MEDUSA para la identificación de genes reguladores de la muerte en datos de perfiles quimiogenéticos

Resumen

Este protocolo describe cómo utilizar el método analítico MEDUSA para cuantificar el efecto regulador de la muerte de cada gen knockout. Incluye instrucciones sobre cómo determinar las condiciones experimentales que optimizan la sensibilidad y un tutorial paso a paso sobre cómo realizar el análisis.

Resumen

El cribado sistemático de las perturbaciones genéticas de ganancia o pérdida de función puede utilizarse para caracterizar las dependencias genéticas y los mecanismos de regulación de prácticamente cualquier proceso celular de interés. Estos experimentos suelen implicar la elaboración de perfiles a partir de un conjunto de perturbaciones de un solo gen y cómo cada perturbación genética afecta a la aptitud relativa de la célula. Cuando se aplican en el contexto de estudios de eficacia de fármacos, a menudo denominados perfiles quimiogenéticos, estos métodos deben ser eficaces para identificar los mecanismos de acción de los fármacos. Desafortunadamente, los estudios de perfiles quimiogenéticos basados en la aptitud física son ineficaces para identificar todos los componentes de la respuesta a un medicamento. Por ejemplo, estos estudios generalmente no logran identificar qué genes regulan la muerte celular inducida por fármacos. Varios problemas contribuyen a oscurecer la regulación de la muerte en las pruebas de detección basadas en la aptitud física, incluidos los efectos de confusión de la variación de la tasa de proliferación, la variación en la coordinación inducida por el fármaco entre el crecimiento y la muerte y, en algunos casos, la incapacidad de separar el ADN de las células vivas y muertas. MEDUSA es un método analítico para identificar genes reguladores de la muerte en datos convencionales de perfiles quimiogenéticos. Funciona mediante el uso de simulaciones computacionales para estimar las tasas de crecimiento y mortalidad que crearon un perfil de aptitud observada en lugar de puntuar la aptitud en sí. El uso efectivo del método depende de la valoración óptima de las condiciones experimentales, incluida la dosis del fármaco, el tamaño de la población inicial y la duración del ensayo. Este manuscrito describirá cómo establecer un estudio de perfil quimiogenético para el análisis basado en MEDUSA, y demostraremos cómo usar el método para cuantificar las tasas de mortalidad en los datos de perfil quimiogenético.

Introducción

En el perfil quimiogenético, las perturbaciones genéticas sistemáticas se utilizan para comprender la contribución de cada gen a una determinada respuesta a un fármaco ^1,2,3. Estos experimentos son valiosos y pueden revelar información importante sobre las respuestas a los fármacos, incluido el objetivo de unión del fármaco y los mecanismos de entrada/eflujo del fármaco. Sin embargo, debido a que estos experimentos generalmente se realizan de manera combinada para evaluar todos los genes simultáneamente, la generación de conocimientos mecanic....

Protocolo

1. Optimización de la dosis del fármaco para inducir la muerte celular

NOTA: El siguiente protocolo es para optimizar una combinación de línea celular, fármaco y dosis utilizando el ensayo FLICK ^7,8. Los datos de ejemplo para este protocolo describen la optimización y el cribado de 5 μM de etopósido en células U2OS, pero los mismos pasos de optimización podrían aplicarse a cualquier otra combinación deseada de línea celular y fármaco/dosis. Este protocolo no requiere la recolección o análisis de células muertas. Este protocolo se pued....

Resultados

Usando este protocolo, exploramos las dependencias genéticas de la muerte inducida por etopósido en células U2OS. El etopósido es una quimioterapia comúnmente utilizada que daña el ADN¹⁵. Este experimento de perfil quimiogenético se realizó utilizando la biblioteca GeCKOv2¹⁶ en células U2OS que expresan Cas9⁵. En este tipo de experimentos, la función génica se infiere típicamente de la abundancia relativa de un clon knockout determinado cuando se com.......

Discusión

En este protocolo, describimos el uso del método analítico MEDUSA para cuantificar los datos de perfiles quimiogenéticos para determinar cómo las perturbaciones genéticas alteran el crecimiento inducido por fármacos y las tasas de mortalidad. Debido a que el resultado principal de un experimento de perfil quimiogenético está relacionado con el tamaño de la población, no con las tasas, las tasas subyacentes se infieren mediante simulaciones. Por lo tanto, los pasos críticos en el método s.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Platos Fisherbrand TC de 100 mm	Fisher Scientific	FB012924	Para el crecimiento de células y la optimización del tamaño de la población
Platos Fisherbrand TC de 150 mm	Fisher Scientific	FB012925	Para el crecimiento de células y la optimización del tamaño de la población
Paquete DESeq2	R	v1.44.0	Para calcular el cambio de pliegue
DMEM	Corning	10017CV	Para siembra y farmacocinación células
DMSO	Fisher Scientific	MT-25950CQC	Para la siembra y el farmacamiento de células
Fisherbrand de 96 pocillos, tratados con cultivo celular, microplaca con fondo en forma de U	Fisher Scientific	FB012932	Para la siembra y el farmacamiento de células (placa de clavijas)
Greiner Bio-One  CELLSTAR μ Microplaca transparente de 96 pocillos, tratada con cultivo celular, de fondo plano	Greiner	655090	para sembrar y farmacocar células
MATLAB	Mathworks	R2024a	Para realizar FLICK, GRADE y MEDUSA
Lector de fluorescencia de microplacas	Tecan	Spark	Para mediciones de células muertas
Sytox Green	Thermo Fisher Scientific	S7020	Para mediciones de células muertas
Biblioteca CRISPR TKOV3	Addgene	125517	Para realizar pantallas CRISPR
Triton-X 100	Thermo Fisher Scientific	J66624-AP	Para permeabilizar las células
Azul de tripán	Corning	MT25900CI	Para medir células vivas/muertas