Administración de anestésicos volátiles a larvas de pez cebra para observación del comportamiento

Resumen

Este protocolo presenta un método accesible para crear un entorno hermético al gas para administrar anestésicos volátiles a las larvas de pez cebra para experimentos de comportamiento.

Resumen

Este estudio describe un método único para administrar anestésicos volátiles, como el isoflurano y el sevoflurano, a larvas de pez cebra durante experimentos de comportamiento. Si bien el pez cebra ofrece numerosas ventajas como organismo modelo vertebrado, incluidos comportamientos complejos, trazabilidad genética, embriones transparentes y desarrollo rápido, su uso en el estudio de anestésicos volátiles ha sido limitado. La administración de anestésicos volátiles a menudo requiere aparatos complejos o engorrosos que pueden no ser ampliamente accesibles, lo que crea barreras para el estudio farmacológico de los anestésicos volátiles en organismos modelo acuosos. Este método presenta una técnica sencilla que utiliza láminas de silicona adhesivas para crear un sello hermético al gas en placas de vidrio de 96 pocillos. La validación se realizó a través de la evaluación del movimiento espontáneo, que no mostró diferencias significativas entre pozos sellados y abiertos durante un período de 90 minutos. Además, la concentración de anestésico se mantuvo estable a lo largo del tiempo, medida por HPLC. Los resultados representativos incluyen la determinación experimental de los valores medios de concentración efectiva (EC₅₀) para el sevoflurano. Este estudio proporciona un enfoque simple y accesible para experimentos farmacológicos que utilizan anestésicos volátiles, que se puede adaptar fácilmente para estudiar otros agentes volátiles y criterios de valoración experimentales.

Introducción

Los modelos animales no acuáticos (gusanos, moscas, roedores, conejos, primates, etc.) han sido históricamente los modelos más utilizados para estudiar la farmacología anestésica. En cada una de estas especies, los anestésicos volátiles (administrados por inhalación de gas) son mucho menos desafiantes que la administración de anestésicos intravenosos (administrados por vía intravenosa o intraperitoneal)¹. Además del desafío técnico de la simple administración de los medicamentos intravenosos, lograr un estado estable de anestesia es mucho más fácil con agentes volátiles que con agentes intravenosos².

La administración de anestésicos intravenosos a las larvas de especies acuáticas puede lograrse por difusión desde el medio acuoso circundante ^3,4 y, por lo tanto, es más similar a la administración de anestésicos volátiles para especies no acuosas. Durante muchos años, los renacuajos (Xenopus laevis) fueron el modelo de elección para el estudio de los anestésicos debido a la facilidad de administración del fármaco y a la farmacocinética en estado estacionario lograda mediante la simple adición del anestésico en un baño al agua de su estanque artificial ^5,6. Sin embargo, existen relativamente pocos ejemplos del estudio de anestésicos volátiles en este modelo debido a la necesidad de aparatos herméticos al gas que a menudo están construidos específicamente y pueden ser engorrosos de usar ^7,8.

En los últimos años, el pez cebra se ha convertido en un modelo preferido para el estudio de los anestésicos intravenosos debido a la misma facilidad de administración de fármacos, además de otras ventajas como sus comportamientos complejos bien descritos y la disponibilidad de unidades comerciales para observar estos comportamientos⁹. Muchos estudios recientes han empleado estas unidades de observación disponibles comercialmente para detectar compuestos neuroactivos, incluidos los anestésicos, utilizando formatos de placa de 96 y 24 pocillos para cuantificar el comportamiento de las larvas de pez cebra 4,10,11,12,13,14,15 . Los estadios larvarios son particularmente adecuados para estudios de farmacología debido a su capacidad para evaluar muchas respuestas conductuales, su pequeño tamaño, su alta compatibilidad de rendimiento y sus circuitos neuronales bien caracterizados ^9,16,17. Sin embargo, una limitación significativa en estos estudios de anestésicos en el modelo de pez cebra es la relativa dificultad en la administración de anestésicos volátiles. Esta limitación ha llevado a escasos ejemplos de comparación entre agentes volátiles e intravenosos ^4,15,18. La posibilidad de estudiar y comparar fácilmente ambas clases de anestésicos en un solo modelo animal añade una herramienta importante para facilitar el estudio de la farmacología anestésica en todas las clases.

Tradicionalmente, el estudio de los anestésicos intravenosos en una especie acuática ha requerido un equipo especializado, a menudo personalizado, que puede ser difícil de usar o puede no ser lo suficientemente hermético al gas para evitar la pérdida del anestésico durante la duración del experimento. El procedimiento descrito aquí presenta un medio alternativo fácilmente accesible para producir un sello hermético al gas en una cámara de vidrio que es adecuado para la observación del comportamiento de las larvas de pez cebra utilizando una unidad de observación comercial (ver Tabla de Materiales).

Protocolo

Todos los experimentos con pez cebra se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos de uso animal aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC). Los peces cebra adultos se mantuvieron en las instalaciones acuáticas de la Universidad de Pensilvania bajo la supervisión de los Recursos Animales de Laboratorio de la Universidad (ULAR). El pez cebra salvaje de aleta larga de Tübingen se crió internamente para todos los experimentos y se mantuvo en condiciones de cría estándar con un ciclo de luz/oscuridad de 13/11 h hasta que alcanzaron los 5 días posteriores a la fertilización (dpf). Los experimentos se llevaron a cabo utilizando réplicas biológicas, con nidadas derivadas de distintas parejas de apareamiento para garantizar una diversidad biológica adecuada. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Fabricación de láminas adhesivas de silicona

NOTA: Los equivalentes de este material (lámina de silicona más adhesivo) se pueden obtener comercialmente, pero a menudo a un costo mayor y menor disponibilidad.

1. Extiende la lámina de silicona de 0,5 mm sobre una superficie limpia y plana.
2. Inspeccione las sábanas en busca de arrugas y evítelas cuando sea posible.
   NOTA: Es posible que las láminas de silicona con pliegues no se adhieran adecuadamente a la cinta y pueden resultar en un sellado inadecuado de los pocillos y / o una mala visualización del pez cebra.
3. Limpie las sábanas con alcohol al 70% para eliminar el aceite o los residuos y deje que se sequen.
4. Con un aplicador, como un pincel, aplique una capa delgada y uniforme de imprimación adhesiva a la lámina de silicona. Para evitar la aplicación excesiva, trabaje en secciones más pequeñas, ya que el promotor adhesivo se seca rápidamente (se endurece en 1-5 segundos).
   NOTA: Sin este promotor de adhesión, la cinta no se adherirá adecuadamente a la lámina de silicona.
5. Una vez que se aplica el promotor adhesivo, alinee la cinta de doble capa con la lámina de silicona con el respaldo del papel hacia arriba.
6. Aplique gradualmente la cinta a la silicona con un rodillo para alisar la superficie y eliminar las burbujas de aire (después de la aplicación inicial, trabajar con el lado de la silicona hacia arriba ayudará a visualizar y eliminar las burbujas de aire).
7. Deje que el promotor adhesivo se cure completamente durante 24 horas sobre una superficie plana.
8. Corta la silicona adhesiva en tiras de al menos 10 mm de ancho (7,5 mm de diámetro de pocillo más solapamiento en cada lado).
   NOTA: Cuando se usa cada dos filas de la placa de pocillos, una variación más amplia en las tiras no afectará negativamente a los pozos en las filas adyacentes, lo que no solo puede facilitar la aplicación, sino que también puede ser necesario para lograr un sellado alrededor de toda la circunferencia del pozo.
   1. Asegúrese de que las tiras sean lo suficientemente largas como para cubrir al menos el ancho de una fila de la placa del pocillo.
      NOTA: Si se utiliza una placa de pocillos que no es de 96 pocillos, como una placa de 24 o 48 pocillos, los tamaños de las tiras se pueden ajustar o cortar para que se ajusten a las dimensiones específicas de la placa, asegurando una cobertura adecuada independientemente del tamaño de la placa.

2. Preparación de soluciones

NOTA: Todas las soluciones de stock y ensayo de anestésicos volátiles se prepararon justo antes del experimento para evitar la pérdida de concentración de compuestos volátiles.

1. Para cada solución (madre o solución de trabajo), agregue un volumen de solvente no volátil (agua de embrión E3, DMSO, etc.) a un vial de HPLC o centelleo que, cuando se combine con la dilución final de anestésico volátil, el volumen total llenará suficientemente el vial dejando un espacio de cabeza mínimo (ver Figura 1A).
2. Agregue anestésico volátil con una jeringa hermética al gas Hamilton y selle rápidamente el vial.
   NOTA: Las soluciones madre en viales con tapas de tabique se pueden utilizar para facilitar diluciones adicionales mediante la transferencia de la solución con jeringas herméticas al gas.
3. A continuación, mezcle los viales (vórtice, sonicación) según sea necesario y guárdelos temporalmente mientras prepara las placas de pez cebra.

3. Configuración del experimento conductual

NOTA: Este paso del protocolo puede requerir algo de práctica. Se recomienda trabajar sin peces ni soluciones que contengan materiales preciosos hasta que se sienta cómodo con la técnica.

1. Transfiera una larva de pez cebra (5 dpf) a cada dos filas de la placa de vidrio de 96 pocillos.
   NOTA: Dejar vacías todas las demás filas permite reducir el potencial de contaminación de los pozos adyacentes por derrame, ya que los pozos están sellados en el paso 3.4.
2. Retire con cuidado la solución E3 de cada pocillo. Esto se puede hacer una fila a la vez o en todo el plato si puede funcionar rápidamente.
   NOTA: El tiempo durante el cual las larvas estuvieron fuera de la solución se minimizó para reducir el estrés potencial. Se pueden utilizar procedimientos alternativos basados en diferentes necesidades experimentales, incluida la eliminación parcial de la solución antes de la adición de la solución que contiene el fármaco para minimizar el estrés. El protocolo debe adaptarse a las necesidades del experimento, incluido el tiempo de equilibrio asignado a los animales para compensar cualquier estrés potencial, la eficiencia de la mezcla de la solución y la precisión de las concentraciones de una solución que contiene fármaco, si no se elimina todo el E3 antes de la adición de la solución de trabajo.
3. A continuación, utilice una pipeta de transferencia para llenar cada pocillo de la fila con la solución experimental. Tenga cuidado de no introducir burbujas. Sobrellene cada pozo (Figura 1B).
4. Usando las tiras adhesivas de silicona hechas en el paso 1, presione la tira hacia abajo rápidamente (Figura 1C). Esto ayuda a prevenir la formación de burbujas y evita que los peces se desborden hacia los pozos adyacentes.
5. Presione firmemente la parte superior de la placa para asegurarse de que cada pocillo esté sellado.
6. Repita los pasos 2 a 5 hasta que se cambie la solución y se sellen los pocillos de cada dos filas de la placa de pocillos (Figura 1D).
7. Dé la vuelta suavemente a la placa e inspeccione si hay burbujas de aire.
   NOTA: La presencia de burbujas de aire oscurecerá la visualización del movimiento del pez cebra.
8. Coloque la placa en la unidad de observación del comportamiento (con el adhesivo de silicona hacia abajo) y realice el experimento de comportamiento (consulte la sección Resultados para obtener más detalles).

Resultados

Comparación con la observación tradicional de pozos abiertos
Con el fin de evaluar si el sellado adhesivo tiene algún efecto sobre el movimiento espontáneo, se realizó una comparación entre los controles en pozos abiertos versus sellados. Como se ve en la Figura 2A, no se observó una diferencia estadísticamente significativa en el movimiento entre estos grupos durante la duración estándar de ~ 30 minutos utilizada en los experimentos descritos en este artículo. Reconocien...

Discusión

Este artículo describe un método para administrar fácilmente anestésicos volátiles, como el sevoflurano, a larvas de pez cebra, que se utilizó para cuantificar la potencia de los anestésicos volátiles en peces de tipo salvaje. Aunque esta técnica es conceptualmente simple, puede llevar práctica garantizar una fila de pozos adecuadamente sellada y libre de burbujas en un corto período de tiempo para minimizar la pérdida de agentes volátiles. Debido a que este método está diseñado para com...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microplacas de vidrio de 96 pocillos	Zinsser Norteamérica	3600500	"Estas microplacas de vidrio están hechas de vidrio de borosilicato especial de alta pureza y resistente a la temperatura y las superficies están pulidas con ácido. Las placas son rectangulares en el tamaño estándar de la microplaca SBS (85 x 127 mm). Estas microplacas de reactor de vidrio están diseñadas principalmente para su uso con aplicaciones químicas y son resistentes a temperaturas de hasta 530° C. Se pueden esterilizar en autoclave. Están mecanizados a partir de una lámina de vidrio homogénea y presentan una geometría y forma uniformes para proporcionar temperaturas constantes de pocillo a pocillo (dentro de los 0,2 grados C típicos)".
Viales transparentes, de gran apertura y rosca de 9 mm de 2,0 ml	Ciencias de la vida de Chemglass	CV-1150-1232	"Con una abertura un 40% más grande, estos viales están diseñados específicamente para funcionar en muestreadores automáticos de brazo robótico. También incorporan el diseño único de Step Vial que centra con precisión un inserto de volumen limitado en el cuello del vial. "
Cinta de doble cara 3M 9490LE	AbbVie Inc	24WG90	"La cinta de doble cara 3M 9490LE con adhesivo de laminación 3M 300LSE proporciona una alta fuerza de unión a la mayoría de las superficies, incluidos muchos plásticos de baja energía superficial, como el polipropileno y las pinturas con recubrimiento en polvo. El adhesivo acrílico también proporciona una excelente adhesión a superficies ligeramente contaminadas con aceite que se usa típicamente con piezas de máquinas. La cinta de doble cara 9490LE de 3M ofrece la característica adicional del adhesivo de laminación 3M 300MP en un lado para proporcionar una excelente fuerza de unión a una variedad de materiales de espuma y tela (6 pulgadas x 5 yardas)"
Cámara de observación DanioVision	Noldus	DVOC-0041	"DanioVision es un sistema completo, diseñado para las pruebas de alto rendimiento de larvas de pez cebra en placas de pocillos múltiples. Incluye la Cámara de Observación y el reconocido software de seguimiento de video EthoVision XT".
Unidad de control de temperatura DanioVision	Noldus	DVTCU-0011	"La unidad de control de temperatura DanioVision es un sistema de flujo continuo: el agua fluye uniformemente debajo de la placa del pocillo a la temperatura de su elección. La temperatura es la misma en toda la placa del pozo".
Software Ethovision XT16	Noldus	BASE NSE-EV	"EthoVision XT es el software de seguimiento de video más ampliamente aplicado que rastrea y analiza el comportamiento, el movimiento y la actividad de cualquier animal, marca registrada por Noldus"
Isoflurano	Cuidados críticos de Piramal	NDC # 66794-017-10	Líquido para inhalación, un anestésico inhalatorio no inflamable y no explosivo, que contiene 100 ml de isoflurano. Almacenado a temperatura ambiente controlada 20º a 25º C
Imprimación adhesiva instantánea Scotch-Weld AC79 Clear	3M	"62-3916-0860-1 (ID del producto) C2103N (Lote)"	"La imprimación adhesiva instantánea 3M Scotch-Weld AC79 está diseñada para su uso en elastómeros de baja energía superficial difíciles de unir, como EPDM, silicona y otros cauchos. La preparación y aplicación de la superficie son sencillas y la imprimación adhesiva se seca rápidamente para que los trabajos se muevan rápidamente".
Láminas de silicona de 0,5 mm de espesor	Varios proveedores	N/A	Las láminas de silicona translúcida se compraron a múltiples proveedores
Speedball Pop-in Hard Rubber Brayer con marco de plástico, 4 pulgadas"	Speedball	793728	"El Speedball Pop-In Hard Brayer tiene un rodillo que se despliega para facilitar la limpieza. Marco de plástico de una pieza con rodillo desmontable de 4 pulgadas de ancho. Hecho de caucho de goma natural puro con un acabado rectificado. El brayer de goma dura mide 4 pulgadas de ancho con un marco de plástico resistente y es ideal para la aplicación de pegamento"
Tapones de rosca SureSTART de 9 mm, aplicaciones de alto rendimiento de nivel 2, tipo: tapón de rosca AVCS PP negro, silicona blanca/PTFE rojo Septa 1,0 mm	Thermo Scientific	6ASC9ST1B	"Utilice tapones de rosca Thermo Scientific SureSTART de 9 mm con viales de rosca que tengan una abertura de 9 mm. Los tapones de nivel de rendimiento 2 se fabrican y prueban para garantizar un bajo sangrado, robustez y reproducibilidad de los resultados para los análisis rutinarios de GC-MS y LC-MS. Elija entre tapas de polipropileno con septos de silicona/PTFE de uso múltiple de varios valores de dureza diseñados para reducir los problemas de la aguja del muestreador automático. Nuestras tapas AVCS incorporan la tecnología Advanced Vial Closure System para garantizar una compresión de sellado óptima al cerrar un vial".
Ultane Sevoflurano	AbbVie Inc	NDC # 0074-4456-04	Líquido volátil para inhalación, se envasa en frascos de color ámbar que contienen 250 ml de sevoflurano. Almacenado a temperatura ambiente controlada 15º a 30º C
Frascos de centelleo líquido Wheaton, tapas unidas a viales, vidrio, lámina de metal / pulpa, 24-400, 20 mL	DWK Ciencias de la vida	986561	Viales de centelleo de 20 ml convertidos a partir de tubos de vidrio de borosilicato tipo I, PET o HDPE. Disponible con tapa adjunta.