Detección de FISH sensible al polimorfismo de un solo nucleótido de la transcripción de ARN ribosómico específico del locus en Drosophila melanogaster

Summary

El protocolo describe el método de hibridación in situ de fluorescencia sensible a polimorfismos de un solo nucleótido (SNP-FISH) para distinguir las transcripciones de ARN ribosómico derivadas del locus de ADN ribosómico del cromosoma X o Y en Drosophila melanogaster.

Abstract

Con el fin de garantizar que se transcriba suficiente ARN ribosómico (ARNr) para la función de los ribosomas, los genomas contienen cientos de duplicaciones en tándem de las secuencias que codifican los ARNr, componiendo regiones llamadas loci de ADN ribosómico (ADNr). Los genomas de muchos organismos contienen más de un locus de ADNr distribuido en diferentes cromosomas, y el ARNr puede transcribirse a partir de múltiples loci de ADNr o de un solo locus. Los cambios en las fuentes de transcripción del ARNr a menudo indican sufrimiento ribosómico. Sin embargo, la homogeneidad del ARNr impide distinguir si el ARNr se transcribe a partir de múltiples o de un solo locus de ADNr. Aquí, describimos un método que utiliza la hibridación in situ de fluorescencia sensible al polimorfismo de un solo nucleótido (SNP-FISH) para distinguir la transcripción de ARNr entre los loci de ADNr de Drosophila melanogaster en los cromosomas X e Y. Este método aprovecha las variantes de ARNr específicas del locus para permitir una fácil detección de la fuente de transcripción del ARNr con resolución de una sola célula. Este ensayo se puede aplicar a cualquier tipo de célula de Drosophila y puede adaptarse para su uso en otros sistemas.

Introduction

Los ARN ribosómicos (ARNr) 18S, 5.8S y 28S necesarios para la función del ribosoma se transcriben conjuntamente en un solo cistrón llamado pre-ARNr 45S. Los tres ARNr están separados dentro del pre-ARNr 45S por dos secuencias espaciadoras transcritas internas (ITS) y flanqueadas por secuencias espaciadoras transcritas externas (ETS) en los extremos 5' y 3'. Todas estas secuencias espaciadoras se eliminan del pre-ARNr 45S para que los ARNr maduros se incorporen a los ribosomas (ver¹). Con el fin de satisfacer la gran demanda de producción de ARNr necesaria para apoyar la actividad de los ribosomas, todos los genomas eucariotas contienen cientos de copias de la secuencia 45S. Estas copias se agrupan en repeticiones en tándem, formando regiones genómicas llamadas loci de ADN ribosómico (ADNr). La mayoría de los genomas eucariotas contienen múltiples loci de ADNr distribuidos en cromosomas separados (ver²). La alta redundancia de las copias 45S significa que normalmente hay muchas más copias 45S de las necesarias para la transcripción, y la mayoría de las copias 45S son transcripcionalmente silenciosas y están enterradas en heterocromatina³. La actividad transcripcional no es uniforme en todos los loci de ADNr, y la variación en la transcripción del locus de ADNr se observa ampliamente en los organismos ^4,5,6, lo que indica que la transcripción 45S está regulada diferencialmente en los loci individuales de ADNr. Se ha observado el silenciamiento del ADNr en todo el locus^en plantas, invertebrados y vertebrados 7,8,9,10, lo que sugiere que el silenciamiento del ADNr en todo el locus es un mecanismo importante para regular la dosis de ARNr ¹¹. La transcripción del ARNr es un paso regulador clave en la producción de ribosomas, y los cambios en la transcripción del ARNr que modulan la actividad traduccional son una característica importante tanto de la diferenciación normal como de las condiciones patológicas¹². Los cambios en la transcripción del locus de ADNr también se asocian con reducciones en el número total de copias de ADNr¹³. Por lo tanto, la transcripción alterada del ADNr específico del locus puede ser un indicador importante de la fisiología celular alterada.

Si bien el silenciamiento específico del locus parece ser una fuente importante de regulación transcripcional del ARNr, se desconocen en gran medida los mecanismos que establecen este silenciamiento y dirigen qué loci de ADNr son transcripcionalmente activos. La homogeneidad de las secuencias de ADNr dificulta la evaluación de la transcripción individual del locus de ADNr, lo que impide un análisis generalizado de la actividad transcripcional del ADNr específica del locus. Este desafío puede ser posible superarlo aprovechando la variación estructural y de secuencia de un solo nucleótido entre copias de ADNr dentro del mismo genoma 4,5,6,13. Algunas de estas variantes pueden ser compartidas entre la mayoría o todas las copias de un locus individual, creando haplotipos únicos de locus de ADNr de múltiples variantes que distinguen un locus de ADNr. De hecho, el reciente mapeo de variantes de ADNr a loci específicos por el consorcio de telómeros a telómeros reveló variantes de ADNr compartidas específicas de locus en el genoma humano¹⁴. Estos mapas de locus de ADNr pueden permitir la identificación de la transcripción específica del locus a partir de conjuntos de datos de secuenciación; Sin embargo, la disponibilidad de estos mapas sigue siendo limitada y no es fácil de producir. Dado que los loci de ADNr solo residen en los cromosomas sexuales de Drosophila melanogaster (un locus en cada cromosoma X e Y)¹⁵, el locus de ADNr del cromosoma Y está ausente en las hembras XX. Este aislamiento natural del locus del cromosoma Y significa que las variantes de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) entre los loci de ADNr X e Y se pueden identificar fácilmente en la secuenciación de lectura corta como cualquier variante que esté presente en los hombres (XY) pero ausente en las mujeres (XX). Los SNP previamente identificados se pueden probar rápidamente en cepas de Drosophila no genotipadas a través de una simple PCR y secuenciación Sanger de ADN de machos y hembras. Además, la disponibilidad de cepas de Drosophila con un cromosoma X que no tiene locus¹⁶ de ADNr significa que los loci de ADNr X e Y individuales se pueden aislar individualmente para una caracterización aún más precisa de los SNP de ADNr. Esta fácil identificación de las variantes de SNP entre los loci de ADNr de Drosophila permite determinar los haplotipos¹³ de SNP de loci de ADNr X e Y únicos. Los loci de ADNr del cromosoma X también suelen ser completamente silenciosos en los machos de Drosophila, pero ambos loci del cromosoma X se transcriben en las hembras^10,17, lo que convierte a Drosophila en un sistema útil para estudiar el silenciamiento del ADNr en todo el locus.

La hibridación fluorescente in situ (FISH) es una poderosa herramienta para visualizar la presencia de secuencias específicas de ARN o ADN dentro de las células individuales de un tejido. Las etiquetas FISH se dirigen a secuencias de ARN o ADN a través de sondas de oligonucleótidos antisentido conjugadas con fluoróforos. Por lo general, se requiere que las sondas FISH tengan ~ 20 nucleótidos de largo para proporcionar una unión al objetivo lo suficientemente estable como para ser visualizadas, pero las sondas de este largo también pueden unirse fácilmente a secuencias no objetivo que difieren en un solo nucleótido (Figura 1A). Por el contrario, las sondas lo suficientemente cortas como para conferir especificidad de un solo nucleótido no se unen de manera lo suficientemente estable para la visualización. Para equilibrar la especificidad y la estabilidad, FISH (SNP-FISH) sensible a SNP combina una sonda fluorescente antisentido de ~26 nucleótidos con un oligonucleótido de máscara de detección no fluorescente que se une a todos menos al extremo 5' de la sonda¹⁸. Esta máscara deja solo los 10 nucleótidos más 5' de la sonda monocatenarios y disponibles para la unión al objetivo (Figura 1B). Esta porción corta de una sola cadena de la sonda confiere especificidad al objetivo, pero evita la reactividad cruzada con ARN que tienen incluso un solo desajuste con estos 10 nucleótidos (Figura 1B). Una vez que el extremo 5' de la sonda se une a su objetivo, el desplazamiento pasivo de la hebra elimina la máscara de la sonda, permitiendo que la región 3' se una al objetivo y cree un etiquetado de objetivo estable (Figura 1B)¹⁸. Por lo tanto, SNP-FISH puede visualizar diferencialmente ARN que difieren en un solo SNP mediante el uso de un par de sondas que tienen diferentes fluoróforos que complementan a un SNP diferente pero comparten una máscara común (Figura 1C). Aunque este método solo recluta una sola sonda conjugada con fluoróforos para el SNP objetivo, la agrupación de múltiples conjuntos de máscaras de sonda en varios SNP dentro de un haplotipo de ADNr compartido se puede utilizar para amplificar la detección sensible a SNP de un solo ARNr (Figura 1D). Además, debido a que el ARNr se transcribe tan abundantemente, las transcripciones de ARNr se pueden visualizar fácilmente en experimentos FISH utilizando un pequeño número de etiquetas fluorescentes por ARN. Este bajo requerimiento de fluoróforo por ARN significa que SNP-FISH puede visualizar ARNr de un locus específico con solo unos pocos SNP únicos. Este método puede detectar fácilmente la transcripción de ARNr específica del locus en una variedad de tejidos y etapas de desarrollo de Drosophila ¹⁷. Es particularmente eficaz en las células madre de la línea germinal masculina de Drosophila, que cambian entre la transcripción exclusiva de ADNr Y y la coexpresión de loci de ADNr de los cromosomas X e Y durante el envejecimiento¹³. Aquí, proporcionamos un protocolo SNP-FISH para visualizar distintas transcripciones de ARNr X e Y en el testículo de Drosophila para lograr el objetivo general de evaluar el silenciamiento del ARNr específico del locus. Este método utiliza cuatro SNPs previamente caracterizados entre los loci de ADNr en los cromosomas X e Y de la cepa común de Drosophila de laboratorio y¹w¹ (Figura 1D).

Protocol

1. Preparación de tampones y reactivos

NOTA: Se debe utilizar la técnica sin ARNasa en los pasos 1, 3 y 4, y se deben utilizar reactivos certificados sin ARNasa.

1. En una campana química, prepare 40 mL de formaldehído al 4% en una solución de fijación de PBS 1x agregando 10 mL de formaldehído al 16% y 4 mL de PBS 10x sin RNasa a 26 mL de agua sin RNasa. Distribuir en alícuotas de 1 ml y almacenar a -20 °C dentro de los 30 minutos posteriores a la preparación. La solución de fijación puede almacenarse a -20 °C durante un máximo de 6 meses.
   PRECAUCIÓN: La solución contiene formaldehído. Manéjelo con guantes y EPI adecuado y deséchelo de manera segura.
2. Prepare 10 mL de tampón de hibridación mezclando 1 mL de citrato de sano-sodio (SSC) libre de RNasa 20x, 1 g de sulfato de dextrano, 100 μL de ARNt de Saccharomyces cerevisiae de 100 mg/mL, 100 μL de complejo de ribonucleósidos de vanadio de 200 mM, 1 mL de BSA libre de RNasa al 5%, 1 mL de formamida desionizada combinada con 6 mL de agua libre de RNasa. Distribuir en alícuotas de 1 mL en tubos de microfuga de 1,5 mL y almacenar a -20 °C durante un máximo de 1 mes.
3. Prepare 50 mL de tampón de lavado agregando 5 mL de SSC libre de RNasa 20x, 5 mL de formamida desionizada, 50 μL de Triton-X a 40 mL de agua libre de RNasa. Almacene a temperatura ambiente en la oscuridad hasta por 1 mes.
4. Prepare 10 ml de tampón de aislamiento de ADN añadiendo 100 μL de Tris-HCl 1M pH 7,5-8,0, 20 μL de EDTA 0,5M y 50 μL de NaCl 5M a 9,8 mL de agua.

2. Genotipado de muestras para SNPs de ARNr específicos de X e Y

1. Recoja hembras y machos homocigotos X individuales no apareados que alberguen el mismo cromosoma X en tubos de 0,2 ml y enfríe en hielo.
2. Combine 50 μL de tampón de aislamiento de ADN con 0,5 μL de 20 mg/mL de proteinasa K por muestra.
3. Añadir 50 μL de tampón de aislamiento de ADN / proteinasa K a la muestra de Drosophila y homogeneizar la muestra con una punta de pipeta.
4. Incubar las muestras a 37 °C durante 30 minutos, seguido de 95 °C durante 2 minutos. Transfiera 40 mL de muestra (evite los desechos de animales) a un tubo limpio de 1.5 mL.
5. Amplifique por separado cada región diana de SNP de cada muestra de ADN mediante PCR utilizando una concentración de 10 μM de los siguientes pares de cebadores: 18S SNP Forward + Reverse; ITS1 SNP Adelante + Atrás; 28S SNP Adelante + Atrás. La secuencia del cebador y el tamaño esperado del amplicón de PCR se encuentran en la Tabla 1.
6. Utilice la electroforesis en gel para separar toda la muestra de PCR en un gel de agarosa al 1% 1x TAE para confirmar el producto de PCR esperado. Los tamaños de producto esperados se enumeran en la Tabla 1.
7. Aísle el producto de PCR del gel utilizando cualquier kit de extracción de gel disponible en el mercado.
8. Secuenciación de productos PCR por secuenciación Sanger. Segreñe las muestras en ambas direcciones utilizando reacciones individuales separadas para el cebador F y R para cada objetivo.
9. Determine la variante de SNP del cromosoma X en las posiciones de la Tabla 2 en una muestra de ADN femenino no apareado. El haplotipo X esperado se describe en la Tabla 2.
10. Observe las posiciones de SNP en el cromatograma de secuenciación de muestras de ADN masculino. Infiera la variante de SNP del cromosoma Y en función de la variante de SNP X ya determinada en cada posición de SNP. El haplotipo Y esperado se describe en la Tabla 2.

Nombre del cebador	Secuencia	Tamaño esperado del amplicón
18S SNP F	GACTACCATGGTTGCAACGG	652 pb
18S SNP R	TTCACCTCTCGCGTCGTAAT
ITS1 SNP F	CTTGCGTGTTACGGTTTTTTC	955 pb
ITS1 SNP R	ACAGCATGGACTGCGATATG
28S SNP F	ATGCGTAGAAGTGTTTGGCG	598 pb
28S SNP R	GCCGACTTCCCTTACCTACA

Tabla 1: Secuencias de cebadores para la secuenciación de SNPs de ADNr. Pares de cebadores para amplificar regiones de ADNr que contienen SNPs previamente caracterizados en las regiones de ADNr 18S, ITS1 y 28S. Se enumeran la secuencia de oligonucleótidos del cebador y el tamaño esperado del amplicón de PCR.

Haplotipo	Posición SNP	Secuencia
ADNr X	AÑOS 18	1603-ATACTTGTATTTTTTCATATG-1625
	ITS1-1	2873-CGTTAATAAATATTTGTAATT-2895
	ITS1-2	3115-GAAAATCGAAGAAACAAAATT-3137
	28 AÑOS	5932-AACAAAAATGCCTAACTATAT-5954
ADNr Y	AÑOS 18	1603-ATACTTGTATCTTTTCATATG-1624
	ITS1-1	2873-CGTTAATAAACATTTGTAATT-2895
	ITS1-2	3115-GAAAATCGAAAAAACAAAATT-3137
	28 AÑOS	5932-AACAAAAATGGCTAACTATAT-5954

Tabla 2: Haplotipos de ADNr esperados. SNPs esperados en los loci de ADNr de los cromosomas X e Y en la cepa de Drosophila ^{y 1}w¹. SNP indicado en negrita y subrayado. Posición listada en base a la secuencia de ARNr 45S de consenso (Archivo complementario 1).

3. Disección, fijación y permeabilización de los testículos

1. Limpie el microscopio estereoscópico, la estación de trabajo, la placa de disección y las pinzas de disección con etanol al 70% (u otro tratamiento con RNasa).
2. Bajo un microscopio estereoscópico, diseccione Drosophila para aislar los testículos en PBS 1x libre de ARNasa. Agarre la mitad del abdomen del animal con un par de pinzas y agarre el extremo del abdomen con otro par de pinzas para separar suavemente al animal. Los testículos se disociarán del animal y se pueden separar aún más con fórceps. Recoja de 30 a 40 testículos por muestra.
3. Con pinzas, recoja los testículos y transfiéralos de la placa de disección a un tubo de microfuga de 1,5 mL que contenga 0,5 mL de PBS libre de ARNasa 1x.
4. Aspire PBS y agregue 1 ml de solución de fijación. Incubar a temperatura ambiente en un agitador nutante durante 30 min.
5. Lavar 2 veces con 1 mL de PBS sin RNasa 1x durante 5 minutos cada una en un agitador nutante. Aspire 1x PBS y agregue 1 mL de etanol al 70% (EtOH) libre de RNasa. Incubar a 4 °C durante la noche en un agitador nutante.

4. PECES DE ARN RIBOSÓMICO SENSIBLES A SNP

1. Aspire etanol y agregue 1 mL de tampón de lavado. Incubar a temperatura ambiente durante 3 minutos en un agitador nutante, seguido de 2 minutos de tubo en posición vertical.
2. Mezcle sondas y máscaras con tampón de hibridación, haciendo 100 μL de volumen total por muestra. Las sondas, las secuencias de mascarillas y las etiquetas de fluoróforos se enumeran en la Tabla 3. Cuando utilice los 4 SNP, prepare 80 μL de tampón de hibridación, 1 μL de 10 μM de sonda Y-SNP (4 μL en total), 1 μL de 10 μM de sonda X-SNP (4 μL en total) y 3 μL de mascarilla común de 10 μM (12 μL en total)
3. Aspire el tampón de lavado, luego agregue 100 μL de solución de hibridación. Aplique una película transparente en los bordes del tubo, envuélvalo en papel de aluminio para protegerlo de la luz e incube en un baño de agua a 37 °C durante al menos 24 h.
4. Añadir 1 mL de tampón de lavado a la muestra sin aspirar la solución de hibridación. Incubar en un baño de agua a 37 °C durante 30 minutos en la oscuridad.
5. Aspire el tampón de lavado, luego agregue 1 ml de tampón de lavado a la muestra. Incubar en un baño de agua a 37 °C durante 30 minutos en la oscuridad.
6. Aspire el tampón de lavado y añada 50 μL de medio de montaje. Las muestras pueden montarse inmediatamente en portaobjetos o almacenarse hasta 1 semana a 4 °C antes del montaje.

Posición SNP	Oligonucleótido	Secuencia		Fluoróforo conjugado 3'
AÑOS 18	Sonda X SNP	AAAAAATACAAGTATTTAATCACATA		Alexa 488
	Sonda SNP Y	AAAAGATACAAGTATTTAATCACATA		Alexa 647
	Máscara	TATGTGATTAAATACT
ITS1-1	Sonda X SNP	AAATATTTATTAACGGTAAGGATATT		Alexa 488
	Sonda SNP Y	AAATGTTTATTAACGGTAAGGATATT		Alexa 647
	Máscara	AATATCCTTACCGTTA
ITS1-2	Sonda X SNP	GTTTCTTCGATTTTCATGTTCGAAAC		Alexa 488
	Sonda SNP Y	GTTTTTTCGATTTTCATGTTCGAAAC		Alexa 647
	Máscara	GTTTCGAACATGAAAA
28 AÑOS	Sonda X SNP	TTAGGCATTTTTTTTTTACTTGAAAA		Alexa 488
	Sonda SNP Y	TTAGCCATTTTTTTTTTACTTGAAAA		Alexa 647
	Máscara	TTTTCAAGTAAAACAA

Tabla 3: Secuencias de sonda y enmascaramiento para peces snp de ADNr. Las posiciones de SNP se resaltan en negrita. La parte de la sonda que se une al oligonucleótido de la máscara está subrayada. Se enumeran ejemplos de fluoróforos conjugados 3' adecuados, pero se puede utilizar cualquier fluoróforo compatible.

5. Preparación de muestras para la obtención de imágenes

1. Trabajando bajo un microscopio estereoscópico de disección, utilice una pipeta de orificio ancho para transferir la muestra a un portaobjetos de microscopio.
2. Con fórceps, coloque los testículos en una línea para facilitar la búsqueda de muestras al tomar imágenes (no se requiere orientación específica). Cubra la muestra con un cubreobjetos. Seque los bordes deslizantes con una toallita de papel para eliminar el exceso de medios de montaje.
3. Sella los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas. Deje el deslizador en la oscuridad a temperatura ambiente durante 10 minutos para que el esmalte de uñas se seque. Los portaobjetos pueden utilizarse inmediatamente para la obtención de imágenes confocales o almacenarse hasta un mes a 4 °C antes de la obtención de imágenes^.

Results

Se espera que los resultados de la secuenciación del genotipado de SNP detecten las diferencias de SNP entre los loci de ADNr X e Y. Estos SNPs se detectan evaluando directamente las posiciones de los SNPs en cromatogramas de secuenciación (Figura 2). Se espera que la secuenciación de muestras femeninas tenga una sola señal de secuenciación en la posición SNP, lo que indica la homocigosidad del SNP entre los dos cromosomas X (Figura 2A). Se espera que los resultados de la secuenciación de la muestra masculina tengan un doble pico en la posición del SNP (Figura 2B). Sobre la base del genotipo del cromosoma X determinado a partir de la secuenciación de la muestra femenina, se infiere que la variante no X es un SNP de ADNr del cromosoma Y (es decir, X = T, Y = C para la secuenciación del SNP 18S en la Figura 2). Alternativamente, un solo pico de secuenciación en una posición de SNP en la muestra masculina indicaría homocigosis entre los loci de ADNr masculinos y femeninos en esa posición de SNP, y esa posición no sería utilizable para los peces SNP de ARNr.

Siguiendo el protocolo para SNP FISH, las muestras se pueden visualizar montándolas en portaobjetos y colocándolas debajo de un cubreobjetos sellado, seguido de microscopía confocal. Utilizando las sondas enumeradas en la Tabla 3, la señal de ARNr derivada de Y es detectada por la emisión de Alexa Fluor 647 y la señal de ARNr derivada de X es detectada por la emisión de Alexa Fluor 488. Se espera que se observen señales de ARNr en el nucléolo, que puede identificarse como el agujero pobre en DAPI en el núcleo (Figura 3A). El nucléolo es particularmente fácil de identificar en las células germinales debido a su gran núcleo y nucléolo (Figura 3A). Por lo general, la señal débil también se puede encontrar en el citoplasma (Figura 3), pero esta es una señal inespecífica que también se puede detectar en muestras sin ARNr que contienen un SNP complementario (es decir, señal Y en células que carecen de ADNr Y o señal X en células que carecen de ADNr X; Figura 3B-C). Además, el co-marcaje artificial del ARNr X e Y puede detectarse a veces en el centro somático, incluso en muestras que carecen de loci de ADNr X o Y (Figura 3B-C, flechas amarillas). Por lo tanto, solo se deben utilizar señales nucleares para evaluar la transcripción específica del locus. Se espera que la mayoría de las células, particularmente las células somáticas, solo tengan una señal de ARNr Y, lo que indica que el ARNr se transcribe exclusivamente del locus ADNr Y (Figura 3A, círculo punteado amarillo y flecha roja)^10,17. Sin embargo, la coexpresión de ARNr X e Y se detecta a menudo en las células germinales, particularmente en las células madre de la línea germinal¹³ (Figura 3A, círculos punteados blancos). Las señales de ARNr X e Y en las células que se expresan conjuntamente pueden ser adyacentes y formar un solo nucléolo (Figura 3A, celda superior) o pueden separarse, formando dos nucleolos (Figura 3A, celda inferior). Los ejemplos de la Figura 3 se proporcionan a partir de rDNA SNP-FISH utilizando conjuntos de sondas dirigidos solo a dos SNP (los dos SNP ITS1), lo que demuestra que solo se necesitan dos SNP para rDNA SNP-FISH. Sin embargo, se observan señales más robustas cuando se utilizan sondas dirigidas a los cuatro SNP¹³.

Los controles negativos son una inclusión importante para este ensayo para confirmar que las sondas no reaccionan de forma cruzada con el objetivo SNP incorrecto, especialmente cuando se soluciona el método por primera vez. Los controles negativos del cromosoma X incluyen cualquier afección que carezca de ADNr del cromosoma X, como los hombres que albergan un cromosoma X con una deleción de ADNr. Se espera que los controles negativos del cromosoma X solo detecten la señal de ARNr Y y no el ARNr X (Figura 3B). Los controles negativos del cromosoma Y incluyen cualquier afección que carezca de ADNr del cromosoma Y. Algunos ejemplos de estas condiciones son cualquier tejido femenino XX, tejido de hombres que carecen de un cromosoma Y o hombres que albergan un cromosoma Y con una deleción de ADNr¹⁵. Se espera que los controles negativos del cromosoma Y solo detecten la señal de ARNr X y no tengan ninguna señal de ARNr Y detectable (Figura 3C). Tenga en cuenta que estos controles no solo son importantes para determinar la especificidad de la sonda, sino también para determinar cualquier fondo o artefacto de la señal. Cualquier nueva sonda o condición de ensayo que proporcione especificidad en dichos controles se puede utilizar con precisión para detectar la transcripción de ADNr específica del locus.

Diferentes condiciones genéticas, de desarrollo o ambientales pueden alterar la probabilidad de que el ADNr se transcriba exclusivamente del locus ^13,17 del ADNr del cromosoma^Y. La frecuencia de transcripción del ADNr de un solo locus o de múltiples loci se puede cuantificar y comparar directamente entre muestras. Con el fin de comparar cuantitativamente las diferencias en la transcripción del locus del ADNr, cada célula debe clasificarse individualmente como Y-dominante, Co-dominante o X-dominante. Las celdas solo se clasifican como dominantes Y y X si solo se detecta esa señal respectiva. Cualquier célula con señales de ARNr Y y X se considera codominante, incluso si una señal es mucho más débil que la otra. Por lo tanto, las células que contienen señales X e Y muy fuertes se consideran cualitativamente iguales a las células con señales Y fuertes y X débiles o X fuertes e Y débiles. El porcentaje total de todas las células en todas las muestras de cada categoría se puede comparar entre muestras mediante la prueba de chi cuadrado. Si bien este ensayo funciona bien para determinar cualitativamente si un locus de ADNr en particular se transcribe o no, no hemos observado evaluaciones consistentes entre muestras al cuantificar directamente la intensidad de fluorescencia de las señales SNP-FISH individuales. Por lo tanto, no recomendamos realizar evaluaciones cuantitativas de la intensidad de la señal FISH entre muestras o la intensidad relativa de las señales de ADNr X e Y dentro de una sola célula. La fuente de esta inconsistencia en la intensidad de la fluorescencia no está clara, aunque puede deberse a la unión ineficiente de las sondas enmascaradas que no se unen a todos los ARNr objetivo.

Figura 1: Diagrama del método SNP-FISH. (A) Las sondas de oligonucleótidos antisentido FISH tradicionales reaccionan de forma cruzada con ARN no objetivo que difieren en un solo nucleótido. (B) El método SNP-FISH utiliza oligonucleótidos de máscara complementaria unidos a la región 3' de la sonda de oligonucleótidos. La máscara deja solo 10 nucleótidos libres para unirse a la secuencia objetivo. Una región de sonda no enmascarada no se une de manera estable a secuencias no objetivo que difieren en uno o más nucleótidos. La máscara se disocia de la sonda después de que la sonda se une al objetivo, lo que permite una unión estable entre la sonda y el objetivo. (C) Las sondas SNP emparejadas etiquetadas de manera diferente combinadas con una máscara común se unen específicamente a objetivos que difieren en un solo nucleótido sin reacciones cruzadas. (D) Se pueden agrupar múltiples sondas para etiquetar específicamente distintos haplotipos de ARNr. Se han caracterizado cuatro diferencias de SNP entre los loci de ADNr X e Y en la cepa y¹w^{1 de} Drosophila melanogaster . Un SNP en el ARNr 18S, uno en el ARNr 28S y dos en la porción ITS1 del pre-ARNr. Se muestran los haplotipos de ARNr específicos de X e Y utilizados para SNP-FISH. Las sondas dirigidas a la variante de ADNr X en los cuatro SNP de ARNr se conjugan con un fluoróforo común (verde), y las sondas dirigidas a las variantes de ADNr Y se conjugan con un fluoróforo diferente (magenta). Se utiliza una mascarilla común para cada SNP (cuatro en total). La unión de sondas específicas de SNP en cada posición de SNP en el ARNr puede etiquetar específicamente el ARNr de los loci de ADNr X e Y con hasta cuatro sondas de oligonucleótidos FISH. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Ejemplos de resultados de secuenciación de SNP de ADNr homocigotos y heterocigotos. Ejemplo: cromatogramas de secuenciación a partir de secuenciación de ADN SNP 18S de muestras de (A) hembras y (B) machos. Posición SNP 18S indicada con un asterisco (*). La señal única de timina (T) para la posición del SNP en la muestra femenina indica una timina en la posición del SNP en el locus del ADNr del cromosoma X. La doble señal en la posición del SNP dividida entre timina y citosina (C) en la muestra masculina indica una citosina en la posición del SNP en el locus del ADNr del cromosoma Y (inferida al saber que la timina está en el locus del cromosoma X). Los resultados de la secuenciación se observaron utilizando ApE, un software editor de plásmidos¹⁹. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Ejemplos de resultados de SNP-FISH en el testículo de Drosophila utilizando solo dos conjuntos de sondas SNP-FISH. Ejemplos de SNP FISH en los testículos de animales con (A) ADNr X e Y, (B) solo ADNr Y, o (C) solo ADNr X. En estos ejemplos solo se utilizaron conjuntos de sondas que marcaron los dos SNP de ARNr ITS1, lo que demuestra que el ARNr SNP FISH funciona con tan solo dos SNP objetivo. Las células germinales se identifican por su núcleo grande y redondo y las células somáticas por su núcleo más pequeño y menos redondo. Las células madre de la línea germinal se identifican por su posición directamente al lado del centro somático, marcada con un asterisco (*). Las células germinales que transcriben el ADNr de los loci de ADNr X e Y se identifican mediante señales FISH nucleares X e Y (círculos punteados blancos, A-A''). Las células germinales que transcriben ADN solo del locus Y rDNA solo tienen una señal FISH nuclear Y (círculo punteado amarillo). Las células somáticas que solo expresan Y están marcadas con una flecha roja. Se puede observar el co-marcaje artificial de los loci de ADNr X e Y en el eje somático (flecha amarilla). La barra de escala es de 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo suplementario 1: Secuencia de ARNr del locus del cromosoma X. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

Aquí, describimos un método para usar SNP-FISH para distinguir transcripciones de ARNr 45S derivadas de los loci de ADNr de los cromosomas X e Y en tejidos de Drosophila melanogaster . El paso más crítico en este protocolo es el genotipado preciso de los SNP 45S para ser utilizados como objetivos SNP-FISH. Proporcionamos cebadores y protocolo para genotipar cuatro SNP conocidos de Drosophila 45S, pero otros métodos de secuenciación pueden revelar nuevos SNP que podrían usarse alternativamente para el ensayo. Cualquier posición de SNP que se encuentre idéntica entre los loci de ADNr del cromosoma X e Y (es decir, hay un solo pico de secuenciación en las muestras de ADN masculino) no se puede usar para SNP FISH. Algunas posiciones de SNP pueden ser heterogéneas dentro de un solo locus de ADNr (es decir, los resultados de la secuenciación no dan una sola variante de SNP para muestras XX o solo un segundo pico de secuenciación muy pequeño en muestras XY). Los SNP que son heterogéneos dentro de un solo locus de ADNr tampoco son adecuados para este ensayo, ya que una de las variantes sería compartida entre los dos loci de ADNr, lo que haría indistinguible la transcripción de un solo locus o de múltiples loci. Además, debido al almacenamiento de esperma femenino²⁰, el ADN aislado de las hembras apareadas puede contener ADNr del cromosoma Y. Por lo tanto, es fundamental que se utilicen hembras no apareadas para el análisis de secuenciación XX. Es importante destacar que este método requiere al menos dos SNP específicos de cromosoma para permitir que al menos dos sondas específicas de locus se unan a cada molécula de ARNr para su detección, lo que limita su aplicación a loci de ADNr con al menos dos SNP distintivos entre ellos. La disponibilidad de más SNP permite que más sondas se unan a cada ARNr y puede proporcionar una mayor eficacia de la señal. Curiosamente, este método solo marca el ARNr en el nucléolo, a pesar de que dos pares de sondas se dirigen a los SNP en los ARNr 18S y 28S que se exportan al citoplasma (el ARNr que contiene los dos sitios diana ITS1 solo existe en el nucléolo). La falta de señal FISH citoplasmática sugiere dos posibilidades no exclusivas: 1) las sondas 18S y 28S por sí solas son insuficientes para detectar el ARNr citoplasmático, tal vez porque el ARNr está más disperso por todo el citoplasma que en el nucléolo, o 2) hay una menor eficiencia de unión de la sonda a los ARNr integrados en las subunidades ribosómicas maduras que al ARNr 45S no procesado. Los SNP adicionales dentro de los ARNr 18S y 28S pueden permitir la detección de ARNr citoplasmáticos con FISH sensible a los SNP.

Otros métodos para evaluar la transcripción de ARNr específicos del locus incluyen enfoques de secuenciación de ARNr que diferencian la expresión de variantes de ARNr que se asignan a loci específicos⁶. De manera similar, la qPCR puede evaluar diferencialmente la expresión de variantes de ARNr que son lo suficientemente distintas como para permitir una detección única ^5,21, aunque no está claro si el silenciamiento de estas variantes representa el silenciamiento de un locus de ADNr completo. Si bien estos métodos pueden ser efectivos para cuantificar la expresión de variantes específicas de ARNr, no se pueden hacer con resolución de una sola célula. La heterogeneidad del silenciamiento del ADNr del cromosoma X en los tejidos de Drosophila sugiere que existe una fuerte variación de célula a célula en la transcripción del locus¹⁷ del ADNr y pone de manifiesto la necesidad de técnicas que puedan explicar esta variabilidad. Las características de imagen asociadas con la transcripción activa en los loci de ADNr, como la variante¹⁰ de la histona H3.3 o el factor de transcripción Pol I UBF²², se han utilizado para identificar la transcripción de ARNr específica del locus con resolución de una sola célula. Sin embargo, ambos métodos requieren los cromosomas condensados de las células mitóticas para distinguir la transcripción que ocurre en cualquier locus de ADNr en particular. En las células de Drosophila, los loci de ADNr en los cromosomas X e Y pueden identificarse por la forma del cromosoma¹⁰, pero la identificación de loci de ADNr transcripcionalmente activos en células humanas también requiere la tinción conjunta con las etiquetas específicas del cromosoma²². El método SNP-FISH no requiere co-marcaje de cromosomas específicos ni marcaje de marcadores transcripcionales y puede evaluarse en cualquier etapa del ciclo celular o células postmitóticas, lo que proporciona flexibilidad para su uso en diversos tejidos y condiciones experimentales.

Este método de ARNr SNP-FISH puede modificarse para su uso con otros SNPs que distingan entre ARNr de Drosophila o, potencialmente, aplicarse a SNPs que distingan entre loci de ADNr en otros organismos. La aplicación de este método a organismos con más de dos loci de ADNr requerirá que un locus tenga un haplotipo variante de ADNr único que contenga al menos dos SNP que no estén presentes en ningún otro locus de ADNr y que sean compartidos entre todas las copias 45S en ese locus. Este requisito significa que el método solo podrá especificar la transcripción de un locus específico en comparación con todos los demás (es decir, SNP de ARNr del locus 1 en comparación con los SNP compartidos por los loci 2 y 3). Sin embargo, si cada locus de ADNr tiene un haplotipo compatible, se podrían combinar múltiples experimentos para evaluar individualmente la transcripción de cada locus de uno en uno. La rigurosidad relativamente baja de la temperatura de hibridación (37 °C) utilizada en este protocolo permite una fuerte unión de la sonda, particularmente dada la porción corta y desenmascarada de la sonda, aunque se ha demostrado que la hibridación a temperaturas más altas (50-75 °C) mejora la señal de algunas sondas FISH²³. Las temperaturas de hibridación más altas pueden mejorar el desplazamiento de la hebra de la máscara y aumentar la unión de la sonda, pero las temperaturas demasiado altas pueden desestabilizar la unión de la sonda a la máscara y perder la especificidad de SNP. Por esta razón, no esperamos que SNP-FISH marque específicamente el ADN porque las temperaturas necesarias para fundir los objetivos de ADN bicatenario para permitir la unión de la sonda también desestabilizarían la unión de la máscara de la sonda y eliminarían la especificidad del objetivo sensible a SNP. Aun así, la optimización de la temperatura de hibridación para las nuevas sondas SNP de ARNr puede aumentar la señal, especialmente cuando sólo hay dos sitios SNP disponibles. La pérdida del silenciamiento del ADNr del cromosoma X se asocia con la reducción del número de copias de ADNr en Drosophila¹³, por lo que el desarrollo de ensayos SNP-FISH para caracterizar la transcripción de ARNr específica del locus en otros sistemas puede servir como una herramienta útil para evaluar la integridad del ADNr y la función de los ribosomas. Además, este método ha sido modificado para su uso con una variante de deleción en Drosophila, y esta única variante estructural de ARNr fue adecuada para la detección (quizás debido a una mayor afinidad de unión al objetivo sin una máscara de sonda)¹⁷. El uso de variantes estructurales de ARNr potencialmente combinadas con variantes de SNP amplía el potencial de aplicación en otros sistemas. Dado que los mecanismos que regulan la transcripción del locus del ADNr siguen siendo en gran medida poco claros, la flexibilidad y la adaptabilidad potencial del ARNr SNP-FISH a otros sistemas lo convierten en una herramienta poderosa para futuros estudios que investiguen la transcripción del ARNr.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PTC Tempo 96 Termociclador	Bio Rad	12015382	Se puede utilizar cualquier termociclador
0,2 mL 8 tiras de casquillo plano Tubos de PCR	VWR	89133-912	Se pueden utilizar todos los tubos compatibles Escalera de
ADN de 1 kb	NEB N3232S		Para usar cuando se verifica la secuenciación Tamaño del amplicón de PCR mediante electroforesis en gel
Tubos de microcentrífuga graduados de 1,5 mL	USA Scientific 1615-5510		Cualquier tubo certificado sin RNasa servirá
2 mM dNTP Mix	ThermoFisher Scientific	R0241
50x TAE Buffer	Bio Rad	1610743	utilizado para la electroforesis en gel. Se puede utilizar cualquier tampón TAE.
5M NaCl			Cualquier NaCl puede ser utilizado o preparado a partir de cualquier fuente
Agarosa	VWR	97064-250	Cualquier Agarosa puede ser utilizada
ApE - Un plásmido Software editor	N/A	N/A
Esmalte			Se puede utilizar cualquier esmalte de uñas de cualquier minorista
Cubreobjetos, n.º 1 de espesor	Thomas Scientific	6672A38
Formamida desionizada	Fisher Scientific	NC9569627
Sulfato de Dextrano Sigma Sódico	Aldrich	D8906-10G
DreamTaq Verde PCR Master Mix	Pinza ThermoFisher Scientific	K1081
Dumont #5	Fine Science Tools	11252-20	Se utiliza para diseccionar muestras
EDTA (0,5 M), pH 8,0	ThermoFisher Scientific	R1021	Se puede utilizar cualquier producto comparable
Etanol	VWR	89125-172	Se puede utilizar cualquier etanol de 200 grados. Se utiliza para la dilución a etanol al 70% para la permeabilización y la limpieza en condiciones libres
de ARNasa Bromuro de etidio	ThermoFisher Scientific	15585011
Sistema de electroforesis de gel mini gel horizontal	Fisher Scientific	14-955-170	Se puede utilizar cualquier sistema de electroforesis en gel
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666
Micro-Test Staining Dish	Electron Ciencias de la Microscopía	71564	Se utiliza para la disección de muestras
Agitador nutante	Sigma Aldrich	BMSB3D1020	Se puede utilizar cualquier agitador nutante
Parafilm	USA Scientific	3023-4526
Solución salina tamponada con fosfato (10X) pH 7.4, libre de RNasa	Life Technologies	AM9624
Pierce 16% de formaldehído (w/v), sin metanol	Life Technologies	28908
Baño de agua de uso general de precisión	Life Technologies	TSGP02	Se puede utilizar cualquier baño de agua
QIAquick Kit de extracción de gel	Qiagen	28704	Se puede utilizar cualquier kit de extracción de gel
Solución de proteinasa K recombinante (20 mg/mL)	Invitrogen	AM2546	Se puede utilizar cualquier producto comparable
UltraPure BSA sin ARNasa	ThermoFisher Scientific	AM2618
S. cerevisiae ARNt	Sigma Aldrich	R8759
SSC (20X), libre de ARNasa	Fisher Scientific	AM9763
Triton-X 100	Life Technologies	A16046.AE
UltaPure 1M Tampón Tris-HCl, pH 7,5	ThermoFisher Scientific	15567027	puede utilizar
cualquier producto comparableAgua destilada ultrapura sin DNasa/RNasa	Life Technologies	10977023
Complejo de ribonucleósidos de vanadilo	NEB	S1402S
Medios de montaje VECTASHIELD con línea DAPI	Vector Laboratories	H-1200-10
VWR Superfrost Portaobjetos	VWR	48311-601
y[1]w[1] Drosophila melanogaster	lineBloomington Drosophila Stock Center	1495
Microscopio confocal Zeiss LSM 980	Microscopía		Se puede utilizar cualquier microscopio confocal con emisión y detección compatibles
Microscopio estereoscópico Zeiss Stemi 2000-C y	microscopio de		455053 Se puede utilizar cualquier microscopio estereoscópico