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Artículo de método

Un protocolo robusto y reproducible para la generación de organoides por tubo neural a partir de células madre embrionarias individuales de ratón

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DOI:

10.3791/67883

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19 de diciembre de 2025

 , 
1Vienna BioCenter, Institute of Molecular Biotechnology of the Austrian Academy of Sciences (IMBA), 2Vienna BioCenter PhD Program, Doctoral School of the University of Vienna and Medical University of Vienna

En este artículo

Resumen

Los organoides tridimensionales del tubo neural (NTOs) derivados de células madre embrionarias de ratón son herramientas valiosas para estudiar el sistema nervioso central durante el desarrollo temprano. Aquí se presenta una demostración paso a paso de un protocolo optimizado para cultivar NTOs in vitro, proporcionando condiciones de cultivo estables y estrategias de resolución de problemas para una generación fiable y reproducible de NTO.

Resumen

El desarrollo de los mamíferos es un proceso altamente complejo, caracterizado por la necesidad de una señalización precisa dependiente de la concentración y el tiempo para la correcta formación de patrones y morfogénesis. A pesar de los considerables avances tecnológicos y conocimientos adquiridos, numerosos aspectos del desarrollo mamífero siguen siendo esquivos. Al examinar el organismo en su conjunto, resulta difícil desentrañar los efectos de las vías individuales o el mecanismo por el cual los estímulos externos guían la interferencia de los tejidos y factores circundantes. Para abordar esta complejidad, los modelos in vitro tridimensionales (3D) como los organoides han surgido como herramientas valiosas. Los organoides, derivados de células madre embrionarias (CES) o células madre pluripotentes inducidas (iPSCs), presentan características similares a tisulares que se asemejan mucho a sus homólogos in vivo en términos de patrones de expresión y funcionalidad. Es importante destacar que ofrecen accesibilidad para la manipulación y estudios biológicos extensos dentro de un entorno experimental controlado. A pesar de originarse en cultivos pluripotentes, los sistemas organoides a menudo exhiben heterogeneidad y considerable variabilidad, lo que limita su utilidad al estudiar cuestiones biológicas complejas e intrincadas. Por ello, existe una necesidad urgente de protocolos detallados destinados a armonizar procedimientos que resulten en datos reproducibles de alta calidad, reducción de materiales utilizados y que, de forma importante, permitan la investigación de fenómenos complejos. En este contexto, aquí se presenta un protocolo optimizado para el cultivo de organoides de tubos neuronales (NTOs) in vitro . Al producir condiciones de cultivo estables y ofrecer estrategias integrales de solución de problemas, este protocolo permite la generación fiable y reproducible de NTOs, que sirven como modelo adecuado para estudiar cuestiones científicas relevantes, incluyendo los mecanismos de inducción neuronal, patrón y desarrollo temprano del sistema nervioso central.

Introducción

El desarrollo en mamíferos, que comienza a partir de una única célula madre totipotente, es un proceso complejo que implica la inducción de la formación de patrones y lamorfogénesis 1,2. Este desarrollo requiere programas celulares estrictamente regulados para gestionar las interacciones dinámicas entre las células y sus entornos. Las células madre tienen la capacidad intrínseca de detectar, integrar y responder a señales sistémicas y locales, incluyendo gradientes demorfógenos 3, límitesmecánicos 4, proliferación celular y remodelaciónambiental 5. Las señales espaciotemporales externas también impulsan respuestas multicelulares, inicialmente, en tejidos homogéneos, para asegurar la formación precisa de estructuras complejas. Las células madre, distinguidas por su capacidad deautorrenovación 6,7 y diferenciación, desempeñan un papel crucial en el desarrollo embrionario y la reparación de tejidos adultos, siendo los principales tipos las células madre embrionarias (CEI), las células madre adultas (ASCs) y las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs).

Las ESCs se extraen de la masa celular interna (ICM) de un blastocisto y normalmente se cultivan en un entorno bidimensional (2D) sobre células alimentadoras o matriz extracelular utilizando medios de cultivo específicos para mantener supluripotencia 8. En los últimos años, la necesidad de condiciones y tecnologías de cultivo celular más realistas aumentó drásticamente, por lo que se establecieron modelos celulares y tisulares tridimensionales (3D) para estudiar procesos biomédicosfundamentales 9. Especialmente en biología del desarrollo, estos modelos 3D como los organoides ofrecen un método robusto para modelar la morfogénesis tisular y la organogénesis exvivo 9. Los organoides se forman mediante la autoorganización de células madre proliferantes que se desarrollan espontáneamente en complejas estructuras 3D mediante la ruptura de simetría y la formación de patrones. Este proceso es similar, aunque no idéntico al que se observa in vivo, y ocurre mayormente sin guía externa sino impulsado por dinámicas e interaccionesinternas 10. Dado que los organoides imitan estrechamente la estructura y función de los órganos reales, pueden proporcionar una representación más precisa de la biología de los mamíferos en comparación con los cultivos celulares tradicionales2D. Además, uno de los principales beneficios es la ventaja ética, ya que los organoides reducen la necesidad de modelos animales, abordando preocupaciones relacionadas con la experimentación enanimales 12,13. Además, los organoides ofrecen una plataforma para el cribado de fármacos de alto consumo, mejorando la predicción de la eficacia y toxicidad del fármaco. Sin embargo, también existen varios desafíos asociados al uso de organoides. Aunque son más realistas que los cultivos 2D, no replican completamente la complejidad e interacción de órganos enteros dentro de un organismovivo 14. Además, puede observarse una variabilidad significativa entre organoides, incluso cuando se derivan del mismo tipo de células, lo que lleva a inconsistencias en los resultadosexperimentales 15. Por tanto, cultivar organoides de manera robusta y reproducible es esencial y requiere habilidades técnicas avanzadas, equipos especializados y protocolos detallados.

El sistema nervioso es una red compleja responsable de coordinar acciones y procesar la información sensorial enviando y recibiendo señales por todo el cuerpo, controlando y coordinando así todas las funciones necesarias, incluyendo el movimiento, la sensación, el pensamiento y las funciones autónomas como el latido cardíaco y la digestión. El precursor del sistema nervioso central, compuesto por el cerebro y la médula espinal, es el tubo neural. Es fundamental comprender cómo se forman y funcionan las estructuras neuronales en el desarrollo temprano del tubo para obtener información sobre diversos trastornos neurológicos y anomalías del desarrollo. Los trastornos del neurodesarrollo son difíciles de estudiar in vivo, especialmente cuando provienen de sujetos humanos debido a cuestiones éticas. Los organoides neurales, como los organoidescerebrales 16,17, han mejorado significativamente la comprensión del desarrollo y las enfermedades del sistema nervioso al proporcionar modelos versátiles y accesibles que imitan estrechamente el tejido cerebral humano. Estas estructuras tridimensionales, derivadas de células madre pluripotentes (PSCs), replican varios aspectos del desarrollo cerebral, incluyendo la formación de regiones cerebrales distintas, la diversidad celular y redes neuronalescomplejas 16,18,19. Al permitir a los investigadores observar las etapas del desarrollo en tiempo real y estudiar mecanismos reguladores clave, estos organoides ofrecen una visión profunda del desarrollo cerebral normal. Los organoides cerebrales también permiten modelar enfermedadesneurodesarrollativas 19 yneurodegenerativas 20, como microcefalia 16,21, infección por virusZika 22, trastornos del espectroautista 23, entre otras, dilucidando mecanismos de enfermedades e identificando posibles objetivos terapéuticos. Además, los organoides cerebrales sirven como plataformas valiosas para la prueba y desarrollo de fármacos, facilitando la evaluación de la eficacia y toxicidad de los fármacos en un entorno similar al del cerebro humano y acelerando los enfoques de medicina personalizada. Además, proporcionan un entorno controlado para estudiar las interacciones gen-entorno, mejorando la comprensión de enfermedades complejas resultantes de la interacción de factores genéticos y ambientales. Sin embargo, dado que los organoides neurales, al igual que los organoides cerebrales, suelen formarse a partir de agregados celulares, a menudo presentan una heterogeneidad celular y variabilidad significativas en los resultados experimentales, lo que a su vez influye en la interpretabilidad de los datos generados, suponiendo un desafío considerable paralos investigadores 17. Por esta razón, la optimización de protocolos y los criterios precisos de control de calidad son fundamentales para la atenuación de datos valiosos que representan adecuadamente la condición in vivo.

Meinhardt ysus colegas 24 tuvieron un impacto crucial al informar primero de un protocolo clonal de organoides neuronales que imita el desarrollo temprano del tubo neural, formado a partir de células madre embrionarias individuales (CES) que minimiza drásticamente la heterogeneidad interorganoide. Esta innovación permite a los investigadores estudiar procesos y mecanismos del desarrollo, así como patrones neuronales, en un entorno preciso y definido con una resolución excepcional. Hasta ahora, muchos laboratorios han desarrollado organoides neurales, en su mayoría de origen ratón o humano, que imitan diferentes partes del tubo neural y su desarrollo, como se resume en25. Sin embargo, según la información disponible, el protocolo establecido por Meinhardt et al.24 es el único método en el que los NTOs se forman de forma fiable a partir de una sola célula, se autoorganizan y se desarrollan de forma eficiente en destinos dorsoventrales tras un único pulso global de ácido retinoico (AR) sin añadir otros factores ventralizantes como el Sonic Hedgehog Agonist (SAG)26, o el uso de cámaras microfluídicas que proporcionan información espacial debido a la formación de gradientes. El protocolo aquí proporcionado fue adaptado de Meinhardt et al.24 según lo proporcionado en Krammer et al.26. En este protocolo, las ESC de ratón individual se siembran en una matriz de cultivo celular y se exponen a condiciones de neurodiferenciación definidas. En dos días, estas células se expanden y epitelizan clonalmente, formando una estructura 3D redonda a elipsoide con un solo lumen y células estratificadas apical-basal que la rodean. En el segundo día, un pulso global de 18 horas de la molécula de señalización AR mejora la diferenciación neuronal, posterioriza los NTO desde el mesencéfalo hasta los niveles del cerebro posterior/médula cervical, e induce la formación de una única placa de suelo funcional para el día 6, que modela el NTO de ventral a dorsal.

El protocolo optimizado ofrece varias ventajas clave. Permite una epitelialización robusta en los primeros tres días y genera tejidos esféricos relativamente pequeños de aproximadamente 200 μm de diámetro, cada uno con un solo lúmen. Los organoides surgen clonalmente a partir de células individuales y se mantienen en un medio de cultivo definido químicamente sin suero. En seis días, se logra una diferenciación neuronal gradual a partir de cultivos pluripotentes, lo que da lugar a organoides que muestran una identidad mesencéphale anterior al día 6 y estructuras dorsoventrales similares a las de la médula espinal posterior o cervical tras un pulso globalde ARS 26.

Se han adaptado varios aspectos que difieren del protocolooriginal 22,25 para mejorar la reproducibilidad y el rendimiento. Estas incluyen condiciones modificadas de cultivo de ESC, un número reducido de células de entrada, un medio de diferenciación mejorado y un protocolo de diferenciación ajustado que omite la suplementación de Noggin durante los días 0-2 (ya usado en26). Además, la densidad de siembra se ha optimizado para su uso en placas de 96 pozos, permitiendo un análisis de alto rendimiento. En conjunto, estos refinamientos han llevado a un aumento del 40% en la formación y eficiencia de patrones de NTO, desde inicialmente un ~40%24 hasta ahora un ~80%26 en la versión actualizada.

Aquí (Figura 1), se proporciona una descripción detallada de un protocolo optimizado que permite una generación robusta y reproducible de NTOs en la matriz de cultivo celular. El protocolo abarca todas las etapas del manejo de NTO, desde la siembra inicial de los ESC para ensayos de diferenciación hasta el mantenimiento, fijación y análisis posteriores. También incluye directrices para el control de calidad mediante la evaluación visual diaria de la morfología de los NTO, así como la caracterización crítica de la identidad organoide mediante tinción por anticuerpos para verificar el patrón correcto y la diferenciación neuronal. Además, se ofrecen enfoques integrales de resolución de problemas, que permiten una evaluación crítica en cada paso del protocolo, lo cual es necesario para garantizar la reproducibilidad y fiabilidad de los protocolos experimentales. Estas instrucciones detalladas ayudan a identificar y resolver posibles problemas, minimizar errores y optimizar los resultados. Esto es crucial para mantener la integridad de los experimentos científicos y permitir que otros científicos replicen con éxito el trabajo y saquen conclusiones completas a partir de los datos generados, avanzando así en el campo.

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Figura 1: Visión general del protocolo. (A) Paso de ESCs (véase el paso 1.1). (B) Aliquotar la matriz de cultivo celular y sembrar ESCs individuales para diferenciación en NTOs (véase el paso 1.2). (C) Alicotizando la AR y el tratamiento de la AR (véase el paso 2). (D) Extirpación de la artritis reumatoide y rutina diaria de reemplazo de la media (véase el paso 3). Esta figura fue creada con BioRender.com. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Protocolo

NOTA: Revisa diariamente las células y los NTOs para evaluar la calidad antes de cualquier procedimiento adicional (reemplazo de medio, tratamiento, fijación, etc.). Todos los procedimientos que requieran exposición directa de las células al aire deben realizarse dentro de un gabinete de bioseguridad para garantizar la esterilidad y evitar la contaminación del cultivo.

1. Mantenimiento, paso y siembra de ESCs de ratones para diferenciación NTO

  1. Pases
    1. Mantener las ESCs en platos de cultivo celular o pozos de una placa de 6 pozos pre-recubierta con gelatina al 0,15% durante 30 minutos a 37 °C.
    2. Pasos ESC cada 2-3 días, con reemplazo diario de la media a partir del segundo día.
    3. Precalentar todos los reactivos (medio, PBS, solución enzimática) a un mínimo de 21 °C y un máximo de 37 °C antes de su uso.
    4. Comprobar las células bajo microscopio de contraste de fase (véanse imágenes representativas, Figura 2). Asegúrese de que las colonias tengan un tamaño y morfología adecuados (Figura 2A), al tiempo que se confirme que se adhieren al fondo del plato.
      NOTA: Descarta el cultivo si más del 10% de los ESCs de ratón están diferenciados (Figura 2B) y prepara un cultivo recién descongelado, que deberías pasar al menos dos veces antes de sembrar ESCs para un ensayo de diferenciación. Investigadores experimentados pueden juzgar mediante evaluación visual (véase también Mulas et al.28) o mediante tinción por anticuerpos para la expresión de marcadores (por ejemplo, OCT4, véase también Ying et al.29).
    5. Abre la tapa del plato de cultivo, inclínalo ligeramente y aspira cuidadosamente el medio. Mantén las células fuera de la incubadora el menor tiempo posible. Mantén las células sin medio el menor tiempo posible para evitar que el cultivo se reseque.
    6. Lavar las colonias con 500 μL de PBS precalentado (añadir a las células en un solo pozo de una placa de 6 pozos) y aspirar inmediatamente de nuevo.
      NOTA: Este paso es crucial porque: i) debe evitarse la transferencia del medio ESC (2iLIF) antes de que el ensayo de diferenciación (o la formación de NTO se vea dificultada), ii) FBS o BSA en medio de cultivo pueden detener la disociación. Esto se aplica a los ESCs cultivados en un medio ESC diferente, que contienen FBS o BSA.
    7. Añade 500 μL de solución enzimática precalentada y transfiere las células de nuevo a la incubadora.
    8. Incuba las células a 37 °C durante 3 minutos usando un temporizador.
    9. Tras el tiempo de incubación, saca la placa y revisa las células bajo el microscopio de contraste de fase.
      NOTA: Los ESC deberían haberse desprendido de la placa de cultivo; si no, golpea el plato/plato con firmeza pero con cuidado (Figura 2C).
    10. Añade 1 mL de medio N2B27 (Tabla 1) pipeteándolo directamente sobre las celdas.
      NOTA: Al preparar el medio (N2B27), la glutamina se conserva un máximo de 5-10 minutos a 37 °C, y preferiblemente a temperatura ambiente. Los ESCs deben lavarse del plato, dejando zonas 'vacías' en el plato de cultivo.
    11. Usa una pipeta P1000 e inclina ligeramente la placa para que todas las colonias que se adhieran al plato de cultivo puedan lavarse.
    12. Para disociar los grupos de células, inclina ligeramente la placa, coloca la punta de la pipeta (P1000) en el centro de la placa, presiona la punta contra la parte inferior de la placa pero ligeramente fuera del eje perpendicular y limpia las células. Repite entre cinco y diez veces para romper los grumos celulares.
    13. Comprueba que las células estén correctamente disociadas en células individuales bajo el microscopio de contraste de fase (Figura 2D) y repite si aún quedan grumos.
    14. Tras la disociación completa, transfiere la suspensión celular a un tubo cónico cónico limpio y estéril de 15 mL, lava el pozo vacío donde se cultivaron las células con 1 mL de medio N2B27 y transfiere al mismo tubo cónico de centrífuga con la suspensión celular.
    15. Centrifuga las pilas durante 5 minutos a 453 x g en una ultracentrífuga.
    16. Aspira cuidadosamente el sobrenadante.
    17. Resuspender las células en una cantidad adecuada de medio N2B27 (por ejemplo, 1 mL) y contar las células (véase la Tabla 2 para los números celulares recomendados para el ensayo de diferenciación en NTOs).
  2. Diferenciación de las ESC en organoides de tubos neuronales (NTO)
    1. Aliquotando matriz de cultivo celular
      1. Descongela el frasco de matriz de cultivo celular durante la noche sobre hielo a 4 °C (nunca a temperatura ambiente ni descongelado a mano). No dejes la matriz de cultivo celular a 4 °C más tiempo del necesario; Aliquot y congela lo antes posible para preservar su funcionamiento.
      2. En el armario de bioseguridad, coloca tubos de microcentrífuga de 1,5-2 mL sobre hielo para preenfriarlos, mientras mantienes la botella de matriz de cultivo celular sobre hielo fresco.
      3. Mezcla cuidadosamente la matriz de cultivo celular descongelada para evitar la formación de burbujas, ya que las burbujas pueden causar desprendimiento del pozo o plato tras la gelatina.
      4. Matriz de cultivo celular alicuota al volumen deseado (se recomienda 0,5-1 mL) y congelar a -20 °C hasta su uso adicional. Evita reemplazar la punta entre las alicuotas, ya que las puntas a temperatura ambiente pueden hacer que la matriz de cultivo celular se solidifique en su interior, lo que puede provocar una pérdida significativa. En su lugar, enfría las puntas de la pipeta a 4 °C guardándolas en la nevera antes de usarlas.
    2. Siembra de células individuales en una matriz de cultivo celular
      1. Cuantifique el número de células necesarias (matriz de cultivo celular de 100 células/μL, véase la Tabla 2).
      2. Transfiere el número de celda adecuado (suspensión de celda) a un tubo de centrífuga cónico limpio de 15 mL y rellena con 1 mL de N2B27.
      3. Centrifuga las celdas durante 5 minutos a 453 x g en la centrífuga.
      4. Aspira el sobrenadante y coloca el tubo cónico de la centrífuga sobre hielo.
      5. Suspende cuidadosamente la pelota celular sobre hielo en una cantidad adecuada de matriz de cultivo celular descongelada y líquida, evitando la formación de burbujas.
      6. Extiende la cantidad adecuada de suspensión matriz de cultivo celular, en una capa fina, sobre un plato de fondo de vidrio o de plástico que sea óptimo para la imagen (véase Tabla 2, Figura 3A-C), sin tocar las paredes de placas de varios pozos. Debido a la alta tensión superficial, la gota de la matriz de cultivo celular puede desplazarse desde el centro del pozo hasta las paredes si se han tocado previamente, lo que provoca una distribución inadecuada de las células o NTOs.
        NOTA: Si se usan placas de varios pozos: primero dibuja un círculo de matriz de cultivo celular usando una punta de pipeta P20 (96 pozos) o P200 antes de 'llenarla' con la suspensión matriz de cultivo celular (Figura 3B).
      7. Coloca la placa/plato de varios pozos en la incubadora a 37 °C para que la matriz de cultivo celular se solidifique. Estima 1 min por μL de matriz de cultivo celular para cantidades menores y un máximo de 15 min para 40 μL o más.
      8. Tras el tiempo de incubación, saca la placa y añade un volumen adecuado de medio (véase la Tabla 2). Los ESCs en la matriz de cultivo celular no deben secarse durante la siembra para el ensayo de diferenciación en NTOs ni al reemplazar el medio. Tras la gelatina, el medio debe aplicarse lo antes posible. La gelatinificación suele completarse en 1 minuto a 37 °C por matriz de cultivo celular de 1 μL y un máximo de 15 minutos para una matriz de cultivo celular de 40-100 μL cuando se extiende como una capa delgada.
        NOTA: Para evitar que las ESC se sequen en la matriz de cultivo celular, manejar un máximo de 8 pozos de una placa de 96 pozos con una pipeta multicanal o un plato/pozo de fondo de cristal de 35 mm de cualquier otra placa de varios pozos. Mantén las células fuera de la incubadora el menor tiempo posible.
      9. Comprobar la densidad de siembra y la distribución celular dentro de la matriz de cultivo celular con el microscopio de contraste de fase (Figura 3C,D). Se recomienda la densidad óptima de siembra (Tabla 2 y Figura 3). Sin embargo, para ciertas aplicaciones, como el análisis temprano, una densidad de siembra hasta 10 veces mayor puede ser ventajosa.
        NOTA: Mezcle cuidadosamente la suspensión de matriz de cultivo celular resuspendiéndola con una punta de pipeta P300 o P1000 antes de sembrar para el ensayo de diferenciación que contrarreste la variabilidad del número de células entre pozos o platos. Este paso no se recomienda antes de sembrar todos los pozos para protegerse de la pérdida de la matriz de cultivo celular, ya que esto puede solidificarse y adherirse a la punta de la pipeta.

Tabla 1: Componentes medios (base N2B27, 2iLIF, N2B27diff). Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Información sobre el número de celdas por plato, la cantidad de matriz de cultivo celular, el volumen del medio y el tiempo de gelatinificación. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

2. Tratamiento de la AR de las NTOs para mejorar la diferenciación neural e inducir la posteriorización y ventralización

  1. Ácido retinoico (AR) con alicuación
    1. Lleva el polvo de AR totalmente trans a temperatura ambiente (almacenado a -20 °C).
    2. Reconstituir el polvo en un volumen adecuado de DMSO para alcanzar una concentración final de 100 mM.
    3. Alitera 1 μL de 100 mM de AR en un vial de 1,5 mL con tapa de rosca cada uno.
    4. Añade gas argón hasta que el tubo esté 'lleno'.
      NOTA: Como el gas argón es más pesado que el oxígeno, se hunde al fondo del tubo para cubrir y preservar la AR del aire. Esto se nota en las manos cuando se escapa cuando el tubo está lleno.
    5. Cierra bien el frasco. La AR es muy sensible a la luz y al aire.
    6. Guarda las alicuotas en la oscuridad a -80 °C hasta que se use de nuevo. Alternativamente, la AR reconstituida puede almacenarse en tubos microcentrífugas de 1,5 mL en el líquido N2.
      NOTA: La AR reconstituida y diluida puede almacenarse en la nevera cuando se cubre con papel de aluminio durante un máximo de 2 días.
  2. Tratamiento de AR de NTOs durante 18 horas (Figura 4A)
    1. Saca 1 μL de la alicota con una concentración de 100 mM de -80 °C y mantenla a oscuras hasta que se descongele a temperatura ambiente (por ejemplo, en la palma de la mano o en un soporte de tubos en un armario de bioseguridad sin luces encendidas).
      NOTA: Si se almacenan alicotas de ARA en el líquido N2, abra inmediatamente la tapa del tubo de la microcentrífuga para evitar la explosión del tubo, luego ciérrelo de nuevo y proceda al paso 2.2.2.
    2. Una vez descongelado, añade 400 μL de medio N2B27diff precalentado para una concentración de 250 μM usando una pipeta P1000. Mezcla bien para lograr homogeneidad.
      NOTA: Alternativamente, la AR puede reconstituirse y diluirse en DMSO puro en lugar de medio N2B27diff, aunque esto aumenta la concentración de DMSO en el cultivo. Al preparar el medio (N2B27diff), la glutamina se conserva un máximo de 5-10 minutos a 37 °C, y preferiblemente a temperatura ambiente.
    3. Saca platos o platos que cultivan NTOs de la incubadora y colócalos en un armario de bioseguridad estéril.
    4. Examina los NTOs en crecimiento bajo el microscopio de contraste de fase. La morfología de las NTOs es crucial para proporcionar información sobre la viabilidad del cultivo y la eficacia del experimento (Figura 4B-D).
    5. Quita la tapa del plato o plato e inclina ligeramente el plato hacia un lado. Aspira el medio con cuidado, ya sea usando una pipeta P200 o un aspirador, sin alterar la matriz de cultivo celular. Mantén los NTO sin medio lo más breve posible para evitar que se resequen el cultivo y/o la mezcla de cultivo celular.
    6. Añadir un volumen adecuado de N2B27diff complementado con una solución de 250 nM de RA (véase la Tabla 2), cubrir con la tapa y transferir los NTOs de nuevo a la incubadora.
      NOTA: A veces, especialmente si la AR no se mezcló completamente, pueden formarse precipitados que son más difíciles de disolver en N2B27diff normal. En este caso, descarta la alicota y haz alicotas frescas de AR, ya que estos precipitados tienen una concentración desconocida e incontrolada de AR.

3. Extirpación de la AR y rutina de reemplazo diario de los NTOs de la media

  1. Transfiere la placa de cultivo desde la incubadora al gabinete estéril de bioseguridad.
  2. Quita la tapa y inclina ligeramente la placa hacia un lado.
  3. Aspira cuidadosamente N2B27diff que contiene AR, ya sea usando una pipeta P200 o aspirador, sin tocar la matriz de cultivo celular.
  4. Añade PBS precalentado (usa el volumen suficiente para cubrir la gota de la matriz de cultivo celular o como se menciona en la Tabla 2), luego inclina la placa de nuevo y retírala con cuidado para eliminar la AR sobrante.
  5. Añade un volumen adecuado de N2B27diff (como se menciona en la Tabla 2), pipeteando el medio a lo largo de la pared del pozo/plato para evitar dañar la gota de la matriz de cultivo celular.
  6. Sustituye el medio diariamente siguiendo los pasos 3.1-3.3, luego añade suavemente N2B27diff fresco y precalentado pipeteando el medio en la pared del pozo/plato antes de devolver los NTOs a la incubadora. El pipeteo directo y vigoroso o la adición de medio frío/PBS sobre la gota de la matriz de cultivo celular puede causar su rotura y desprendimiento de la placa/plato.
    NOTA: Al perturbar vías utilizando moléculas pequeñas o proteínas recombinantes, es importante reemplazar el medio diariamente. Si se va a aplicar los fármacos durante más de un día, las soluciones deben prepararse de forma fresca a diario o al menos cada dos días para garantizar la estabilidad de proteínas y fármacos y la presencia continua de concentraciones correctas.

4. Fijación de los NTOs

NOTA: Los NTOs se corrigen tal y como lo describen Krammer et al.26. Dependiendo del anticuerpo que se utilice posteriormente, puede requerirse PFA de diferentes fuentes (compradas en tienda, internas, etc.).

  1. Descongelar la alicota PFA a 4 °C durante la noche.
  2. Lleva el PFA a temperatura ambiente antes de usarlo.
  3. Si se utiliza una concentración mayor de PFA, diluir el PFA al 4% en medio N2B27diff o PBS en una capucha química.
  4. Saca los NTOs de la incubadora y transfírelos a una campana química.
  5. Abrir la tapa y añadir un 4% de PFA en una proporción de 1:1 directamente a los NTOs para lograr una concentración final del 2% (por ejemplo, 100 μL de PFA al 4% añadidos a los 100 μL de N2B27diff en la placa de 96 pozos).
  6. Vuelve a poner la tapa e incuba los NTOs durante 30 minutos a temperatura ambiente. Establece un temporizador, ya que una fijación prolongada puede afectar el rendimiento de ciertos tratamientos con anticuerpos.
    NOTA: El PFA es tóxico y no debe inhalarse. Trabaja con cuidado y con precaución bajo el capó químico. Algunos anticuerpos requieren el uso de un PFA específico o un tiempo de fijación más corto/optimizado.
  7. Tras 30 minutos, quita la tapa e inclina ligeramente la placa hacia un lado, luego sigue los pasos 3.3-3.4.
  8. Añade cuidadosamente PBS precalentado (utilice el volumen suficiente para cubrir la gota de la matriz de cultivo celular o como se menciona en la Tabla 2) e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente. Repite este paso 3 veces para eliminar todo el PFA que quede.
  9. Tras el lavado final, añade una cantidad adecuada de PBS (véase la Tabla 2), sella la placa con parafilm y guárdala a 4 °C hasta su uso adicional.

5. Tinción por anticuerpos de NTOs

  1. La tinción por anticuerpos es una herramienta valiosa para evaluar la identidad correcta de las NTOs, así como el éxito del ensayo/experimento. La tinción por anticuerpos puede realizarse como se explica en Meinhardt et al.24 y Krammer et al.26.
    NOTA: Si los NTO parecen subóptimos (Figura 4E-G) o no muestran la expresión correcta del marcador espaciotemporal (Figura 5 a Figura 7), descarte el material porque no cumple con los estándares de calidad.
  2. Mantén el bloque/solución de permeabilización (1x PBS con 1% de BSA y 0,5% de Triton-X) a 4 °C y adapta a la temperatura ambiente antes de usarla.
  3. Para una reconstitución y análisis 3D completos, mantén los anticuerpos (1 y 2 segundos) a 4 °C durante al menos 1, pero preferiblemente 2-3 noches, para asegurar una buena penetración de anticuerpos.
    NOTA: El anticuerpo Alexa Fluor anti-5612nd podría proporcionar una señal de fondo más fuerte en la matriz de cultivo celular durante los tres primeros días del ensayo de diferenciación.

6. Despeje de NTOs

  1. Prepárate para limpiarel 26
    1. Completa el proceso de tinción de anticuerpos antes de comenzar el procedimiento de eliminación (asegúrate de que tanto elprimer como el segundo anticuerpos estén incubados y bien lavados).
    2. Añadir propigalato a la solución de limpieza (2 mg de propigalato por ml de solución de limpieza) para minimizar el fotoblanqueamiento de los NTOs.
      NOTA: Realiza el despejamiento 1-2 horas antes de la imagen para evitar la oxidación (el líquido pasa de amarillo claro/crema a amarillo oscuro brillante o incluso marrón) o la cristalización de la solución de limpieza. Si ocurre cristalización, disuelve añadiendo PBS al pozo.
  2. Precauciones sobre pH de la solución y mezcla
    1. Mantener el pH correcto de la solución de limpieza para evitar una oxidación rápida o la disolución de la matriz de cultivo celular.
    2. Evita agitar vigorosamente o mezclar bruscamente la solución para evitar la formación de burbujas de aire.

7. Análisis de NTOs

  1. Preparación para microscopía
    1. Tras completar la tinción por anticuerpos y la limpieza de tejido completo, utiliza un microscopio confocal con objetivos de 10-40x para la imagen.
  2. Evaluación visual
    1. Utiliza la evaluación visual y la cuantificación manual para determinar de forma eficiente si los NTO presentan una expresión adecuada de marcadores neuronales y una organización dorsoventral.
  3. Software de análisis 3D
    1. Para el análisis 3D, utiliza software como CellProfiler28,29, Imaris (File Converter and Viewer) o una herramienta similar para evaluar marcadores espaciales y detalles estructurales.
  4. Verificación de la identidad de la NTO
    1. Confirmar la identidad correcta de las NTOs evaluando la expresión temporal de los marcadores neuronales y la expresión espaciotemporal de marcadores específicos de patrón dorsoventral. Este paso es esencial para asegurar que el ensayo de diferenciación haya tenido éxito antes de realizar investigaciones adicionales.
  5. Aspectos de caracterización: Consulte la Figura 4, así como la Figura 6 y la Figura 7 para verificar los siguientes aspectos críticos del éxito cultural:
    1. Consulte la Figura 4 y la tinción con ZO-1 mostrada en Meinhardt et al.24 para verificar la epitelialización y formación de lumen exitosas.
    2. La diferenciación neuronal exitosa se caracteriza por la regulación a la baja de OCT4 y la regulación al alza de SOX1, seguida de la expresión de β3TUBULINA (detallada en24). Consulte las Figuras 6 y 7 para verificar el éxito de la diferenciación neuronal.
    3. El patrón dorsoventral se confirma por la presencia de una placa ventral FOXA2+/SHH+ y la expresión de PAX3+ en el polo dorsal opuesto (patrón ventral detallado en26). Consulte las Figuras 6 y 7 para verificar el éxito del patrón dorsoventral.

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Resultados

Se utilizaron ESCs de ratón R1 para todos los ejemplos representativos en las figuras presentadas en este manuscrito. Otras ESCs de ratón mencionadas pueden mostrar diferencias leves en el momento de la epitelialización, diferenciación neural o eficiencia de patrones cuando se siembran para NTOs; sin embargo, los resultados no deberían diferir significativamente de los datos mostrados aquí.

Solo los ESCs de buena calidad (Figura 2A

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Discusión

Aquí se presentan varias adaptaciones optimizadoras y mejoras al protocolo original para generar NTOs de alta calidad para facilitar la estandarización entre laboratorios. Las modificaciones clave incluyen diferentes condiciones de cultivo de ESC, reducción del número de células de entrada, mejora del medio de diferenciación, protocolo de diferenciación modificado y ajustes de densidad de siembra para análisis de alto rendimiento utilizando placas de varios pozos. Varios aspectos del pro...

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Divulgaciones

Los autores declaran no haber conflicto de intereses.

Agradecimientos

Queremos agradecer a los miembros actuales y anteriores del laboratorio Tanaka por su apoyo y sus debates en el desarrollo de este protocolo. En especial, agradecemos a A. Pelzl por leer críticamente el manuscrito, aportar aportaciones y ayudar con los esquemas, y a E. Chatzidaki por leer críticamente el manuscrito, editar y apoyar con los esquemas, así como conseguir la financiación del PUD 25 junto con Juergen A. Knoblich. Esta publicación fue financiada por el Fondo Austríaco de Ciencia (FWF): "Proyecto de publicación independiente número PUD 25". Además, este proyecto ha recibido financiación del Consejo Europeo de Investigación (ERC) en el marco del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea (acuerdo de subvención ERC AdG 742046), y del Fondo Austríaco de Ciencia (FWF) [10.55776/ F7803-B] (Modulación de Células Madre). Para efectos de acceso abierto, los autores han aplicado una licencia de copyright público CC BY a cualquier versión de Manuscrito Aceptado por Autor (AAM) derivada de esta presentación.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
35 mm Dish | Sobremesa nº 1.5 | Diámetro de vidrio de 14 mm | Sin recubrimientoCorporación MatTekCat# P35G-1.5-14-C
AccutaseInvitrogenCat# 00-4555-56
Albúmina (BSA) Fracción V (pH 7,0)Panreac AppliChemCat# A1391
Ácido Retinoico All-TransMerckCat# R2625
Suplemento de B-27 (50X), sin sueroGibcoCat# 17504044
Matriz de membrana basal (Matrigel)CorningCat# BDL354234Concentración de proteínas 10 mg/ml 
Microplacas CellCarrier-96 UltraPerkinElmerCat# 6055302
CellProfiler 4Stirling et al. 2021https://cellprofiler.org
CHIR 99021TocrisCat# 4423
CUBIC-R+(N)Matsumoto et al, 2019N/A
DimetilsulfóxidoSigma AldrichCat# D2650
DMEM/F-12, sin glutaminaGibcoCat# 21331020
Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato (DPBS, 1X)GibcoCat# 14190144
Centrífuga Eppendorf 5810 REppendorfCat# 5811000015
Microtubo Eppendorf 3810XMerckGato# EP0030125150
Tubos de centrifugadora cónicos FalconCorningCat# 352095
GelatinaMerckCat# G2500
L-Glutamina (200 mM)GibcoCat# A2916801
Incubadora de CO2 HeracellVIOS 160i, 165 LThermoFisher ScientificGato# 51033557
ImarisOxford Instrumentshttps://imaris.oxinst.com
Microscopio LED invertido de contraste de fase (CKX53)Olimpo
2-Mercaptoetanol (50 mM)GibcoCat# 31350010
Anti-OCT-3/4 monoclonal de ratónSanta Cruz BiotecnologíaCat# SC-5279; RRID:AB_628051Usa 1:200
Anti-PAX3 monoclonal de ratónDSHBCat# PAX3-C; RRID:AB_528426Usa 1:100
Anti-SHH monoclonal de conejoTecnologías de señalización celularCat# 2207; RRID:AB_2188191Usa 1:300
Conejo monoclonal anti-y beta; 3-TubulinaTecnologías de señalización celularCat# 5568; RRID:AB_10694505Usa 1:500
Anti-ZO-1 monoclonal de ratónInvitrogenCat# 33-9100; RRID:AB_2533147Usa 1:200
Mouse LIFQkineCat# Qk018-1000
Suplemento N-2 (100X)GibcoCat# 17502048
Medio neurobasalGibcoCat# 21103049
Paraformaldehído, grado reactivo, cristalinoMerckCat# P6148
PD 0325901TocrisCat# 4192
Solución de penicilina-estreptomicinaGibcoGato# 15140130
Microscopio de contraste de fase
Anti-FOXA2 policlonal de cabraR& DCat# AF2400; RRID:AB_2294104Usa 1:400
Anti-SOX1 policlonal de cabraR& Sistemas DCat# AF3369; RRID:AB_2239879Usa 1:200
Datos de RNA-Seq relacionados con la Figura 6Ishihara et al., 2022GEO: GSE214368
Armario premium de seguridad microbiológica SafeFASTGrupo Dasit MÁS RÁPIDOCat# F00025200000
Piruvato de sodio (100 mM)GibcoCat# 11360070
Microscopio invertido confocal de disco giratorio (IX3)Olimpo
Triton X-100Sigma AldrichCat# 9036-19-5

Referencias

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