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Artículo de método

MEDUSA para la identificación de genes reguladores de la muerte en datos de perfiles quimiogenéticos

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DOI:

10.3791/67892

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7 de febrero de 2025

 , 
1Department of Systems Biology, UMass Chan Medical School

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe cómo utilizar el método analítico MEDUSA para cuantificar el efecto regulador de la muerte de cada gen knockout. Incluye instrucciones sobre cómo determinar las condiciones experimentales que optimizan la sensibilidad y un tutorial paso a paso sobre cómo realizar el análisis.

Resumen

El cribado sistemático de las perturbaciones genéticas de ganancia o pérdida de función puede utilizarse para caracterizar las dependencias genéticas y los mecanismos de regulación de prácticamente cualquier proceso celular de interés. Estos experimentos suelen implicar la elaboración de perfiles a partir de un conjunto de perturbaciones de un solo gen y cómo cada perturbación genética afecta a la aptitud relativa de la célula. Cuando se aplican en el contexto de estudios de eficacia de fármacos, a menudo denominados perfiles quimiogenéticos, estos métodos deben ser eficaces para identificar los mecanismos de acción de los fármacos. Desafortunadamente, los estudios de perfiles quimiogenéticos basados en la aptitud física son ineficaces para identificar todos los componentes de la respuesta a un medicamento. Por ejemplo, estos estudios generalmente no logran identificar qué genes regulan la muerte celular inducida por fármacos. Varios problemas contribuyen a oscurecer la regulación de la muerte en las pruebas de detección basadas en la aptitud física, incluidos los efectos de confusión de la variación de la tasa de proliferación, la variación en la coordinación inducida por el fármaco entre el crecimiento y la muerte y, en algunos casos, la incapacidad de separar el ADN de las células vivas y muertas. MEDUSA es un método analítico para identificar genes reguladores de la muerte en datos convencionales de perfiles quimiogenéticos. Funciona mediante el uso de simulaciones computacionales para estimar las tasas de crecimiento y mortalidad que crearon un perfil de aptitud observada en lugar de puntuar la aptitud en sí. El uso efectivo del método depende de la valoración óptima de las condiciones experimentales, incluida la dosis del fármaco, el tamaño de la población inicial y la duración del ensayo. Este manuscrito describirá cómo establecer un estudio de perfil quimiogenético para el análisis basado en MEDUSA, y demostraremos cómo usar el método para cuantificar las tasas de mortalidad en los datos de perfil quimiogenético.

Introducción

En el perfil quimiogenético, las perturbaciones genéticas sistemáticas se utilizan para comprender la contribución de cada gen a una determinada respuesta a un fármaco 1,2,3. Estos experimentos son valiosos y pueden revelar información importante sobre las respuestas a los fármacos, incluido el objetivo de unión del fármaco y los mecanismos de entrada/eflujo del fármaco. Sin embargo, debido a que estos experimentos generalmente se realizan de manera combinada para evaluar todos los genes simultáneamente, la generación de conocimientos mecanicistas a partir de los datos de perfiles quimiogenéticos puede ser un desafío.

Los mecanismos de control y las dependencias genéticas para la muerte celular inducida por fármacos tienden a ser difíciles de resolver en los datos de perfiles quimiogenéticos. Hay varias razones para este problema, pero muchas de ellas se derivan de los impactos de la variación en la proliferación celular4. Por ejemplo, debido a que las células proliferan exponencialmente, el efecto de una perturbación genética en la tasa de proliferación tiene un mayor impacto en el tamaño de la población que el cambio en las tasas de mortalidad celular. Además, debido a que esta sensibilidad sesgada se exacerba con el tiempo y debido a que estos experimentos generalmente se realizan durante varias semanas, la mayoría de los estudios están optimizados para ser altamente sensibles a los defectos de proliferación y esencialmente insensibles a los cambios en la muerte celular inducida por fármacos. Otras cuestiones relacionadas con la proliferación incluyen la coordinación variada entre la proliferación y la muerte (por ejemplo, qué tan rápido crece cada clon mientras también muere, y si esto varía entre las perturbaciones genéticas) y las variaciones en las tasas de proliferación para cada clon en ausencia de un medicamento, lo que cambia el número esperado de células que deberían/podrían haberse recuperado si el medicamento no fuera efectivo. La conclusión es que los experimentos de perfiles quimiogenéticos generalmente califican el impacto de las perturbaciones genéticas utilizando mediciones que son proporcionales al tamaño relativo de la población, comparando poblaciones tratadas y no tratadas. Debido a que el tamaño de la población es un producto tanto del crecimiento celular como de las tasas de muerte celular, desde la perspectiva de la muerte celular, la proliferación representa una influencia confusa.

Para remediar estos problemas, creamos un Método para Evaluar la Muerte Utilizando un Enfoque Asistido por Simulación (MEDUSA)5. MEDUSA trabaja interpretando los datos de tamaño relativo de la población observados a través de la lente de simulaciones computacionales para inferir la combinación de las tasas de crecimiento y mortalidad inducidas por fármacos que generaron la respuesta observada a los fármacos para cada clon genético. Los datos previos sugieren que el método puede inferir con precisión cómo las perturbaciones genéticas afectan la tasa de mortalidad inducida por fármacos, pero la precisión de este método depende de una comprensión detallada de cómo la proliferación celular y la muerte celular son coordinadas por un fármaco y cómo estas tasas varían con el tiempo 5,6. Además, las inferencias basadas en MEDUSA requieren que se pruebe un fármaco en una dosis que cause una muerte celular sustancial. Es importante destacar que estas condiciones de farmacograma crean preocupaciones adicionales sobre el tamaño de la población inicial y la duración de los ensayos, que deben considerarse y optimizarse cuidadosamente. En este protocolo, describimos cómo establecer un estudio de perfil quimiogenético para el análisis basado en MEDUSA y proporcionamos un uso detallado de este método analítico. El objetivo general de MEDUSA es determinar cómo la deleción de cada gen afecta las tasas de crecimiento y mortalidad inducidas por fármacos.

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Protocolo

1. Optimización de la dosis del fármaco para inducir la muerte celular

NOTA: El siguiente protocolo es para optimizar una combinación de línea celular, fármaco y dosis utilizando el ensayo FLICK 7,8. Los datos de ejemplo para este protocolo describen la optimización y el cribado de 5 μM de etopósido en células U2OS, pero los mismos pasos de optimización podrían aplicarse a cualquier otra combinación deseada de línea celular y fármaco/dosis. Este protocolo no requiere la recolección o análisis de células muertas. Este protocolo se puede utilizar para cultivos en suspensión, siempre que se eliminen las células muertas. En el caso de los cultivos en suspensión, las células muertas pueden clasificarse/separarse utilizando un marcador de viabilidad o un marcador específico de muerte celular.

  1. Antes de realizar un ensayo FLICK, optimice el número de células, la permeabilización de Triton-X, la concentración de SYTOX y la adquisición del lector de placas utilizando el protocolo detallado descrito en elpunto 8.
  2. Celdas de placa en placas negras de 96 pocillos de fondo transparente. Las densidades típicas de siembra son de 1500-5000 células por pocillo, y este número debe optimizarse por línea celular. Incubar las células a 37 °C con 5% de CO2 y humedad durante 16-24 h.
  3. Prepare las diluciones del fármaco en medios que contengan la concentración de SYTOX que se identificó como óptima en el paso (1.1). Por lo general, los medicamentos se prueban en una serie de diluciones logarítmicas que contienen de 8 a 12 dosis biológica o clínicamente relevantes.
    NOTA: Ciertos fármacos pueden emitir fluorescencia a la misma longitud de onda que SYTOX, lo que hace imposible la cuantificación con este ensayo. En tales casos, podría ser beneficioso utilizar variantes de SYTOX que emiten fluorescencia a diferentes longitudes de onda. Además, este ensayo no puede evaluar la reacción a los fármacos que afectan a la fluorescencia de SYTOX o evitan que SYTOX se una al ADN.
  4. Lisar una placa (T0) usando Triton-X a la concentración optimizada en el paso (1.1). Después de la lisis celular, utilice un lector de placas para medir la fluorescencia de SYTOX y determine el número total de células iniciales en función de la relación empíricamente establecida entre la fluorescencia y el número de células (consulte el protocolo FLICK 7,8).
  5. Mida la fluorescencia de SYTOX en las placas experimentales en T0 utilizando un lector de placas, con los ajustes optimizados en el paso (1.1).
  6. Monitoree la señal de SYTOX a lo largo del tiempo durante tres días. Para restringir los datos cinéticos resultantes, utilice al menos tres puntos de tiempo al día, cada uno con 4 horas de diferencia.
    NOTA: Este protocolo evalúa la muerte celular y el crecimiento durante 3 días. Este período de tiempo suele ser suficiente para los fármacos que inducen la muerte; Sin embargo, el ensayo puede acortarse o alargarse para adaptarse a los fármacos con cinéticas de muerte alternativas.
  7. Después del punto de tiempo final, lise la(s) placa(s) experimental(es) con Triton-X para determinar el tamaño final de la población de cada condición.
  8. Calcule la viabilidad fraccional (FV) y ajuste los datos del punto final a las curvas de dosis, como se describe en el protocolo FLICK 7,8.
  9. Identificar las dosis de fármacos que inducen aproximadamente el 50% de la muerte celular mediante la evaluación de las curvas de dosis de FV.
    NOTA: La identificación de células muertas por SYTOX requiere tanto la ruptura de la membrana plasmática como la ruptura de la envoltura nuclear. Estas membranas necesitan un mantenimiento continuo, por lo que SYTOX identificará las células muertas independientemente del mecanismo de muerte celular inducido por el fármaco. Sin embargo, estos procesos no ocurren con la misma efectividad para todas las formas de muerte celular, lo que podría influir en la capacidad de SYTOX para medir las células muertas con precisión. Además, los diferentes mecanismos de muerte celular producirán cadáveres celulares de diferentes estabilidades. Sin embargo, hemos encontrado que todas las formas de muerte celular probadas hasta ahora resultan en ADN unido a SYTOX (ya sea dentro de un núcleo permeabilizado o en los medios de cultivo celular). Esta señal de SYTOX es generalmente estable a lo largo de un ensayo de 72 h, pero se puede monitorizar evaluando el número total de células al principio y al final del ensayo.

2. Selección de la longitud del ensayo

  1. Utilizando los datos FLICK recopilados en el paso 1, calcule la fracción letal (LF) de cada condición a lo largo del tiempo como se describe en el protocolo FLICK 7,8. Ajuste los datos cinéticos de LF a un modelo de muerte exponencial retardada (LED), como se describió anteriormente9.
  2. Trace la LF a lo largo del tiempo para cada dosis letal identificada en el paso 1. Seleccione una dosis y un punto de tiempo que produzca ~50% de LF.
    NOTA: Una fracción letal de ~50% enriquece las señales fuertes y específicas de la muerte en los datos de detección de CRISPR, al tiempo que deja suficientes células vivas para mantener la representación de la biblioteca5. Sin embargo, algunos fármacos estarán limitados por la precedencia de la literatura o por un rango estrecho de dosis que inducen un fenotipo deseado específico. Si se restringe la dosis, el criterio de valoración del ensayo debe acortarse o ampliarse para garantizar que la dosis deseada alcance el ~50% de LF. Si no es posible una letalidad del 50%, puede ser necesario aumentar el tamaño de la población inicial.

3. Determinación del tamaño de la población inicial

  1. Seleccione la dosis de fármaco deseada para optimizar aún más el cribado en función de la optimización anterior.
  2. Celdas de placas en placas de 10 cm en medios completos. Cada condición debe estar sembrada con triplicados técnicos y suficientes réplicas biológicas para que las células puedan contarse cada 12-24 h a lo largo de la pantalla, incluido el punto de tiempo T = 0.
    NOTA: Es posible que sea necesario optimizar el número de células plateadas por separado para las células tratadas y no tratadas, teniendo en cuenta la tasa de crecimiento neto de la población y el tamaño de las células. Por lo general, las células deben sembrarse a densidades que den lugar a una confluencia que no comprometa la salud de las células en el punto final del ensayo (es decir, para muchos tipos de células < 80% de confluentes). Las células tratadas y no tratadas también se pueden replatear durante la pantalla, si es necesario, siempre que se mantenga la representación de la biblioteca.
  3. Incubar las células durante la noche a 37 °C con 5% de CO2.
  4. Agregue el medicamento a la concentración deseada a las placas de tratamiento. Paralelamente, recoja células de 3 placas no tratadas y cuente el número de células vivas con un hemocitómetro. Tiñe las células muertas con azul de tripán (o un tinte de viabilidad comparable) para asegurarte de que solo se cuenten las células vivas. Estos datos establecen el número de celdas en el punto de tiempo T = 0.
  5. Después de 12-24 h, recoja las células de 3 placas no tratadas y 3 tratadas y cuente el número de células vivas. Repita la recolección hasta que se alcance el punto final del ensayo. Para comprender completamente la cinética del fármaco y de la muerte celular, se recomienda que las células vivas se monitoreen durante 24-48 horas después del punto de tiempo identificado en el paso (2.2).
  6. Visualice los cambios en la viabilidad trazando el tamaño de la población (eje Y) a lo largo del tiempo (eje X).
    NOTA: Sobre la base del número máximo de células observado y el tamaño final de la población, se puede hacer una estimación aproximada de la fracción letal en el punto final. Esto debe compararse con los datos de viabilidad fraccional y fracción letal generados mediante el ensayo FLICK (paso 1.9 y paso 2.2) para garantizar que se logre la cantidad esperada de muerte celular.
  7. Identifique el punto de tiempo con el tamaño de población más pequeño. Dependiendo de la cantidad de crecimiento que se produzca en presencia del fármaco, este será al principio o al final de la pantalla CRISPR.
  8. Seleccione un tamaño de población inicial. Asegúrese de que el número inicial de celdas esté optimizado para mantener una cobertura de biblioteca mínima de 500x-1000x en toda la pantalla.
    NOTA: Por ejemplo, la biblioteca TKOv3 tiene 70.948 sgRNAs. Para representar esta biblioteca con una cobertura de 500x, se deben mantener no menos de 35.474.000 células por réplica por condición durante todo el ensayo. Este cuello de botella en el tamaño de la población a menudo se encuentra al comienzo del ensayo o después de la tripsinización y la reducción de muestreo para afecciones no tratadas o proliferantes. Por el contrario, el tamaño de la población del cuello de botella a menudo está dictado por el tamaño de la población en el criterio de valoración del ensayo para los tratamientos farmacológicos que inducen una letalidad sustancial.
  9. Si lo desea, repita la optimización anterior en las placas que se utilizarán para la pantalla CRISPR (por ejemplo, placas de 15 cm) para confirmar que la eficacia del fármaco escala correctamente.

4. Realización de la pantalla CRISPR

NOTA: Las células se pueden analizar utilizando métodos de detección CRISPR establecidos después de la optimización de la dosis del fármaco y la duración del ensayo. Los protocolos establecidos, como el protocolo de cribado TKO del laboratorio Moffat 10,11, pueden utilizarse para preparar la biblioteca de cribado CRISPR, producir virus, realizar el cribado CRISPR y preparar las bibliotecas para la secuenciación (Figura 1A-B). El protocolo a continuación describe los pasos específicos del análisis MEDUSA, que debe llevarse a cabo con datos a nivel de recuento después de la secuenciación.

  1. Calcule los cambios de pliegue observados experimentalmente para cada sgRNA (Figura 1C) como se describe a continuación.
    1. Genere una tabla de recuentos a nivel de sgRNA para preparar los datos de secuenciación para el análisis. Recorte y asigne bibliotecas de secuenciación mediante canalizaciones estándar, como se describe 5,12.
    2. Normalice la profundidad de la biblioteca de secuenciación. Normalice las bibliotecas manualmente o mediante funciones integradas como las de DESeq2, como en 5,12. Realice la normalización en todas las guías o mediante la distribución de guías que no sean de segmentación.
    3. Asigne aleatoriamente sgRNAs no dirigidos a genes no dirigidos. Por ejemplo, una biblioteca con cuatro sgRNAs por gen debe tener cuatro sgRNAs no dirigidos por gen no dirigido.
    4. Para cada comparación de interés (sin tratar/T0 y/o tratado/sin tratar), calcule el log2(fold-change). Se recomienda que esto se calcule utilizando un ajuste paramétrico en DESeq2, aunque también se podría realizar un cálculo manual del cambio de pliegue.
    5. Recorte los sgRNAs con un número bajo de recuentos. La estrategia de recorte correcta dependerá del nivel de ruido entre réplicas y de cómo varía a lo largo de los recuentos. Estas características variarán en función de la biblioteca CRISPR y probarán varios puntos de corte en paralelo para obtener nuevos datos. Las estrategias de corte comunes basadas en los precedentes de la literatura incluyen la eliminación del 5% más bajo de las guías o la eliminación de las guías por debajo de algún umbral nominal13.
  2. Determine el impacto de cada gen knockout en la tasa de crecimiento como se describe a continuación.
    1. Calcule la tasa neta de crecimiento poblacional (NPG) de las células no tratadas (es decir, el tiempo de duplicación de la población observado, Figura 1D). Esto se puede extraer de los datos de FLICK en el paso 1, los recuentos de células vivas a lo largo del tiempo en el paso 3 o las mediciones experimentales anteriores para la línea celular de interés.
    2. MEDUSA requiere tres parámetros para modelar la condición no tratada: NPG: Tasa de Crecimiento Neto de la Población, en duplicaciones/h; Tstart: Punto de tiempo de inicio, en h. Se establece en un valor predeterminado de 0; Tendunt: Punto de tiempo final para la afección no tratada, en h.
    3. Simule todas las perturbaciones posibles en la tasa NPG. Utilice un bucle for para evaluar un rango de posibles valores NPG. Para cada tasa de crecimiento relativo, calcule el log2 (cambio de pliegue) que se observaría en el punto final del ensayo.
    4. Para cada sgRNA experimental en el paso 4.1.5, identifique el cambio de pliegue simulado más cercano a los datos observados. Asigne la tasa de crecimiento relativo que dio lugar al cambio de plegamiento simulado a ese sgRNA.
  3. Caracterizar la coordinación entre el crecimiento y la muerte como se describe a continuación.
    NOTA: Los parámetros necesarios para MEDUSA se pueden extraer de datos de estilo FLICK cuando se analizan con el método de análisis GRADE14. Los datos de (1) y (2) se pueden utilizar para esto, o se puede realizar un experimento de parametrización adicional.
    1. MEDUSA utiliza cuatro parámetros para caracterizar la coordinación entre el crecimiento y la muerte en presencia defármaco: GR fármaco1: Tasa de crecimiento inducida por el fármaco antes del inicio de la muerte, en duplicaciones/h; DO: Tiempo de inicio de la muerte, en h; Fármaco GR2: Tasa de crecimiento inducida por el fármaco tras el inicio de la muerte, en duplicaciones/h; Fármaco DR: Tasa de mortalidad inducida por fármacos, en unidades de Fracción Letal/h. Para parametrizar DO, utilice la cinética LF. Extraiga el tiempo de inicio de la muerte del ajuste del LED.
  4. Determine elfármaco DR utilizando la cinética de LF. Determine la tasa de mortalidad promedio dividiendo la LF final por el tiempo después del inicio de la muerte (en h).
  5. Determine elfármaco GR1 a partir de los datos de recuento de células vivas en el paso 3. Antes del inicio de la muerte, determine la tasa de crecimiento inducida por el fármaco ajustando los datos a una ecuación exponencial simple.
    1. Determine elfármaco GR2 utilizando una combinación de datos del paso 3 y el fármaco GRADO14. Calcule y represente gráficamente el GRADE para la dosis de fármaco seleccionada en una gráfica GRADE. Si GRADE = 0, supongamos que GRdrug2 es 0; Si GRADE > 0, utilice GRADE para determinar la tasa de crecimiento promedio de la población. Sobre la base del valor determinado experimentalmente para elfármaco GR1, determine el valor para elfármaco GR2 que da como resultado la tasa de crecimiento promedio observada.
      NOTA: La tasa media de crecimiento inducida por un fármaco puede inferirse a partir de un gráfico GRADE calculando la distancia por pares entre el punto de datos observado (es decir, el par de datos GR y FV de un fármaco) y cada punto que compone el espacio GRADE e identificando el punto más cercano. Para obtener instrucciones detalladas, consulte la referencia14. Las tasas de crecimiento y mortalidad inducidas por fármacos no son valores fijos por fármaco y son específicas de un fármaco a una dosis determinada en un contexto celular determinado.
  6. Genere cambios de plegamiento simulados para todas las combinaciones posibles de tasa de crecimiento y tasa de mortalidad, como se describe a continuación.
    1. Utilizando la coordinación determinada experimentalmente de la tasa de crecimiento inducida por fármacos y la tasa de mortalidad, construya un modelo que simule el tamaño de la población inducida por fármacos a lo largo del tiempo (Figura 1D). Este modelo puede construirse como una función fragmentada que combina dos fases independientes de la respuesta al fármaco (tiempo de inicio antes y después de la muerte).
    2. Para un modelo MEDUSA completo, incluya estos ocho parámetros: NPG: Tasa de crecimiento neto de la población, en duplicaciones/h; Fármaco GR1: Tasa de crecimiento inducida por el fármaco antes del inicio de la muerte, en duplicaciones/h; DO: Tiempo de inicio de la muerte, en h; Fármaco GR2: Tasa de crecimiento inducida por el fármaco tras el inicio de la muerte, en duplicaciones/h; Fármaco RD: Tasa de mortalidad inducida por fármacos, en unidades de Fracción Letal/h; Tstart: Punto de tiempo de inicio, en h. Se establece en un valor predeterminado de 0; Tendunt: Punto de tiempo final para la afección no tratada, en h; Tendtr: Punto de tiempo final para la condición tratada, en h.
    3. Para el modelo de referencia, simule todas las posibles perturbaciones de la tasa de crecimiento y mortalidad. Para cada combinación, calcule el log2(fold-change) que se observaría.
      NOTA: En MEDUSA, se supone que las perturbaciones de la tasa de crecimiento son proporcionales entre NPG, GRdrug1 y GRdrug2. Por ejemplo, una reducción del 80% en la tasa de NPG también da como resultado una reducción del 80% en ambas tasas de crecimiento inducidas por medicamentos.
  7. Deduzca la tasa de mortalidad de cada knockout (Figura 1D-E) como se describe a continuación.
    1. Para cada sgRNA, triangule la tasa de mortalidad inducida por el fármaco que habría producido el cambio de pliegue observado. Primero, extraiga la tasa de crecimiento relativo determinada en el paso (4.2.4).
    2. Determinar las tasas parael fármaco GR1 y elfármaco GR2. Aplique la tasa de crecimiento relativo de NPG para calcular una tasa de crecimiento proporcional para elfármaco GR1/fármaco GR2.
    3. Utilizando las restricciones de NPG, GRfarmaco1 y GRfarmaco2, identifique el cambio de pliegue simulado más cercano al cambio de plegamiento observado para cada sgRNA (tratado/no tratado). Utilice una combinación de estas observaciones para calcular la tasa de mortalidad inducida por fármacos.
  8. Calcule las tasas de crecimiento y mortalidad a nivel genético como se describe a continuación.
    1. Determine las tasas de nivel genético para cada gen en la biblioteca. Calcule la media de cada tasa de crecimiento y mortalidad para todos los sgRNAs asociados con un gen determinado (normalmente 4-10).
    2. Para calcular los valores p empíricos, arranque los datos a nivel de sgRNA. Realice una corrección FDR con el procedimiento de Benjamini-Hochberg.
      NOTA: Las instrucciones complementarias, así como los datos de muestra para analizar los datos de cribado de CRISPR utilizando MEDUSA, se incluyen en nuestro repositorio de GitHub (https://github.com/MJLee-Lab/MEDUSA).

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Resultados

Usando este protocolo, exploramos las dependencias genéticas de la muerte inducida por etopósido en células U2OS. El etopósido es una quimioterapia comúnmente utilizada que daña el ADN15. Este experimento de perfil quimiogenético se realizó utilizando la biblioteca GeCKOv216 en células U2OS que expresan Cas95. En este tipo de experimentos, la función génica se infiere típicamente de la abundancia relativa de un clon knockout determinado cuando se com...

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Discusión

En este protocolo, describimos el uso del método analítico MEDUSA para cuantificar los datos de perfiles quimiogenéticos para determinar cómo las perturbaciones genéticas alteran el crecimiento inducido por fármacos y las tasas de mortalidad. Debido a que el resultado principal de un experimento de perfil quimiogenético está relacionado con el tamaño de la población, no con las tasas, las tasas subyacentes se infieren mediante simulaciones. Por lo tanto, los pasos críticos en el método s...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a todos los miembros del Laboratorio Lee, pasados y presentes, por sus contribuciones al punto de vista de nuestro laboratorio sobre la evaluación de las respuestas a los medicamentos. Este trabajo fue apoyado por el financiamiento de MJL y MEH de los Institutos Nacionales de Salud (U01CA265709, R21CA294000 y R35GM152194 a MJL, y F31CA268847 a MEH), el financiamiento MJL de la Fundación Jayne Koskinas Ted Giovanis.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Platos Fisherbrand TC de 100 mmFisher ScientificFB012924Para el crecimiento de células y la optimización del tamaño de la población
Platos Fisherbrand TC de 150 mmFisher ScientificFB012925Para el crecimiento de células y la optimización del tamaño de la población
Paquete DESeq2Rv1.44.0Para calcular el cambio de pliegue
DMEMCorning10017CVPara siembra y farmacocinación células
DMSOFisher ScientificMT-25950CQCPara la siembra y el farmacamiento de células
Fisherbrand de 96 pocillos, tratados con cultivo celular, microplaca con fondo en forma de UFisher ScientificFB012932Para la siembra y el farmacamiento de células (placa de clavijas)
Greiner Bio-One  CELLSTAR μ Microplaca transparente de 96 pocillos, tratada con cultivo celular, de fondo planoGreiner655090para sembrar y farmacocar células
MATLABMathworks R2024aPara realizar FLICK, GRADE y MEDUSA
Lector de fluorescencia de microplacasTecanSparkPara mediciones de células muertas
Sytox GreenThermo Fisher ScientificS7020Para mediciones de células muertas
Biblioteca CRISPR TKOV3Addgene125517Para realizar pantallas CRISPR
Triton-X 100Thermo Fisher ScientificJ66624-APPara permeabilizar las células
Azul de tripán CorningMT25900CIPara medir células vivas/muertas

Referencias

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