Artículo de método

Detección de la rigidez de la membrana del retículo endoplasmático asociada a mitocondrias utilizando biosensores de FRET inducibles

DOI:

10.3791/67914

⸱

7 de agosto de 2026

 ,  , 
1Genetics and Aging Research Unit, MassGeneral Institute for Neurodegenerative Disease, Henry and Allison McCance Center for Brain Health, Department of Neurology, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School,

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Describimos un método para medir los valores de FRET de biosensores FRET inducibles dirigidos al RE (etiquetado con CFP) o mitocondrias (marcado con YFP ) in vitro , con el fin de evaluar la estanqueidad de las membranas RE asociadas a mitocondrias (MAMs), que influyen en la generación de Aβ, y este método puede utilizarse para el cribado inicial de agentes moduladores sintéticos o naturales de MAM como posibles terapias para la EA.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Múltiples estudios han demostrado que el número, la longitud y el ancho de la brecha (grosor) de los contactos ER-mitocondrias, o membranas asociadas a mitocondrias (MAMs), influyen en sus roles biológicos. Nuestro trabajo previo mostró que la estabilización de MAMs ajustados, caracterizados por un ancho de espacio de aproximadamente 7 nm, conduce a un aumento en los niveles de β amiloide (Aβ), mientras que la presencia de MAMs sueltos, con un ancho de espacio de alrededor de 40 nm, reduce la producción de Aβ en un modelo neural tridimensional (3D) de la enfermedad de Alzheimer (EA). Para investigar los efectos de las MAMs con diferentes anchos de espacio, se desarrollaron biosensores FRET (Transferencia de Resonancia de Energía de Förster) dirigidos a RE y mitocondrias—ER-CFP (proteína fluorescente cian) y Mito-YFP (proteína fluorescente amarilla), respectivamente—para cuantificar MAMs ajustadas (ancho de espacio de <10 nm) en contraste con MAMs sueltos o no MAMs. El FRET ocurre cuando el fluoróforo donante (CFP) y el fluoróforo aceptor (YFP) están a menos de 10 nm entre sí, lo que hace que este sistema sea adecuado para evaluar la proximidad de la MAM. Este protocolo describe el uso de FRET ratiométrico espectral para medir la extensión de la formación de MAM ajustada.

Introducción

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Los contactos del retículo endoplásmico asociado a mitocondrias (MERC), que se aíslan bioquímicamente como membranas de reflujo endoplasmático asociadas a mitocondrias (MAMs), están implicados en varios trastornos neurodegenerativos, incluyendo la enfermedad de Alzheimer (EA)1. La recientemente propuesta "hipótesis de la MAM" sugiere que las MAMs desempeñan un papel central en la generación de β amiloide (Aβ), iniciando así la cascada patógena de la EA. Esta cascada incluye la formación de enredos neurofibrilares (NFTs), dishomeostasis calcio yneuroinflamación 2. Las MAMs consisten en microdominios lipídicos ricos en colesterol, similares a balsas, situados en el retículo endoplasmático y la membrana mitocondrial externa (OMM), conectados por proteínas específicas de anclaje que contribuyen tanto a su diversidad estructural comofuncional 3. La estabilización de los contactos de mitocondrias RE influye en varios procesos celulares, incluyendo la señalización de calcio en RE y laapoptosis 4,5. Se estima que entre el 5% y el 20% de las mitocondrias forman contacto físico con el RE para establecerMAMs 6. Varios estudios han indicado que el número, la longitud y el ancho de la brecha (grosor) entre el RE y las mitocondrias en los sitios de MAM son determinantes importantes de sus funciones funcionales. La criomicroscopía electrónica y los análisis in vivo del hígado de ratón han demostrado que el estado metabólico de los hepatocitos modula tanto el grosor (que va de 14 nm a 20 nm) como la longitud (que varía de 145 nm a 270 nm) de losMAMs 7.

Las MAMs también están emergiendo como posibles objetivos terapéuticos para diversos trastornos, incluyendo el cáncer y trastornos metabólicos. El grosor o ancho de la brecha de la MAM regula la supervivencia celular. Los estabilizadores constitutivos de MAM, MAM 1X y MAM 9X, diseñados para estabilizar MAMs compactos (6 nm ± ancho de hueco de 1 nm) y flojos (24 nm ± ancho de brecha de 3 nm), respectivamente, demostraron que la estabilización de MAMs compactos aumentó drásticamente la generación de Aβ en un novedoso modelo de cultura neuronal 3D de la EA. En cambio, la estabilización de los MAMs flojos no tuvo efecto8. Por tanto, convertir la estabilización de MAMs compactos en MAMs flojos puede ser beneficioso para reducir la patología amiloide. Las complejidades estructurales y funcionales y la falta de un análisis cuantitativo preciso sobre el grado de estabilización del MAM hacen que dirigir los MAM para el descubrimiento de fármacos sea un reto. Un novedoso análisis de imagen de células vivas y cimografía de la velocidad axonal de las mitocondrias unidas al RE demostró que la velocidad axonal de las mitocondrias puede usarse como métrica para medir cuantitativamente la estabilización de la MAM, ya que un contacto más estrecho con el RE redujo significativamente la velocidad axonal mitocondrial en comparación con las mitocondriaslibres 8,9. Utilizando un estabilizador inducible de MAMs en células Neuro 2A (N2AAPP) que expresanhAPP 8, encontramos que el estrechamiento de los anchos de la brecha de MAM aumenta la generación de Aβ de manera dependientede la dosis 8. Los estabilizadores inducibles de MAM son plásmidos de expresión que codifican los biosensores dirigidos a ER marcados por CFP (proteína de fluorescencia cian) y los biosensores que dirigen a mitocondrias marcados por YFP (proteína de fluorescencia amarilla) y que se fusionan con los dominios de unión a la rapamicina inducible FK506 (FRB) o la proteína de unión a FK506 (FKBP) de 12 kDa (12 kDa). Los biosensores se denominaron ER-CFP y Mito-YFP, respectivamente. El CFP es un fluoróforo donante que transfiere energía al fluoróforo aceptor YFP cuando están separados por >10 nm. Las células (N2A APP) que expresan los biosensores inducibles aumentaron la generación de Aβ tras el tratamientocon rapamicina 8, lo que sugiere que aumentar las MAMs ajustadas incrementó la generación de Aβ. Estos métodos serán beneficiosos para el cribado de moduladores de pequeñas moléculas de las MAM y su concentración efectiva necesaria para lograr la estabilización de un nivel óptimo de MAM compactas que conviertan las MAM patógenas ("aumento de Aβ") en terapéuticas ("reduciendo el Aβ") sin desestabilizar completamente los contactos de RE y mitocondrias, algo importante para la supervivencia celular.

Modelo experimental
Este estudio utilizó células Neuro2A(N2A) que expresan constitutivamente APP751 (N2A APP). Estas células liberan niveles detectables de Aβ en el medio condicionado (CM) en comparación con las células N2A naïf. Las célulasN2A APP se mantuvieron en DMEM suplementadas con 10% FBS, 100 U/mL penicilina, 100 μg/mL estreptomicina y 2 mM L-glutamato suplementados con 200 μg/mL G418, como se describióanteriormente, 10.

Plásmido de expresión
Se generó un plásmido de expresión fusionando la secuencia de direccionamiento mitocondrial marcada con YFP (proteína fluorescente amarilla) de la proteína ancla A-quinasa 1 de mamíferos [AKAP1(34-63)] y la secuencia de direccionamiento ER marcada por CFP (proteína fluorescente cian) de la fosfatasa Sac1 [Sac1(521-587)] con una secuencia autoclisante de Tav2A que codifica la secuencia peptídica EGRGSLLTCGDVEENPGP, denotada como pYFP-AKAP1-Tav2A-Sac1-CFP8. El plásmido de expresión fusionado con Tav2A también está flanqueado por secuencias nucleótidicas que codifican el dominio de unión a la rapamicina FK506 (FRB) [EMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPL HAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNV (K 2095P)DLTQAWDLYYHVFRRISKQ] o el dominio de unión a la proteína FK506 (FKBP) de 12 kDa (MGVEKQVIRPGNGPKPAPGQTVTVHCTGFGKD GDLSQKFWSTKDEGQKFFSFSFQIGKGAVIKGWDEGMQ IGEVARLRCSSDYAYGAGGFPAWGIQPNSVLDFEIEVLSVQ). El plásmido de fusión FRB-YFP-AKAP1(34-63)-Tav2A-Sac1(521-587)-CFP-FKBP, aquí denotado como MAM-Tav2A, se generó para obtener los niveles de expresión equimolar de FRB-YFP-AKAP1(34-63) y Sac1(521-587)-CFP-FKBP para el análisis ratiométrico de FRET. El Sac1(521-587)-CFP-FKBP, denotado como ER-CFP, es el fluoróforo donante, mientras que Mito-YFP-FRB, denotado como Mito-YFP, es el fluoróforo aceptor que genera FRET cuando se está separado por ~10 nm8. Así, los biosensores basados en FRET detectan MAMs ajustados (6-10 nm, ancho de hueco). El FRB y el FKBP se introdujeron para inducir el estrechamiento de los anchos de la brecha del MAM tras la adición de rapamicina de manera dependiente de la dosis, lo cual podía cuantificarse midiendo el aumento de la señalFRET 8.

Protocolo

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Los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Transfección

  1. Transfectar célulasN2A APP con plásmido de expresión MAM-Tav2A (14-18 h).
    1. Antes de comenzar, la placa 1 × 106 célulasN2A APP por pozo de placas de 6 pozos que contienen cubiertas de vidrio y mantener las células en el medio de crecimiento durante 12-16 horas.
    2. Transfecte 1-3 μg de plásmido MAM-Tav2A (Archivo suplementario 1) usando reactivo de transfección de lipofectamina siguiendo el protocolo del fabricante.
    3. Después de 12-16 horas de transfección, realiza el tratamiento farmacológico.
      NOTA: Siempre se transfectan células con un plásmido de expresión que codifique únicamente al donante (ER-CFP) o al aceptor (Mito-YFP) para usarse como fondo de trastes.

2. Tratamiento de las drogas

  1. Tratar las células deAPP de N2A que expresan MAM-Tav2A con Rapamicina (Rapa) o Rapalog (Log) (3-6 horas).
    1. Antes del tratamiento, prepare soluciones de reserva (10 mM) de Rapa y Log.
    2. Cambia el medio por un medio fresco que contenga Rapa o Log de 0 nM, 100 nM o 250 nM.
    3. Tras 3 horas de tratamiento, añade paraformaldehído (PFA) al 3,3% para fijar las células.
    4. Prepara las láminas para la microscopía confocal de fluorescencia colocando una gota de reactivo antidesvanecimiento.
    5. Monta las cubiertas sobre la gota y presiona suavemente con las pinzas.
      NOTA: Las cubiertas de cristal son frágiles y requieren precaución. Como alternativa a las cubiertas de vidrio, utiliza placas inferiores de vidrio. La principal desventaja de usar placas con fondo de vidrio es que no se puede usar el reactivo antifundido, lo que dificulta la obtención de imágenes debido al blanqueamiento de los fluoróforos. NO uses reactivos antifundido que contengan DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol) porque su fluorescencia azul interferirá con el traste entre CFP y YFP.

3. Microscopía confocal para transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET)

  1. Coloca las láminas bajo un microscopio invertido y ajusta el enfoque del microscopio hasta que las células se vuelvan visibles.
  2. Excita el fluoróforo usando un láser de 440 nm y captura imágenes con una emisión de 468-503 nm para el CFP DONANTE (FKBP-CFP-ER) o 525-565 nm para el receptor YFP (FRB-YFP-Mito).
  3. Ajusta la intensidad de la señal usando el filtro fluorescente incorporado hasta que la señal de fondo se disipe (debería quedar casi completamente negra).
    NOTA: Se utilizó un microscopio confocal para capturar imágenes fluorescentes utilizando el software NIS Element AR. Se utilizó una ampliación de 60x con una resolución de 512 píxeles.
  4. Guarda las imágenes como archivos .nds.
  5. Realizar análisis espectral de FRET ratiométricos.

4. Análisis de FRET ratiométrico (6 - 12 h)

NOTA: Se detectó emisión de fluorescencia del donante ER-CFP (468-503 nm) y del aceptor Mito-YFP (525-565 nm) mediante un microscopio confocal. El software ImageJ se utilizó para cuantificar la intensidad media de fluorescencia de píxeles tras la resta de fondo. Se calculó la relación entre la intensidad de emisión de YFP y CFP se utilizó como lectura para el análisis espectral de FRET.

  1. Imagen abierta J (Fiyi).
  2. O bien arrastra el archivo .nds a la Imagen J, o pulsa Archivo -> Abrir y selecciona la Imagen.
  3. En la siguiente pantalla, selecciona la casilla Dividir canales .
  4. Haz clic en el panel C = 0 .
  5. Haz clic en Analizar -> Medida.
    NOTA: Anota el Valor Medio para un cálculo posterior.
  6. Haz clic en Proceso -> Matemáticas -> Restar.
  7. Introduce el valor medio.
  8. Repite el paso 4 para el panel C = 1.
  9. Haz clic en la herramienta de selección a mano alzada .
  10. Rodea una celda de interés y luego pulsa Ctrl+T para registrarla en el ROI.
  11. Haz clic en Mostrar Todo al final del ROI para mostrar lo que ya has seleccionado.
  12. Selecciona todas las celdas seleccionadas y haz clic en Medir, Registrar estos valores en Excel.
  13. Haz clic en el panel C = 1 y haz clic en Mostrar todo.
  14. Selecciona todas las celdas y haz clic en Medir de nuevo, y registra estos valores en una columna separada en Excel.
  15. En Excel, crea una función para poner los valores de la señal donante sobre el receptor (C0/C1). Esta es la relación FRET.

Resultados

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El análisis ratiométrico de FRET de células N2AAPP enriquecidas con FACS que expresan MAM-Tav2A demostró un aumento dependiente de la dosis en los niveles de Aβ40 tras el tratamientocon rapamicina 8. La rapamicina actúa inhibiendo la vía de señalización del objetivo mamífero de la rapamicina (mTOR), que a su vez regula a la baja la expresión de TREM2 (Receptor Desencadenante Expresado en Células Mieloides 2) en la microglía, lo que conduce a una reducción de la eliminación de la placa Aβ en modelos murinos 5XFAD de la enfermedad deAlzheimer 11. El AP21967 análogo de la rapamicina, comúnmente conocido como rapalog (Log), muestra baja afinidad por el mTOR y, por tanto, es relativamente no tóxico para las células. Sin embargo, conserva la capacidad de unirse al dominio FRB con la misma afinidad que la rapamicina, debido a una mutación compensatoria formadora de cavidad (K2095P) introducida en el dominioFRB 12.

El tratamiento con Rapa y Log aumentó la relación FRET (Figura 1). El tratamiento mostró poco o ningún efecto sobre los niveles de APP u otras proteínas MAM, como IP3R3 o VDAC1. Así, aumentar las MAMs tensas (<10 nm) incrementó la generación de Aβ in vitro8. Cabe destacar que los ensayos FRET realizados en células N2A naïf también generaron resultados similares.

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Figura 1: El estrechamiento de los anchos de la brecha del MAM aumentó la generación de Aβ in vitro. (A) Esquema del estabilizador inducible de MAM CFP-FRB-ER-Tav2A-Mito-FKBP-YFP (MAM-Tav2A) que sufre auto-escindimiento, generando niveles equimolares del donante (CFP-FRB-ER o ER-CFP) y del aceptor (Mito-FKBP-YFP o Mito-YFP), y promueve FRET/FLIM cuando se está unido a los MAMs endógenos ajustados o al potenciar la formación de MAM ajustada induciendo la interacción FRB y FKBP con Rapamicina (Rapa) o su análogo Rapalog (Log). (B) IB de células que expresan MAM-Tav2A (Tav2A) mostrando la expresión equimolar de la CFP-ER (caja azul) y Mito-YFP (caja amarilla) tras la auto-escissión de Tav2A. (C) Imágenes confocales de células tratadas con DMSO (Veh) o Rapa (250 nM) que sobreexpresan MAM-Tav2A. (D,E). Análisis ratiométrico de FRET de células tratadas sin (Veh) o con rapamicina (Rapa) (D) o rapalog (Log) (E) de 100 nM. Los valores FRET se presentan como razones de intensidades entre el canal 2 (465-500 nm) y el canal 1 (525-555 nm). Por cada análisis de FRET, se seleccionaron aleatoriamente entre 40 y 50 celdas para generar ROIs célula por célula. ANOVA unidireccional. p < 0,0001. (F) Imagen representativa Western blot de célulasAPP que expresan MAM-Tav2A tras un tratamiento de 24 horas con Rivastigmina (Riv: 0 o 50 μM). MAM-Tav2A generó niveles equimolares del donante (CFP-ER) y del aceptador (Mito-YFP). (G) Cuantificación de la relación FRET entre el donante y el aceptador de un tratado con vehículo (0 μM) o tratado con Riv (50 μM). (H) El ELISA Aβ (Wako) del medio acondicionado (CM) de células tratadas con vehículo (0 μM) o tratadas con Riv (50 μM) mostró una reducción significativa de los niveles de Aβ40 (pM) tras el tratamiento con Riv de 50 μM. n = 6, p < 0,001. (I) Se tabulan los valores de FRET (ratio) y Aβ (pM). Las figuras han sido modificadas a partir de Zellmer etal 8. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Archivo suplementario 1: archivo de secuencia de plásmidos MAM-Tav2A. La secuencia de ADN del plásmido de expresión que codifica la secuencia Sac1 dirigida a ER (521FLALPIIMVVAFSMCIICLLMA GDTWTETLAYVLFWGVASIGTFFIILYNGKDFVDAPRLVQKEKID 587) vinculada a la secuencia FKBP y CFP, y la secuencia AKAP1 dirigida a mitocondrias (34SSHDEQQVEAGAVQLRADPAIKEPLPVEDV63) vinculada a FRB y YFP vinculada a la secuencia Tav2A auto-clivada (EGRGSLLTCGD VEENPGP). Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

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La modulación de las MAMs es un área emergente de investigación con posibles implicaciones para diversos trastornos, incluyendo el cáncer, trastornos metabólicos y enfermedadesneurodegenerativas 13. Muchos agentes farmacológicos, incluyendo el antagonista de la dinaína LDC-3/Dinastopina, el fármaco antidiabético metformina y el agente anticancerígeno sulforafano, alteran las MAM y actualmente están en ensayos preclínicos y clínicos para el cáncer y trastornos metabólicos. Estos agentes farmacológicos modulan los contactos ER-mitocondrias o anchos de contacto MAM regulando las interacciones entre proteínas que conectan a MAM como PTPIP51, VAPB, VDAC1, PACS2, MFN2, VDAC1 e IP3R3 14,15,16,17,18,19,20. El antagonista del receptor sigma-1 (S1R) (NE-100) redujo las MAMs y redujo drásticamente los niveles axonales de Aβ en un modelo neuronal 3D dela EA 21. Un informe reciente demostró que la pérdida de S1R aumentó las MAMs flojas y disminuyó las MAMs tensas, sugiriendo S1R como un objetivo terapéutico para modular la tenacidadde la MAM 8,9.

La imagen en vivo de FRET (transferencia de energía por resonancia de fluorescencia) de neuronas derivadas de ratas transgénicas de la enfermedad de Alzheimer (EA) reveló una alteración significativa en MAMs ajustadas (<10 nm), sin cambio observable en MAM sueltas (~20 nm), en comparación con las de controles de tiposalvaje 1. Estabilizadores MAM inducibles basados en FRET/FLIM que incorporan dominios de dimerización FRB inducibles por rapamicina (Rapa)/rapalog (Log), expresados en célulasAPP N2A, demostraron que el tratamiento con Rapa/Log mejoró la tenacidad del MAM e incrementó la producción de Aβ40 de manera dependientede la dosis 8,9. Esto proporcionó la primera prueba de concepto de que el estrechamiento del ancho de la brecha del MAM favorece el procesamiento amiloidogénico. El fármaco antiamnésico aprobado por la FDA rivastigmina, actualmente en investigación preclínica para la EAleve a moderada 22,23, redujo significativamente los niveles de Aβ40 (p < 0,001) sin alterar la expresión de VDAC1 o BACE1, ni afectar la frecuencia de colocalización entre CFP-ER y Mito-YFP 8,9. La rivastigmina parece influir en la estabilización de la MAM modulando los niveles de la proteína anclaje de la MAM mitofusina-2 (MFN2)24. Este hallazgo coincide con otros estudios que informan que la rivastigmina reduce los niveles de Aβ en neuronas cultivadas y modelos murinos con EA (3xTg)25,26. Como el ancho de la brecha de la MAM regula varios procesos celulares esenciales para la supervivencia celular27, la modulación dirigida de la estabilidad de la MAM puede ofrecer una estrategia terapéutica más eficaz contra la acumulación de Aβ que la desestabilización completa de las MAMs, que podría provocar efectos adversos no deseados.

Una limitación importante del método es que la técnica de FRET ratiométrico depende de la expresión equimolar del donante y del aceptor. La coexpresión de los plásmidos de expresión que codifican al donante o al aceptador producirá resultados inconsistentes. El uso de un Tav2A auto-clivagante que conecta los biosensores donantes y aceptadores asegura la expresión equimolar de los biosensores. Sin embargo, los niveles de expresión de los biosensores se comprobaron mediante análisis por Western blot antes del análisis FRET.

La rapamicina (Rapa) puede no ser ideal para evaluar los efectos del estrechamiento de la MAM en la producción de Aβ, ya que inhibe el objetivo mamífero de la vía de señalización de la rapamicina (mTOR), lo que conduce a la regulación a la baja de TREM2 (Receptor Desencadenante Expresado en las Células Mieloides 2) en la microglía y, en consecuencia, reduce la eliminación de la placa Aβ en modelos murinos con enfermedad de Alzheimer (EA) (5XFAD)11. Como alternativa, se puede utilizar el AP21967 análogo de la rapamicina, comúnmente conocido como rapalog (Log). El log presenta baja afinidad de unión con el mTOR, lo que lo hace relativamente no tóxico para las células. Sin embargo, conserva la capacidad de unirse al dominio FRB con afinidad similar a la rapamicina, debido a la introducción de una mutación compensatoria formadora de cavidades (K2095P) en el dominioFRB 12.

El método descrito tiene una gran importancia. A pesar de la evidencia de varios estudios preclínicos que muestran efectos terapéuticos prometedores de moduladores sintéticos o naturales de pequeñas moléculas de las MAMs en el cáncer y trastornos metabólicos, aún no se han realizado ensayos clínicos. Una de las principales razones de esto es la falta de un método fiable que pueda medir cuantitativamente la estabilidad de la MAM, un requisito previo para desarrollar terapias eficaces. La cuantificación de la relación estructura-función de la MAM requiere una visión completa de la célula, lo cual no puede lograrse para neuronas maduras con las microscopas tradicionales de MET u otras de alta resolución, pero sí puede obtenerse con una baja ampliación28. Así, técnicas tradicionales como TEM, crio-TEM o Microscopias Electrónicas de Barrido (SEM) pueden detectar estructuras celulares a nivel nanométrico, pero tienen limitaciones a la hora de medir el grado de estabilización de la MAM, ya que la naturaleza altamente dinámica de las mitocondrias29 y el ER30,31 hace que las estructuras de la MAM seantransitorias 32,33,34 . Para investigar la relación estructura-función de la MAM, se ha propuesto medir la velocidad axonal de las mitocondrias conectadas al RE mediante MAMs ajustadas o sueltas mediante imágenes de células vivas y análisis de lacimografía 8,9. Esto es coherente con los informes que demuestran una disminución del transporte axonal de mitocondrias en neuronas corticales de cerebros con EA35 y células cibridas diferenciadasde EA 36. A pesar de la alta precisión cuantitativa, la técnica de imagen de células vivas puede no ser útil para el cribado de fármacos de alto rendimiento. En cambio, el análisis FRET/FLIM puede aplicarse como una técnica cuantitativa más rápida que la microscopía de células vivas o de alta resolución existente en el futuro para identificar terapias de moléculas pequeñas para la EA.

Se ha demostrado que el protocolo FRET descrito aquí es aplicable específicamente en el contexto de la conexión artificial inducida entre el RE y las mitocondrias. Su simplicidad permite una evaluación eficiente de la estabilidad del contacto con las mitocondrias de RE e la investigación de los efectos resultantes en la patología amiloide, que constituye el objetivo principal de este enfoque. Nuestro objetivo es utilizar aún más este método para analizar una biblioteca de moléculas pequeñas potencialmente moduladoras de MAM dentro de una plataforma de cribado de fármacos 3D tridimensional (3D) desarrollada recientemente, la 37. Los resultados serán inmensamente útiles para seleccionar posibles moduladores MAM de moléculas pequeñasanti-Aβ 13 in vitro que puedan extenderse a estudios in vivo o clínicos en el futuro.

Agradecimientos

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Agradecemos sinceramente al Dr. Rudolph E. Tanzi, profesor en el Massachusetts General Hospital (MGH), por sus comentarios perspicaces sobre el manuscrito. Agradecemos al Dr. Masato Maesako, profesor adjunto en MGH, por compartir su experiencia en ensayos FLIM. Agradecemos al Dr. Gyorgy Hajnoczky, profesor de la Universidad Thomas Jefferson de Filadelfia, por proporcionarnos generosamente plásmidos de expresión que codifican ER-CFP o Mito-YFP. Este estudio fue apoyado por el Fondo Cure Alzheimer's para RB.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
BSAFisher Scientific501781532
Confocal microscope Olympus FV3000RS (Tokyo, Japón)N/A
DMEM con suplemento GlutaMAXGibco/Thermo Fisher Scientific10564011
EDTA  Life Technologies41116134
Placas de 6 pocillos Falcon VWR International41122107
Anticuerpo policlonal GAPDHThermo Fisher ScientificPA1-988
Gelatin VWR International9000-70-8
Geneticina (G418 Sulfato)Gibco/Thermo Fisher Scientific10131035
Anticuerpo monoclonal GFPInvitrogenMA5-15256
Graphpad Prism N/APrism 9, versión 9.5.0N/A
HeparinaSigma-Aldrich H0200000
Software ImageJ ImageJ 1.53aN/A
Microscopio confocal invertido Nikon (C2 Eclipse Ti2)N/A
Lipofectamine2000Invitrogen11668027
MS Excel  Microsoft Excel, versión 2302N/A
NaCl  Fisher Scientific7647145
Gel NuPAGE 4–12% Bis-Tris  InvitrogenNP0321BOX
Penicilina/Estreptomicina/Anfotericina B Lonza 17-745E
PhotoshopAdobe Photoshop CC 20.0.10 N/A
Tris-HCL, pH 7.6  Boston BioProducts42000000
Triton X-100  Sigma-AldrichT8787
Trypsin-EDTAGibco/Thermo Fisher Scientific25200056
Tween 20Fisher Scientific501657287

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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