Múltiples tipos de células en la retina, incluidas las células endoteliales, las neuronas y las células gliales, expresan transportadores de glucosa (GLUT) para permitir la absorción de glucosa en las células. Utilizando retina neuronal de ratón ex vivo y el análogo de glucosa fluorescente 6-NBDG, describimos un método relativamente rápido y barato para medir la absorción de glucosa en toda la retina del ratón.
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Artículo de método
Medición de la absorción del análogo de glucosa, 6-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il)amino)-6-desoxiglucosa, en retina neural murina intacta
En este artículo
Resumen
Resumen
La retina es un tejido altamente metabólico con múltiples tipos de células que requieren glucosa y sus derivados para producir energía en forma de ATP. Las células de la retina, incluidas las células endoteliales, las neuronas, los fotorreceptores y las células gliales, expresan transportadores de glucosa (GLUT; por ejemplo, GLUT1-4) para permitir la absorción de glucosa para la producción de energía. GLUT1 es el transportador de glucosa más abundantemente expresado en la retina. Este protocolo permite a los investigadores medir la absorción de glucosa en la retina neural murina en condiciones ex vivo utilizando el análogo de glucosa fluorescente 6-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il)amino)-6-Desoxiglucosa (6-NBDG). Después de la disección de la retina, los niveles totales de 6-NBDG en la retina se pueden determinar fácilmente mediante la medición del punto final de fluorescencia utilizando un lector de placas. Para mantener la consistencia, recomendamos normalizar los resultados a los niveles totales de proteína. Aunque el 6-NBDG es altamente específico para GLUT1, la absorción de este análogo se detecta en presencia del inhibidor de GLUT1 BAY-876. Como tal, este ensayo proporciona un método relativamente rápido y económico para medir la absorción de glucosa ex vivo en la retina neural completa del ratón, que está parcialmente mediada por GLUT1.
Introducción
La glucosa es un metabolito esencial para la retina neural, donde se utiliza para alimentar altas tasas de glucólisis y respiración mitocondrial para producir energía en forma de trifosfato de adenosina (ATP)1. Dado que la glucosa es el sustrato energético preferido, muchas células de la retina expresan transportadores de glucosa (GLUT) para facilitar la absorción de glucosa de la vasculatura y el tejido circundante2. Las glut comprenden una familia de glicoproteínas de membrana intrínsecas que son responsables del transporte de glucosa a las células de mamíferos3....
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Protocolo
Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Centro Médico de la Universidad de Vanderbilt.
1. Preparación para el ensayo
NOTA: La preparación debe llevarse a cabo el día del ensayo, inmediatamente antes de realizar el ensayo. Esto es necesario debido a la naturaleza sensible al tiempo del protocolo.
- Preparación general antes del experimento
NOTA: El 6-NBDG es sensible a la luz y debe protegerse de la luz. Cubra todas las soluciones de 6-NBDG con papel de aluminio.
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Resultados
La Figura 4 muestra mediciones representativas de fluorescencia de glucosa de retina de ratón WT incubada con 6-NBDG durante diferentes períodos de tiempo. Después de 30 min de incubación, los niveles de 6-NBDG fueron un promedio de 336 ± 27.91 UA, mientras que después de 60 min, los niveles de 6-NBDG aumentaron a un promedio de 616.3 ± 8.38 UA. Una incubación adicional de 30 min condujo a un nivel reducido de 6-NBDG (506,4 ± 5,3 UA). A los 60 min, la variabilidad en los resultados fue mínim.......
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Discusión
En resumen, el método descrito permite a los investigadores de ciencias básicas medir la absorción del análogo fluorescente de la glucosa, 6-NBDG, en la retina neural murina ex vivo . La glucosa es un metabolito esencial para la retina neural, su absorción apoya las altas tasas de glucólisis y respiración mitocondrial necesarias para producir energía en forma de trifosfato de adenosina (ATP)1. Dado que la glucosa es el sustrato energético preferido, mucha.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por fondos departamentales sin restricciones otorgados a Lauren K. Wareham.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| # 5 pinzas | Katena | K5-6550 | Utilizado para la disección de retina |
| Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Aguja de 26 G x 5/8" | sol-M | 112658 | Se utiliza para perforar la córnea durante la disección |
| Tubos de 5 mL | MTC bio | c2540 | |
| Tubos de 50 mL | Avantor de VWR | 89039-656 | |
| 6-NBDG | Invitrogen | N23106 | Análogo de gucosa fluorescente |
| Placas de 96 pocillos negras con fondo transparente | Thermo Fisher Scientific | 265301 | |
| Anestésico Filtro de carbón Cannister | ReFresh | EZ-258 | Utilizado en anestesia |
| BAY-876 | Millipore Sigma | SML1774 | Para la inhibición de GLUT1. |
| Centrífuga a 4 & grados; C | Eppendorf | EPP-5424 | |
| Gas comprimido (5% dióxido de carbono, 95% oxígeno) | Airgas | UN3156 | Utilizado en la configuración de anestesia |
| pinzas curvas | Roboz instrumento quirúrgico | RS-5137 | Se utiliza para la disección |
| de retina DDH2O | Elga LabWater | Elga PureLab Ultra | Se utiliza después del etanol para limpiar el sonicador entre muestras |
| Microscopio de disección | Olympus | szX12 | Se utiliza para la disección de retina |
| Etanol 200 proof | Decon laboratories | 2701 | Se utiliza para limpiar el sonicador entre muestras |
| Bastidor de tubos flotantes de espuma | Thermo Fisher Scientific | 36-099-2328 | Para tubos durante la incubación en pasos de baño de agua |
| Tijeras generales | Instrumento quirúrgico Roboz | RS-680 | Utilizado para retina disección |
| Isoflurano 250 mL frasco | Piramal cuidados intensivos | NDC 6679401725 | Anestesia |
| Equipo de isoflurano | Vetequip vendido por VWR | 89012-492 | Se utiliza para anestesiar antes de la eutanasia |
| Toallitas Kim | VWR | 82003-820 | |
| Lector de microplacas Molecular | devices SpectraMax | M2 Lector de microplacas | Se utiliza para leer muestras |
| Neurobasal- A media | Gibco | 12349-015 | |
| Cono nasal (bajo máscara de anestesia de perfil) | Kent Scientific | SOMNO-0801 | Se utiliza para administrar anestesia |
| Objetivo en el microscopio de disección | Olympus | DF plapo 1x pf | Se utiliza para la disección de retina |
| Placa de Petri | VWR | 25384-088 | Se utiliza durante la disección de retina |
| Reactivo de ensayo Pierce Thermo | Fisher Scientific | 1861426 | |
| Puntas de pipeta P20 | Olympus Plásticos | 26-404 | |
| pipeta P200, P1000, P10 XL | VWR | 76322-150, 76322-154, 76322-132 | |
| Pipetas Pipeman P200, P1000, P20, P10 | VWR | F144055M, F144056M, F144058M, F144059M | |
| Software SoftMax Pro en el ordenador | Dispositivos moleculares | Software SoftMax Pro 7 | Software utilizado para leer muestras |
| Desmembrador sónico | Thermo Fisher Scientific FB50110 | Muestra de sonicato (retina) | |
| Pipetas de transferencia | Fisherbrand | 13-711-9AM | Se utiliza para transferir retina de un tubo a otro |
| Tijeras de resorte Vannas | Katena | K4-5000 | Se utiliza para la disección de retina |
| Baño de agua ajustado a 37 ° C | N/A | N/A | Se utiliza para la incubación |
Referencias
- Casson, R. J., Chidlow, G., Crowston, J. G., Williams, P. A., Wood, J. P. M. Retinal energy metabolism in health and glaucoma. Prog Retin Eye Res. 81, 100881(2021).
- Daniele, L. L., et al. Glucose uptake by GLUT1 in photoreceptors is essential for o....
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Reimpresiones y permisos
