Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Ensayo de biofilm para Clostridioides difficile con aplicaciones para el descubrimiento de fármacos

988 visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/67913

⸱

8 de julio de 2025

 ,  , 
1Department of Molecular Microbiology and Immunology and The South Texas Center for Emerging Infectious Diseases (STCEID), The University of Texas at San Antonio

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Las biopelículas del patógeno bacteriano Clostridioides difficile y su importancia en la enfermedad no se conocen bien. Hallazgos recientes han sugerido un papel en la recurrencia, subrayando su importancia. Aquí, describimos la adaptación de un ensayo de biopelícula acoplado a una lectura metabólica con aplicaciones para el descubrimiento de fármacos contra biopelículas.

Resumen

Clostridioides difficile es un patógeno bacteriano gastrointestinal capaz de aprovechar un entorno de microbiota disbiótica para proliferar, secretar toxinas y dañar el epitelio intestinal. Un subconjunto de pacientes con infección por C. difficile (ICD) experimentará un fracaso del tratamiento con antibióticos (15%-30%) o trasplante de microbiota fecal (TMF) (<10%). Por lo tanto, el desarrollo de intervenciones terapéuticas adicionales es de vital importancia. El papel de las biopelículas de C. difficile en la recurrencia no está claro. Sin embargo, las biopelículas en otros organismos son responsables de enfermedades crónicas y recurrentes, lo que sugiere que este también podría ser el caso en la ICD recurrente. Nuestra hipótesis es que las biopelículas de C. difficile presentan una valiosa diana terapéutica. El objetivo del protocolo aquí presentado es adaptar un ensayo de formación de biopelículas para la identificación de compuestos reposicionables con actividad contra biopelículas de C. difficile establecidas. El protocolo perfecciona un ensayo robusto y reproducible para la formación de biopelículas, lo acopla a un ensayo metabólico y lo aplica al descubrimiento de fármacos. Este protocolo describe el ensayo de formación de biopelículas, las lecturas de biomasa y actividad metabólica, las pruebas de susceptibilidad a los medicamentos, la detección de medicamentos de una biblioteca de reposicionamiento y los resultados representativos.

Introducción

Clostridioides difficile es un patógeno bacteriano anaeróbico formador de esporas capaz de infligir daños graves al tracto gastrointestinal (GI) humano mediante la producción de toxinas. C. difficile es responsable de casi medio millón de casos al año, con ~30,000 muertes (CDC, 2015). El tratamiento de la infección por C. difficile (ICD) añade un coste significativo al ya sobrecargado sistema sanitario (~4.800 millones de dólares)1,2,3. Las personas con mayor riesgo son las inmunosupresoras, las expuestas a antibióticos y/o las personas mayores, todas poblaciones que continúan expandiéndose significativamente tanto en los EE. UU. como en todo el mundo 4,5,6,7.

La C. difficile depende en gran medida del estado de la microbiota gastrointestinal del huésped y, como tal, el tratamiento con antibióticos es un factor predisponente clave para la ICD. La identificación de aislados clínicos de C. difficile resistentes a antibióticos complica aún más el tratamiento 8,9,10. Además, entre el 15% y el 30% de los pacientes tratados con antibióticos para la ICD fracasarán en el tratamiento inicial 5,11,12,13,14,15,16. Una vez que un paciente experimenta un episodio de recurrencia, la probabilidad de episodios de recurrencia aumenta al 45-64% (escalada de recurrencia) y se acompaña de un mayor riesgo de nuevos fracasos del tratamiento16,17. Es importante destacar que la mayoría de los casos de recaída de ICD son causados por la cepa original que estableció el primer episodio de infección en el huésped18,19, lo que sugiere una colonización continua por C. difficile incluso después de un tratamiento exitoso. Si bien se ha demostrado que las esporas persisten en el tracto gastrointestinal y provocan recaídas en modelos ex vivo y murinos20, las biopelículas de C. difficile y su papel en la enfermedad y la recaída están poco exploradas. Las biopelículas son comunidades microbianas protegidas por una matriz extracelular autoproducida, característica que las hace altamente recalcitrantes a las agresiones ambientales como el tratamiento con antibióticos y las respuestas inmunes21. Además, la formación de biopelículas es un factor de virulencia significativo 22,23,24,25 y en infecciones bacterianas, como las causadas por Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa, las biopelículas son clave en la recurrencia y manifestaciones crónicas 26,27. Recientemente, las biopelículas de C. difficile han sido sugeridas como un reservorio de infecciones recurrentes 28,29,30 y, por lo tanto, representan un objetivo de alto valor para el tratamiento y/o prevención de la recurrencia de la ICD.

Los modelos actuales para estudiar las biopelículas de C. difficile incluyen los modelos de biopelículas de colonias31,32, los microfermentadores33, los modelos de intestino quimiomostático34,35 y los sistemas de cultivo líquido que utilizan matraces o placas de pocillos36,37. Todos estos modelos han proporcionado información clave sobre las biopelículas de C. difficile en distintas etapas de desarrollo y en distintos entornos. Sin embargo, algunos de estos modelos (es decir, microfermentadores, modelos intestinales de quimiostatos, biopelículas de colonias) no son adecuados para los esfuerzos de descubrimiento de fármacos. Hasta la fecha, la mayoría de los estudios relacionados con los esfuerzos de descubrimiento de fármacos se han centrado en el estilo de vida planctónico de C. difficile 38,39,40,41. Por lo tanto, el protocolo descrito aquí tiene como objetivo adaptar, estandarizar y validar el modelo existente de biopelícula de placa de 96 pocillos con el objetivo de desarrollar una plataforma para bibliotecas de cribado para identificar moléculas reposicionables con la capacidad de matar biopelículas de C. difficile establecidas (24 horas de antigüedad). La validación del protocolo se llevó a cabo comparando las capacidades de formación de biopelículas entre una cepa adaptada en laboratorio (630 Δerm) y un aislado clínico epidémico (cepa UK1 aislada durante un brote de 2006 en el Hospital Stoke-Mandeville en el Reino Unido42). La formación de biopelículas se cuantificó utilizando el ensayo clásico de violeta cristalino para medir la biomasa y un ensayo metabólico para medir la viabilidad de las biopelículas. Se identificaron diferencias significativas en la capacidad de formación de biopelículas entre las cepas, lo que sugiere posibles implicaciones clínicas. Además, el ensayo se utilizó para determinar los perfiles de susceptibilidad a los antibióticos de las biopelículas establecidas. Por último, como prueba de concepto, se seleccionó la caja de Prioridad de Salud Global de Medicines for Malaria Venture (MMV), una organización sin fines de lucro enfocada en descubrir nuevas terapias contra enfermedades desatendidas como la malaria, para identificar compuestos con actividad contra biopelículas establecidas de C. difficile. El protocolo descrito aquí adapta y valida un ensayo clásico de biopelícula para su uso como plataforma de cribado de fármacos dirigidos a biopelículas maduras.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

1. Preparación de las células para el ensayo de biofilm

PRECAUCIÓN: Clostridioides difficile es un patógeno humano y requiere contención de BSL-2.

NOTA: Las esporas utilizadas para este estudio fueron adquiridas de la Dra. Carol Kumamoto de la Facultad de Medicina de la Universidad de Tufts. Las existencias de esporas de C. difficile se prepararon como se describió anteriormente 43,44,45. A continuación, las esporas se alícuotas en volúmenes de 10 μL en tubos de PCR para la extracción de las placas. Todos los medios y la solución salina tampón de fosfato (PBS) necesarios para el experimento deben reducirse previamente en la cámara anaeróbica 24 horas antes de su uso. Esto se logra aflojando la tapa de la botella que contiene el medio o PBS dentro de la cámara.

  1. Reduzca previamente una placa de agar Brain Heart Infusion suplementada con 0,1% (p/v) de taurocolato y 0,1% (p/v) de L-cisteína (BHIS) en la cámara anaeróbica, preferiblemente durante la noche o durante al menos 3 h para permitir una reducción completa. Ajuste la temperatura de la cámara anaeróbica a 37 °C.
  2. Calentar el tubo de PCR que contiene 10 μL de esporas durante 20 min a 70 °C. Esto se puede hacer en un baño de agua o en un termociclador.
  3. Lleve las esporas a la cámara anaeróbica, mezcle pipeteando suavemente 5x-6x y pipetee 10 μL en la placa BHIS prerreducida. Realice una raya de cuatro cuadrantes como se describió anteriormente46, e incube la placa durante la noche a 37 °C (temperatura de la cámara anaeróbica).
  4. Después de 24 h de crecimiento, las colonias aisladas deberían ser visibles. Seleccione una sola colonia y, utilizando un asa desechable, transfiérala a un tubo que contenga 10 ml de líquido BASHIS. Incubar durante la noche (14-18 h).
  5. Determine la densidad celular diluyendo en serie el cultivo durante la noche en la cámara.
    1. Realice diluciones 10 veces mayores del cultivo durante la noche. La dilución 103 produce una muestra contable para cada una de las cepas utilizadas en este protocolo. Sin embargo, podría ser necesaria la estandarización de este paso para los aislados clínicos con diferencias de crecimiento.
    2. Saque los tubos de la cámara anaeróbica, coloque 10 μL de cada muestra en un hemocitómetro y cuente con un microscopio de campo claro según lo descrito por el fabricante del hemocitómetro.
    3. Siga las instrucciones del fabricante para determinar la concentración de células después del conteo.

2. Formación de biopelículas

NOTA: Si bien este protocolo es adaptable a distintos tamaños de pozos, se optimizó para la plataforma de 96 pocillos. Si se modifica el tamaño del pozo, será necesario ajustar la concentración de celdas en función de la superficie del pozo.

  1. Después de determinar la concentración celular del cultivo nocturno, ajuste la concentración celular a 1 x 107 células/mL en BHIS (suplementado con L-cisteína al 10% (p/v) y glucosa 0,1M).
    NOTA: Se ha demostrado previamente que la suplementación con glucosa 0,1M aumenta la formación de biopelícula por la cepa C . difficile 630 Δerm 47. Para este protocolo, se seleccionó la concentración de 1 x 107 células/mL después de probar distintas concentraciones iniciales (Figura 1). Todavía se puede lograr una formación robusta de biopelícula sin suplementación con glucosa.
  2. Dispense 100 μL de células en los pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos (fondo plano y cultivo de tejidos tratados), dejando columnas de control (solo células) y en blanco (solo medios). Incubar durante 24 h en la cámara anaeróbica (37 °C).
    1. Si la evaporación del medio se convierte en un problema, coloque las placas de biopelícula lejos de cualquier unidad de calentamiento. Alternativamente, coloque las biopelículas dentro de un recipiente adicional o cúbralas con membranas de placa permeables de 96 pocillos.
  3. Retire con cuidado el medio de todos los pocillos, comenzando con la pieza en bruto. Esto eliminará las células no adherentes y dejará una biopelícula. Este paso es crucial, ya que solo las células dentro de la biopelícula son de interés.
  4. Lave suavemente las biopelículas 2 veces con 200 μL de PBS prerreducido. Para realizar este lavado suavemente, incline ligeramente la placa de 96 pocillos, inserte las puntas de las pipetas contra la pared del pocillo, deslice las puntas cerca del fondo del pocillo sin raspar el fondo y aspire lentamente. Si se deja PBS en la parte inferior, repita el proceso nuevamente. En esta etapa, se pueden eliminar las células no adheridas, y es normal. Retire el PBS antes de sacar la placa de la cámara anaeróbica.
  5. En este punto, utilice las biopelículas para: Mediciones de biomasa (consulte el paso 3); mediciones de la actividad metabólica (ver Paso 4); ensayos de susceptibilidad a los medicamentos y de detección de drogas (ver Paso 5).
    NOTA: Este protocolo ha sido validado para la cepa de 630 Δerm adaptada en laboratorio y la cepa epidémica UK1. Los distintos aislados y cepas clínicas pueden mostrar una capacidad débil de formación de biopelículas. Para minimizar la interrupción de la biopelícula, lave con PBS 1x en lugar de 2x y reduzca el volumen de lavado a 100 μL.

3. Medición de la biomasa del biofilm mediante el ensayo Crystal violet

NOTA: La tinción con violeta cristalino se basó en un protocolo48 descrito anteriormente.

  1. Después de lavar las biopelículas en la cámara anaeróbica (ver paso 2.4), retire la placa y transfiérala a una campana de gases químicos.
  2. Para fijar las biopelículas, agregue suavemente 150 μL de metanol a cada pocillo. Cubre el plato con la tapa durante 10 min.
  3. Retire el metanol y deje que los pocillos se sequen por completo sin la tapa. Esto debería tardar entre 30 minutos y 45 minutos.
  4. Agregue 100 μL de 0.3% de Crystal violet a todos los pocillos y tiña durante 10 min. Retire Crystal violet con cuidado para evitar manchas en el borde y las paredes del pocillo, ya que esto puede afectar la lectura.
  5. Deje que la placa se seque sin la tapa. Esto debería tardar entre 30 minutos y 45 minutos.
  6. Lave los pocillos 3 veces con 200 μL de agua destilada y deje que la placa se seque por completo. Esto debería tomar de 30 a 45 minutos.
  7. Una vez seco, utilice un microscopio de campo claro para obtener imágenes de las biopelículas (Figura 2A). Si bien este paso es opcional, permite una observación más exhaustiva de las células en la biopelícula.
    1. Coloque la placa de 96 pocillos en un microscopio de campo claro invertido con un adaptador de placa. Identifique los pozos representativos de cada cepa analizada.
    2. Tome imágenes de cada pocillo con el aumento deseado. Las imágenes presentadas en este protocolo fueron tomadas con un aumento de 40x.
  8. Una vez que se hayan obtenido las imágenes deseadas, transfiera la placa nuevamente a una campana de gases químicos para eliminar las manchas.
  9. Para eliminar las manchas del biofilm, agregue 150 μL de ácido acético al 33% y colóquelo en un agitador a velocidad media durante 10 min.
  10. Retire 90 μL de cada pocillo y transfiéralo a una nueva placa de fondo plano de 96 pocillos. Lea la absorbancia a 595 nm utilizando un lector de placas (Figura 2B).

4. Medición de la viabilidad del biofilm utilizando el colorante metabólico PrestoBlue

  1. Realice la medición de la actividad metabólica siguiendo el protocolo del fabricante para el ensayo con modificaciones clave. Calentar el lector de placas a 37 °C antes de preparar las biopelículas para el ensayo. Se recomienda un lector de placas capaz de medir la fluorescencia.
    NOTA: Alternativamente, la actividad metabólica se puede leer en OD600; Sin embargo, no hemos encontrado que ese enfoque sea lo suficientemente sensible para estos ensayos. Se recomienda que los usuarios revisen el protocolo del fabricante y lo estandaricen si es necesario.
  2. Después de lavar las biopelículas con PBS en la cámara anaeróbica como se describió anteriormente (consulte el paso 2.4), retire la placa de la cámara.
  3. Junto con la placa, retire 9 mL de BHIS prerreducido (suplementado con L-cisteína al 10% (p/v) y 0,1 M de glucosa).
  4. Añada rápidamente 1 mL de reactivo PrestoBlue a 9 mL de BHIS prerreducido y vórtice. No reduzca previamente el reactivo, ya que esto puede afectar la coloración del reactivo (consulte la discusión).
  5. Añada 100 μL de la mezcla BHIS-PrestoBlue a cada pocillo. Coloque la placa en un lector de placas con los siguientes ajustes: Temperatura a 37 °C, tipo de ensayo como cinético; tiempo de lectura como 30 min; frecuencia de lectura cada 2 min; Intensidad de fluorescencia en función del tipo de lector de placas disponible. Las mediciones descritas en este protocolo se realizaron utilizando longitudes de onda de excitación/emisión de 560 nm/590 nm, respectivamente.
  6. Después de leer, deseche las placas.
  7. Una vez que se adquieren los valores de fluorescencia de las lecturas de la placa, use pocillos en blanco (solo medios) para restar el ruido de todos los pocillos de muestra. Después de esto, dividir los pocillos de biofilm tratados con cada compuesto por el pocillo control que contiene un biofilm sin tratar (100%) para obtener actividad metabólica.

5. Adición de fármacos a los biofilms

NOTA: La configuración que se describe a continuación se puede modificar para ensayos de susceptibilidad a medicamentos y detección de drogas de concentración fija. Para ambos métodos que se describen a continuación, se recomienda el ensayo PrestoBlue.

  1. Determinación de las concentraciones inhibitorias mínimas (CMI) de distintos antibióticos
    NOTA: Las biopelículas se manipulan durante un período de 48 horas, lo que aumenta la posibilidad de contaminación. Es de gran importancia procesar primero los pozos en blanco y seguir procedimientos asépticos. Los valores de CMI informados en la literatura para otras cepas de C. difficile y los ensayos de dosis-respuesta de prueba se utilizaron para informar las concentraciones iniciales de antibióticos para los ensayos de CMI presentados en este protocolo. Este enfoque será útil para determinar las concentraciones iniciales de antibióticos cuando se trabaja con aislados clínicos.
    1. Lave las biopelículas maduras (24 h de antigüedad) con PBS en la cámara anaeróbica como se describe anteriormente (consulte el paso 2.4).
    2. Añada 200 μl de BHIS prerreducido (suplementado con L-cisteína al 10 % (p/v) y 0,1 M de glucosa) a cada pocillo, excepto a las columnas de control (solo células) y en blanco (solo medios) de la placa.
    3. Incubar durante 24 h adicionales. En este estudio, se utilizaron vancomicina (concentración inicial de 200 μg/mL), metronidazol (concentración inicial de 16 μg/mL) y fidaxomicina (concentración inicial de 4 μg/mL) para validar el ensayo. Los valores de CMI se reportan en la Tabla 1.
    4. Para evitar el secado de las placas, manténgalo alejado de la unidad de calentamiento en la cámara anaerobia o use una membrana permeable al gas.
      NOTA: Alternativamente, se puede utilizar un PBS prerreducido o un foso de medios (300 μL) en los pozos exteriores de la placa.
    5. Después de 24 h de incubación con los fármacos, retire el medio y lave suavemente las biopelículas 1 vez con PBS. Procese biopelículas utilizando el ensayo Crystal violet o el ensayo PrestoBlue.
  2. Cribado de bibliotecas de fármacos
    1. Lave las biopelículas maduras (24 h de antigüedad) con PBS en la cámara anaeróbica como se describe anteriormente (consulte el paso 2.4).
    2. Añada 200 μL de medio que contenga una concentración fija de compuestos de la biblioteca de fármacos a cada pocillo, excepto a las columnas de control (células en medios sin antibióticos) y en blanco (medios sin antibióticos) de la placa. Incubar durante 24 h adicionales. Para evitar el secado de las placas, manténgalo alejado de la unidad de calentamiento en la cámara anaerobiana.
    3. Después de 24 h de incubación con los fármacos, retire el medio y lave suavemente las biopelículas 1 vez con PBS. Procese biopelículas utilizando el ensayo Crystal violet o el ensayo metabólico.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

El objetivo del protocolo descrito anteriormente es adaptar y validar el modelo de formación de biopelículas en placa de 96 pocillos como plataforma de cribado de fármacos para la identificación de compuestos reposicionables con actividad frente a biofilms establecidos de C. difficile. Se determinó el impacto de distintas densidades celulares (104, 105, 106 y 107 células/mL) en la formación de biopelículas, y se cuantificó la formación ...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

La formación de biopelículas por C. difficile y el papel que desempeña en la enfermedad no se comprenden bien. Hallazgos recientes sugieren un papel de las biopelículas en la recaída de la enfermedad28,34. La formación de biopelículas es un factor de virulencia significativo 22,23,24,25 y en infecciones bacterianas,

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos que revelar.

Agradecimientos

J.A.R. diseñó el estudio y el protocolo y escribió el manuscrito. A.S. y P.Z. llevaron a cabo los experimentos y ayudaron a refinar el protocolo. Este trabajo fue apoyado por fondos iniciales de la Universidad de Texas en San Antonio (UTSA) a J.A.R., y A.S. fue apoyado por el programa UTSA MARC (T34GM145507). Los autores desean agradecer a Medicines for Malaria Venture (MMV, Suiza) por proporcionar la biblioteca de la Caja Prioritaria de Salud Global.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
ÁCIDO ACÉTICO SAF-CT ACS 500MLFisher ScientificA38S500
AGAR BACTERIOLÓGICO GR 1KGFisher ScientificAC443570010
BioTek Synergy H1 lector de placasFisher ScientificBTH1MG
BOTELLA EXTRACTO DE LEVADURA 500GFisher ScientificDF0127179
CALDO DE INFUSIÓN CEREBRO Y CORAZÓNFisher Scientific
Crystal Violet USP grado 100GVWR97061-850Para teñir biopelículas para ensayos de biomasa
Placa TC CytoOne de 96 pocillos, fondo plano, transparente, envuelta en indiv. con tapas, 50/cajaUSA ScientificCC7682-7596
D-(+)-Glucosa, anhidraFisher Scientific50712744
Dimetilsulfóxido para Biología Molecular (DMSO)Millipore SigmaD8418-250ML
FIDAXOMICINA 250MGFisher ScientificAC468312500
L-CISTEÍNA 98+% 1KGFisher ScientificAAA104350BPara medios de C. difficile
METANOL 99.8 ACROSEAL 1LTFisher ScientificAC364390010
METRONIDAZOL, 99% 5GRFisher ScientificAC210340050
Solución salina tampón de fosfato (PBS) 10XFisher ScientificBP3991
PrestoBlue Reactivo de viabilidad celularFisher ScientificA13262
SILVERSEAL OPAQUE ADHES 100/CSFisher Scientific7000379Utilizado para sellar placas de medicamentos madre e hija antes del almacenamiento
SAUROCOLATO DE SODIO 100MG VWR100291-598
VANCOMICINAFisher Scientific BP29581
CM1135R

Referencias

  1. Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin Infect Dis. 55 (Suppl 2), S88-S92 (2012).
  2. Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile infection in the United States. N Engl J Med. 372 (9), 825-834 (2015).
  3. Sheitoyan-Pesant, C., et al. Clinical and healthcare burden of multiple recurrences of Clostridium difficile infection. Clin Infect Dis. 62 (5), 574-580 (2016).
  4. Abou Chakra, C. N., Pepin, J., Sirard, S., Valiquette, L. Risk factors for recurrence, complications and mortality in Clostridium difficile infection: A systematic review. PLoS One. 9 (6), e98400(2014).
  5. Aslam, S., Hamill, R. J., Musher, D. M. Treatment of Clostridium difficile-associated disease: Old therapies and new strategies. Lancet Infect Dis. 5 (9), 549-557 (2005).
  6. Brown, K. A., Khanafer, N., Daneman, N., Fisman, D. N. Meta-analysis of antibiotics and the risk of community-associated Clostridium difficile infection. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2326-2332 (2013).
  7. Dicks, L. M. T., Mikkelsen, L. S., Brandsborg, E., Marcotte, H. Clostridium difficile, the difficult "kloster" fuelled by antibiotics. Curr Microbiol. 76 (6), 774-782 (2019).
  8. Sholeh, M., et al. Antimicrobial resistance in Clostridioides (Clostridium) difficile derived from humans: A systematic review and meta-analysis. Antimicrob Resist Infect Control. 9 (1), 158(2020).
  9. Peng, Z., et al. Update on antimicrobial resistance in Clostridium difficile: Resistance mechanisms and antimicrobial susceptibility testing. J Clin Microbiol. 55 (7), 1998-2008 (2017).
  10. Dilnessa, T., Getaneh, A., Hailu, W., Moges, F., Gelaw, B. Prevalence and antimicrobial resistance pattern of Clostridium difficile among hospitalized diarrheal patients: A systematic review and meta-analysis. PLoS One. 17 (1), e0262597(2022).
  11. Hopkins, R. J., Wilson, R. B. Treatment of recurrent Clostridium difficile colitis: A narrative review. Gastroenterol Rep (Oxf). 6 (1), 21-28 (2018).
  12. Bartlett, J. G. Treatment of antibiotic-associated pseudomembranous colitis. Rev Infect Dis. 6 (Suppl 1), S235-S241 (1984).
  13. Merino, E., Salavert, M. Treatment of Clostridioides difficile infection: From guidelines to clinical practice. Rev Esp Quimioter. 35 (Suppl 3), 97-101 (2022).
  14. Pepin, J., et al. Increasing risk of relapse after treatment of Clostridium difficile colitis in Quebec, Canada. Clin Infect Dis. 40 (11), 1591-1597 (2005).
  15. Cornely, O. A., Miller, M. A., Louie, T. J., Crook, D. W., Gorbach, S. L. Treatment of first recurrence of Clostridium difficile infection: Fidaxomicin versus vancomycin. Clin Infect Dis. 55 (Suppl 2), S154-S161 (2012).
  16. Mcfarland, L. V., Elmer, G. W., Surawicz, C. M. Breaking the cycle: Treatment strategies for 163 cases of recurrent Clostridium difficile disease. Am J Gastroenterol. 97 (7), 1769-1775 (2002).
  17. Mcfarland, L. V., et al. A randomized placebo-controlled trial of Saccharomyces boulardii in combination with standard antibiotics for Clostridium difficile disease. JAMA. 271 (24), 1913-1918 (1994).
  18. Kamboj, M., et al. Relapse versus reinfection: Surveillance of Clostridium difficile infection. Clin Infect Dis. 53 (10), 1003-1006 (2011).
  19. Figueroa, I., et al. Relapse versus reinfection: Recurrent Clostridium difficile infection following treatment with fidaxomicin or vancomycin. Clin Infect Dis. 55 (Suppl 2), S104-S109 (2012).
  20. Castro-Cordova, P., et al. Entry of spores into intestinal epithelial cells contributes to recurrence of Clostridioides difficile infection (vol 12, 1140, 2021). Nat Commu. 13 (1), 2456(2021).
  21. Orazi, G., O'toole, G. A. "It takes a village": Mechanisms underlying antimicrobial recalcitrance of polymicrobial biofilms. J Bacteriol. 202 (1), e00530-e00619 (2019).
  22. Costerton, J. W., et al. Bacterial biofilms in nature and disease. Annu Rev Microbiol. 41, 435-464 (1987).
  23. Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections. Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).
  24. Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: Survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev. 15 (2), 167-193 (2002).
  25. Donlan, R. M. Biofilms: Microbial life on surfaces. Emerg Infect Dis. 8 (9), 881-890 (2002).
  26. Scherr, T. D., Heim, C. E., Morrison, J. M., Kielian, T. Hiding in plain sight: Interplay between Staphylococcal biofilms and host immunity. Front Immunol. 5, 37(2014).
  27. Thomsen, K., et al. Animal models of chronic and recurrent Pseudomonas aeruginosa lung infection: Significance of macrolide treatment. Apmis. 130 (7), 458-476 (2022).
  28. Normington, C., et al. Biofilms harbour Clostridioides difficile, serving as a reservoir for recurrent infection. NPJ Biofilms Microbiomes. 7 (1), 16(2021).
  29. Frost, L. R., Cheng, J. K. J., Unnikrishnan, M. Clostridioides difficile biofilms: A mechanism of persistence in the gut. PLoS Pathog. 17 (3), e1009348(2021).
  30. Meza-Torres, J., Auria, E., Dupuy, B., Tremblay, Y. D. N. Wolf in sheep's clothing: Clostridioides difficile biofilm as a reservoir for recurrent infections. Microorganisms. 9 (9), 1922(2021).
  31. James, G. A., et al. Analysis of Clostridium difficile biofilms: Imaging and antimicrobial treatment. J Antimicrob Chemother. 73 (1), 102-108 (2018).
  32. Brauer, M., et al. What's a biofilm?-how the choice of the biofilm model impacts the protein inventory of Clostridioides difficile. Front Microbiol. 12, 682111(2021).
  33. Poquet, I., et al. Clostridium difficile biofilm: Remodeling metabolism and cell surface to build a sparse and heterogeneously aggregated architecture. Front Microbiol. 9, 2084(2018).
  34. Crowther, G. S., et al. Comparison of planktonic and biofilm-associated communities of Clostridium difficile and indigenous gut microbiota in a triple-stage chemostat gut model. J Antimicrob Chemother. 69 (8), 2137-2147 (2014).
  35. Crowther, G. S., et al. Development and validation of a chemostat gut model to study both planktonic and biofilm modes of growth of Clostridium difficile and human microbiota. PLoS One. 9 (2), e88396(2014).
  36. Dawson, L. F., Valiente, E., Faulds-Pain, A., Donahue, E. H., Wren, B. W. Characterisation of Clostridium difficile biofilm formation, a role for spo0a. PLoS One. 7 (12), e50527(2012).
  37. Dubois, T., et al. A microbiota-generated bile salt induces biofilm formation in Clostridium difficile. NPJ Biofilms Microbiomes. 5 (1), 14(2019).
  38. Abdelkhalek, A., Mohammad, H., Mayhoub, A. S., Seleem, M. N. Screening for potent and selective anticlostridial leads among fda-approved drugs. J Antibiot (Tokyo). 73 (6), 392-409 (2020).
  39. Chen, J., Lu, Y., Du, Y., Wang, H., Wu, Q. Recent development of small-molecular inhibitors against Clostridioides difficile infection. Bioorg Chem. 125, 105843(2022).
  40. Katzianer, D. S., Yano, T., Rubin, H., Zhu, J. A high-throughput small-molecule screen to identify a novel chemical inhibitor of Clostridium difficile. Int J Antimicrob Agents. 44 (1), 69-73 (2014).
  41. Pal, R., Dai, M., Seleem, M. N. High-throughput screening identifies a novel natural product-inspired scaffold capable of inhibiting Clostridioides difficile in vitro. Sci Rep. 11 (1), 10913(2021).
  42. Sun, X., et al. Mouse relapse model of Clostridium difficile infection. Infect Immun. 79 (7), 2856-2864 (2011).
  43. Edwards, A. N., Mcbride, S. M. Isolating and purifying Clostridium difficile spores. Methods Mol Biol. 1476, 117-128 (2016).
  44. Romo, J. A., Kumamoto, C. A. Characterization of the effects of Candida gastrointestinal colonization on Clostridioides difficile infection in a murine model. Methods Mol Biol. 2542, 271-285 (2022).
  45. Sorg, J. A., Dineen, S. S. Laboratory maintenance of Clostridium difficile. Curr Protoc Microbiol. Chapter 9 (Unit9A), 1(2009).
  46. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: Plating methods. J Vis Exp. (63), e3064(2012).
  47. Dapa, T., Unnikrishnan, M. Biofilm formation by Clostridium difficile. Gut Microbes. 4 (5), 397-402 (2013).
  48. O'toole, G. A. Microtiter dish biofilm formation assay. J Vis Exp. (47), e2437(2011).
  49. Ethapa, T., et al. Multiple factors modulate biofilm formation by the anaerobic pathogen Clostridium difficile. J Bacteriol. 195 (3), 545-555 (2013).
  50. Morais, M., et al. Comparative biofilm-forming ability between Clostridioides difficile strains isolated in Latin America and the epidemic nap1/027 strain. Front Cell Infect Microbiol. 12, 1033698(2022).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Formación de biopelículasensayo metabólicosusceptibilidad a fármacoslectura de biomasacribado de fármacosinfección recurrentediana terapéutica

Este artículo ha sido publicado

Video próximamente

Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Términos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.