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Artículo de método

Detección de la rigidez de la membrana del retículo endoplasmático asociada a mitocondrias utilizando biosensores de FRET inducibles

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DOI:

10.3791/67914

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7 de agosto de 2026

 ,  , 
1Genetics and Aging Research Unit, MassGeneral Institute for Neurodegenerative Disease, Henry and Allison McCance Center for Brain Health, Department of Neurology, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School,

En este artículo

Resumen

Describimos un método para medir los valores de FRET de biosensores FRET inducibles dirigidos al RE (etiquetado con CFP) o mitocondrias (marcado con YFP ) in vitro , con el fin de evaluar la estanqueidad de las membranas RE asociadas a mitocondrias (MAMs), que influyen en la generación de Aβ, y este método puede utilizarse para el cribado inicial de agentes moduladores sintéticos o naturales de MAM como posibles terapias para la EA.

Resumen

Múltiples estudios han demostrado que el número, la longitud y el ancho de la brecha (grosor) de los contactos ER-mitocondrias, o membranas asociadas a mitocondrias (MAMs), influyen en sus roles biológicos. Nuestro trabajo previo mostró que la estabilización de MAMs ajustados, caracterizados por un ancho de espacio de aproximadamente 7 nm, conduce a un aumento en los niveles de β amiloide (Aβ), mientras que la presencia de MAMs sueltos, con un ancho de espacio de alrededor de 40 nm, reduce la producción de Aβ en un modelo neural tridimensional (3D) de la enfermedad de Alzheimer (EA). Para investigar los efectos de las MAMs con diferentes anchos de espacio, se desarrollaron biosensores FRET (Transferencia de Resonancia de Energía de Förster) dirigidos a RE y mitocondrias—ER-CFP (proteína fluorescente cian) y Mito-YFP (proteína fluorescente amarilla), respectivamente—para cuantificar MAMs ajustadas (ancho de espacio de <10 nm) en contraste con MAMs sueltos o no MAMs. El FRET ocurre cuando el fluoróforo donante (CFP) y el fluoróforo aceptor (YFP) están a menos de 10 nm entre sí, lo que hace que este sistema sea adecuado para evaluar la proximidad de la MAM. Este protocolo describe el uso de FRET ratiométrico espectral para medir la extensión de la formación de MAM ajustada.

Introducción

Los contactos del retículo endoplásmico asociado a mitocondrias (MERC), que se aíslan bioquímicamente como membranas de reflujo endoplasmático asociadas a mitocondrias (MAMs), están implicados en varios trastornos neurodegenerativos, incluyendo la enfermedad de Alzheimer (EA)1. La recientemente propuesta "hipótesis de la MAM" sugiere que las MAMs desempeñan un papel central en la generación de β amiloide (Aβ), iniciando así la cascada patógena de la EA. Esta cascada incluye la formación de enredos neurofibrilares (NFTs), dishomeostasis calcio yneuroinflamación 2. Las MAMs consisten en microdominios lipídicos ricos en colesterol, similares a balsas, situados en el retículo endoplasmático y la membrana mitocondrial externa (OMM), conectados por proteínas específicas de anclaje que contribuyen tanto a su diversidad estructural comofuncional 3. La estabilización de los contactos de mitocondrias RE influye en varios procesos celulares, incluyendo la señalización de calcio en RE y laapoptosis 4,5. Se estima que entre el 5% y el 20% de las mitocondrias forman contacto físico con el RE para establecerMAMs 6. Varios estudios han indicado que el número, la longitud y el ancho de la brecha (grosor) entre el RE y las mitocondrias en los sitios de MAM son determinantes importantes de sus funciones funcionales. La criomicroscopía electrónica y los análisis in vivo del hígado de ratón han demostrado que el estado metabólico de los hepatocitos modula tanto el grosor (que va de 14 nm a 20 nm) como la longitud (que varía de 145 nm a 270 nm) de losMAMs 7.

Las MAMs también están emergiendo como posibles objetivos terapéuticos para diversos trastornos, incluyendo el cáncer y trastornos metabólicos. El grosor o ancho de la brecha de la MAM regula la supervivencia celular. Los estabilizadores constitutivos de MAM, MAM 1X y MAM 9X, diseñados para estabilizar MAMs compactos (6 nm ± ancho de hueco de 1 nm) y flojos (24 nm ± ancho de brecha de 3 nm), respectivamente, demostraron que la estabilización de MAMs compactos aumentó drásticamente la generación de Aβ en un novedoso modelo de cultura neuronal 3D de la EA. En cambio, la estabilización de los MAMs flojos no tuvo efecto8. Por tanto, convertir la estabilización de MAMs compactos en MAMs flojos puede ser beneficioso para reducir la patología amiloide. Las complejidades estructurales y funcionales y la falta de un análisis cuantitativo preciso sobre el grado de estabilización del MAM hacen que dirigir los MAM para el descubrimiento de fármacos sea un reto. Un novedoso análisis de imagen de células vivas y cimografía de la velocidad axonal de las mitocondrias unidas al RE demostró que la velocidad axonal de las mitocondrias puede usarse como métrica para medir cuantitativamente la estabilización de la MAM, ya que un contacto más estrecho con el RE redujo significativamente la velocidad axonal mitocondrial en comparación con las mitocondriaslibres 8,9. Utilizando un estabilizador inducible de MAMs en células Neuro 2A (N2AAPP) que expresanhAPP 8, encontramos que el estrechamiento de los anchos de la brecha de MAM aumenta la generación de Aβ de manera dependientede la dosis 8. Los estabilizadores inducibles de MAM son plásmidos de expresión que codifican los biosensores dirigidos a ER marcados por CFP (proteína de fluorescencia cian) y los biosensores que dirigen a mitocondrias marcados por YFP (proteína de fluorescencia amarilla) y que se fusionan con los dominios de unión a la rapamicina inducible FK506 (FRB) o la proteína de unión a FK506 (FKBP) de 12 kDa (12 kDa). Los biosensores se denominaron ER-CFP y Mito-YFP, respectivamente. El CFP es un fluoróforo donante que transfiere energía al fluoróforo aceptor YFP cuando están separados por >10 nm. Las células (N2A APP) que expresan los biosensores inducibles aumentaron la generación de Aβ tras el tratamientocon rapamicina 8, lo que sugiere que aumentar las MAMs ajustadas incrementó la generación de Aβ. Estos métodos serán beneficiosos para el cribado de moduladores de pequeñas moléculas de las MAM y su concentración efectiva necesaria para lograr la estabilización de un nivel óptimo de MAM compactas que conviertan las MAM patógenas ("aumento de Aβ") en terapéuticas ("reduciendo el Aβ") sin desestabilizar completamente los contactos de RE y mitocondrias, algo importante para la supervivencia celular.

Modelo experimental
Este estudio utilizó células Neuro2A(N2A) que expresan constitutivamente APP751 (N2A APP). Estas células liberan niveles detectables de Aβ en el medio condicionado (CM) en comparación con las células N2A naïf. Las célulasN2A APP se mantuvieron en DMEM suplementadas con 10% FBS, 100 U/mL penicilina, 100 μg/mL estreptomicina y 2 mM L-glutamato suplementados con 200 μg/mL G418, como se describióanteriormente, 10.

Plásmido de expresión
Se generó un plásmido de expresión fusionando la secuencia de direccionamiento mitocondrial marcada con YFP (proteína fluorescente amarilla) de la proteína ancla A-quinasa 1 de mamíferos [AKAP1(34-63)] y la secuencia de direccionamiento ER marcada por CFP (proteína fluorescente cian) de la fosfatasa Sac1 [Sac1(521-587)] con una secuencia autoclisante de Tav2A que codifica la secuencia peptídica EGRGSLLTCGDVEENPGP, denotada como pYFP-AKAP1-Tav2A-Sac1-CFP8. El plásmido de expresión fusionado con Tav2A también está flanqueado por secuencias nucleótidicas que codifican el dominio de unión a la rapamicina FK506 (FRB) [EMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPL HAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNV (K 2095P)DLTQAWDLYYHVFRRISKQ] o el dominio de unión a la proteína FK506 (FKBP) de 12 kDa (MGVEKQVIRPGNGPKPAPGQTVTVHCTGFGKD GDLSQKFWSTKDEGQKFFSFSFQIGKGAVIKGWDEGMQ IGEVARLRCSSDYAYGAGGFPAWGIQPNSVLDFEIEVLSVQ). El plásmido de fusión FRB-YFP-AKAP1(34-63)-Tav2A-Sac1(521-587)-CFP-FKBP, aquí denotado como MAM-Tav2A, se generó para obtener los niveles de expresión equimolar de FRB-YFP-AKAP1(34-63) y Sac1(521-587)-CFP-FKBP para el análisis ratiométrico de FRET. El Sac1(521-587)-CFP-FKBP, denotado como ER-CFP, es el fluoróforo donante, mientras que Mito-YFP-FRB, denotado como Mito-YFP, es el fluoróforo aceptor que genera FRET cuando se está separado por ~10 nm8. Así, los biosensores basados en FRET detectan MAMs ajustados (6-10 nm, ancho de hueco). El FRB y el FKBP se introdujeron para inducir el estrechamiento de los anchos de la brecha del MAM tras la adición de rapamicina de manera dependiente de la dosis, lo cual podía cuantificarse midiendo el aumento de la señalFRET 8.

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Protocolo

Los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Transfección

  1. Transfectar célulasN2A APP con plásmido de expresión MAM-Tav2A (14-18 h).
    1. Antes de comenzar, la placa 1 × 106 célulasN2A APP por pozo de placas de 6 pozos que contienen cubiertas de vidrio y mantener las células en el medio de crecimiento durante 12-16 horas.
    2. Transfecte 1-3 μg de plásmido MAM-Tav2A (Archivo suplementario 1) usando reactivo de transfección de lipofectamina siguiendo el protocolo del fabricante.
    3. Después de 12-16 horas de transfección, realiza el tratamiento farmacológico.
      NOTA: Siempre se transfectan células con un plásmido de expresión que codifique únicamente al donante (ER-CFP) o al aceptor (Mito-YFP) para usarse como fondo de trastes.

2. Tratamiento de las drogas

  1. Tratar las células deAPP de N2A que expresan MAM-Tav2A con Rapamicina (Rapa) o Rapalog (Log) (3-6 horas).
    1. Antes del tratamiento, prepare soluciones de reserva (10 mM) de Rapa y Log.
    2. Cambia el medio por un medio fresco que contenga Rapa o Log de 0 nM, 100 nM o 250 nM.
    3. Tras 3 horas de tratamiento, añade paraformaldehído (PFA) al 3,3% para fijar las células.
    4. Prepara las láminas para la microscopía confocal de fluorescencia colocando una gota de reactivo antidesvanecimiento.
    5. Monta las cubiertas sobre la gota y presiona suavemente con las pinzas.
      NOTA: Las cubiertas de cristal son frágiles y requieren precaución. Como alternativa a las cubiertas de vidrio, utiliza placas inferiores de vidrio. La principal desventaja de usar placas con fondo de vidrio es que no se puede usar el reactivo antifundido, lo que dificulta la obtención de imágenes debido al blanqueamiento de los fluoróforos. NO uses reactivos antifundido que contengan DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol) porque su fluorescencia azul interferirá con el traste entre CFP y YFP.

3. Microscopía confocal para transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET)

  1. Coloca las láminas bajo un microscopio invertido y ajusta el enfoque del microscopio hasta que las células se vuelvan visibles.
  2. Excita el fluoróforo usando un láser de 440 nm y captura imágenes con una emisión de 468-503 nm para el CFP DONANTE (FKBP-CFP-ER) o 525-565 nm para el receptor YFP (FRB-YFP-Mito).
  3. Ajusta la intensidad de la señal usando el filtro fluorescente incorporado hasta que la señal de fondo se disipe (debería quedar casi completamente negra).
    NOTA: Se utilizó un microscopio confocal para capturar imágenes fluorescentes utilizando el software NIS Element AR. Se utilizó una ampliación de 60x con una resolución de 512 píxeles.
  4. Guarda las imágenes como archivos .nds.
  5. Realizar análisis espectral de FRET ratiométricos.

4. Análisis de FRET ratiométrico (6 - 12 h)

NOTA: Se detectó emisión de fluorescencia del donante ER-CFP (468-503 nm) y del aceptor Mito-YFP (525-565 nm) mediante un microscopio confocal. El software ImageJ se utilizó para cuantificar la intensidad media de fluorescencia de píxeles tras la resta de fondo. Se calculó la relación entre la intensidad de emisión de YFP y CFP se utilizó como lectura para el análisis espectral de FRET.

  1. Imagen abierta J (Fiyi).
  2. O bien arrastra el archivo .nds a la Imagen J, o pulsa Archivo -> Abrir y selecciona la Imagen.
  3. En la siguiente pantalla, selecciona la casilla Dividir canales .
  4. Haz clic en el panel C = 0 .
  5. Haz clic en Analizar -> Medida.
    NOTA: Anota el Valor Medio para un cálculo posterior.
  6. Haz clic en Proceso -> Matemáticas -> Restar.
  7. Introduce el valor medio.
  8. Repite el paso 4 para el panel C = 1.
  9. Haz clic en la herramienta de selección a mano alzada .
  10. Rodea una celda de interés y luego pulsa Ctrl+T para registrarla en el ROI.
  11. Haz clic en Mostrar Todo al final del ROI para mostrar lo que ya has seleccionado.
  12. Selecciona todas las celdas seleccionadas y haz clic en Medir, Registrar estos valores en Excel.
  13. Haz clic en el panel C = 1 y haz clic en Mostrar todo.
  14. Selecciona todas las celdas y haz clic en Medir de nuevo, y registra estos valores en una columna separada en Excel.
  15. En Excel, crea una función para poner los valores de la señal donante sobre el receptor (C0/C1). Esta es la relación FRET.

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Resultados

El análisis ratiométrico de FRET de células N2AAPP enriquecidas con FACS que expresan MAM-Tav2A demostró un aumento dependiente de la dosis en los niveles de Aβ40 tras el tratamientocon rapamicina 8. La rapamicina actúa inhibiendo la vía de señalización del objetivo mamífero de la rapamicina (mTOR), que a su vez regula a la baja la expresión de TREM2 (Receptor Desencadenante Expresado en Células Mieloides 2) en la microg...

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Discusión

La modulación de las MAMs es un área emergente de investigación con posibles implicaciones para diversos trastornos, incluyendo el cáncer, trastornos metabólicos y enfermedadesneurodegenerativas 13. Muchos agentes farmacológicos, incluyendo el antagonista de la dinaína LDC-3/Dinastopina, el fármaco antidiabético metformina y el agente anticancerígeno sulforafano, alteran las MAM y actualmente están en ensayos preclínicos y clínicos para el cáncer y trastornos meta...

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Agradecimientos

Agradecemos sinceramente al Dr. Rudolph E. Tanzi, profesor en el Massachusetts General Hospital (MGH), por sus comentarios perspicaces sobre el manuscrito. Agradecemos al Dr. Masato Maesako, profesor adjunto en MGH, por compartir su experiencia en ensayos FLIM. Agradecemos al Dr. Gyorgy Hajnoczky, profesor de la Universidad Thomas Jefferson de Filadelfia, por proporcionarnos generosamente plásmidos de expresión que codifican ER-CFP o Mito-YFP. Este estudio fue apoyado por el Fondo Cure Alzheimer's para RB.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
BSAFisher Scientific501781532
Confocal microscope Olympus FV3000RS (Tokyo, Japón)N/A
DMEM con suplemento GlutaMAXGibco/Thermo Fisher Scientific10564011
EDTA  Life Technologies41116134
Placas de 6 pocillos Falcon VWR International41122107
Anticuerpo policlonal GAPDHThermo Fisher ScientificPA1-988
Gelatin VWR International9000-70-8
Geneticina (G418 Sulfato)Gibco/Thermo Fisher Scientific10131035
Anticuerpo monoclonal GFPInvitrogenMA5-15256
Graphpad Prism N/APrism 9, versión 9.5.0N/A
HeparinaSigma-Aldrich H0200000
Software ImageJ ImageJ 1.53aN/A
Microscopio confocal invertido Nikon (C2 Eclipse Ti2)N/A
Lipofectamine2000Invitrogen11668027
MS Excel  Microsoft Excel, versión 2302N/A
NaCl  Fisher Scientific7647145
Gel NuPAGE 4–12% Bis-Tris  InvitrogenNP0321BOX
Penicilina/Estreptomicina/Anfotericina B Lonza 17-745E
PhotoshopAdobe Photoshop CC 20.0.10 N/A
Tris-HCL, pH 7.6  Boston BioProducts42000000
Triton X-100  Sigma-AldrichT8787
Trypsin-EDTAGibco/Thermo Fisher Scientific25200056
Tween 20Fisher Scientific501657287

Referencias

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