1. Análisis con un software de análisis de datos de citometría de flujo (Figura 4)
   1. Arrastre y suelte los archivos FSC en el software. Defina con el control FMO la población positiva para cada marcador.
      1. Determine los FMO trazando cada control FMO con cada marcador de un diagrama de puntos. Esto hace que el derrame se derrame en otros canales visibles. Utilice la puerta FMO con el mayor desbordamiento de fluorescencia como límite para la población positiva para las muestras de 10 colores tratadas.
2. Análisis con un análisis de citometría de flujo basado en la nube (Figura 5)
   1. Abra el software y cree un nuevo conjunto de datos. Arrastre y suelte los archivos FCS adquiridos con el citómetro de flujo.
   2. Inicie el análisis creando un flujo de trabajo. La matriz de compensación se crea automáticamente a partir de los archivos de datos sin procesar.
   3. Ejecute un análisis UMAP con la siguiente configuración: Vecinos: 15, Distancia mínima: 0,4; Componentes: 2; Métrico: euclidiano; Tasa de aprendizaje: 1; Épocas: 200; Inicialización de incrustación: espectral. Seleccione todos los archivos y los 10 marcadores (características).
   4. Agregue el análisis de fenoprafía como una nueva tarea y ejecute el análisis con la siguiente configuración: K Vecinos más cercanos: 20; Métrica de distancia: euclidiana; Carreras de Lovaina: 1; Número de resultados: 1.
   5. Agregue una tarea de compuerta para indicar los clústeres generados. Después de ejecutar el análisis, es posible presentar los datos en diferentes blots, que se pueden exportar.

Resultados

Hay dos opciones para analizar los datos brutos recopilados por un panel de citometría de flujo multicolor. Una opción es analizarlo manualmente con el software de análisis (Figura 3 y Figura 4). Por lo tanto, los datos sin procesar deben arrastrarse y soltarse en la ventana del software. En primer lugar, es necesario encontrar las células ajustando la escala SSC/FSC en el modo de visualización del diagrama de dispersión para mostrar la población de plaquetas co...

Discusión

La citometría de flujo multicolor permite definir distintos grupos/subpoblaciones de plaquetas asociadas a funciones discretas 12,17,18. Decisivo para los resultados de las subpoblaciones y la expresión de la superficie del receptor es la calidad de las plaquetas humanas aisladas. Por lo tanto, un paso clave en el protocolo presentado es la preparación de las plaquetas. Es necesario aislarlos su...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
10x Buffer de encuadernación	Invitrogen, Carlsbad, California, USA	88-8103-74	Tampón
Difosfato de adenosina (ADP)	Probe & go Labordiagnostica GmbH Lemgo, Alemania	70212	Agonista plaquetario
Anexina V PE-Cianina7	Invitrogen, Carlsbad, California, EE.UU.	88-8103-74	colorante
anti-CD41 AF 700	BioLegend, San Diego, CA, USA	303728	anticuerpos
anti-CD41 Alexa Fluor 700	BioLegend, San Diego, CA, USA	303727	anticuerpos
anti-CD42b PerCP/Cianina5.5	BioLegend, San Diego, CA, USA	303918	anticuerpos
anti-CD61 BV605	BD Bioscience Franklin Lakes, NJ, EE. UU.	744382	anticuerpos
anti-CD62P PE	Beckman Coulter, Brea, California, EE. UU.	IM1759U	anticuerpo
anti-CD63 PE/Cy5	Abcam, Cambrigde, UK	ab 234251	anticuerpo
anti-CXCR4 BV650	BD Bioscience Franklin Lakes, NJ, EE. UU.	740599	anticuerpos
anti-CXCR7 BV421	BD Bioscience Franklin Lakes, NJ, EE. UU.	566234	anticuerpos
anti-PAC-1 FITC	BD Bioscience Franklin Lakes, NJ, EE. UU.	340507	anticuerpos
Albúmina sérica bovina (BSA)	Applichem, Darmstadt, Alemania	A1391-Ácido
cítrico	Carl Roth, Karlsruhe, Alemania	6490.1-CRP-XL
	CambCol Laboratories, Ely, Reino Unido	plaquetario CRP-XL
D-(+)-Glucosa	Sigma Aldrich Co., St. Louis, Missouri, EE. UU.	G7528-Dubecco
' s Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Sigma Aldrich Co, St. Louis, Missouri, USA	D8537-Hemin
	Sigma Aldrich Co., St. Louis, Missouri, USA	Agonista plaquetario	H9039-10G
HEPES	Carl Roth, Karlsruhe, Alemania	9105.3-Cloruro	de
potasio	Carl Roth, Karlsruhe, Alemania	6781.3-Cloruro	de
sodio	Carl Roth, Karlsruhe, Alemania	3957.1-Hidrogenocarbonato
de sodio	Sigma Aldrich Co, St. Louis, Missouri, USA
401676-Trombina	Roche	10602400001	agonista plaquetario
citrato de trisodio-dihidrato	Applichem, Darmstadt, Alemania
1416551211-Zombie NIR	BioLegend, San Diego, CA, EE. UU	. colorante	reactivo a las aminas 423105