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Artículo de método

Obtención de imágenes de superresolución del biofilm de Proteus mirabilis mediante microscopía de expansión

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DOI:

10.3791/67932

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18 de julio de 2025

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1Laboratory for Scientific Image Analysis SCIAN-Lab, Integrative Biology Program, Centro de Informática Médica y Telemedicina CIMT, Institute of Biomedical Sciences ICBM, Faculty of Medicine, University of Chile, 2Biomedical Neuroscience Institute BNI, 3Advanced Center for Chronic Diseases ACCDiS, 4Laboratorio de Biofilms Microbianos, Departamento de Microbiología, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable, 5Red de Equipamiento Científico Avanzado REDECA, Institute of Biomedical Sciences ICBM, Faculty of Medicine, University of Chile, 6National Center for Health Information Systems CENS, 7Centro de Modelamiento Matemático, Universidad de Chile

En este artículo

Resumen

Este artículo presenta un protocolo completo para PmbExM, una técnica de microscopía de expansión diseñada específicamente para biopelículas de Proteus mirabilis . PmbExM utiliza un tratamiento enzimático escalonado de muestras de biopelícula para lograr una expansión isotrópica de 4,3 veces, lo que permite el análisis de superresolución de la organización espacial de las estructuras celulares y subcelulares dentro de estas comunidades microbianas sésiles.

Resumen

El acceso a información visual detallada y datos cuantitativos de muestras microbiológicas mediante microscopía óptica convencional está limitado por la barrera de difracción. Una solución para mejorar la resolución es la microscopía de expansión (ExM), una técnica de superresolución innovadora y rentable que amplía físicamente las muestras aproximadamente cuatro veces su tamaño original. Para una expansión exitosa, es esencial homogeneizar las propiedades mecánicas del material biológico. Los biofilms son comunidades bacterianas, adheridas a una superficie e incrustadas en una matriz extracelular que producen; requieren que los protocolos ExM se adapten para acomodar sus componentes estructurales únicos. En este artículo se presenta el biofilm ExM (PmbExM) de Proteus mirabilis , una variante especializada del ExM que permite la visualización en superresolución de biofilms de P. mirabilis cultivados durante 48 h. El protocolo se centra en la degradación selectiva de los componentes estructurales clave de las muestras a través de digestiones enzimáticas en serie, optimizadas cerca de sus condiciones teóricas. PmbExM utiliza una combinación de enzimas, que incluyen α-amilasa, celulasa y glucósidos licucasa-hidrolasas para la hidrólisis de polisacáridos; mutanolisina para la hidrólisis de peptidoglicano; y proteinasa K para la hidrólisis de proteínas. Estos procedimientos de digestión son independientes del proceso de gelificación, lo que permite modificaciones para cumplir con requisitos específicos de homogeneización en diferentes modelos de biopelícula. Esta adaptabilidad ofrece un gran potencial para su aplicación en diversas especies bacterianas y condiciones de crecimiento. ExM se ha aplicado a diferentes especies de biopelículas con factores de expansión subóptimos en general. Por el contrario, PmbExM alcanza el factor de expansión máximo teórico del hidrogel ExM de acrilamida-acrilato estándar, sin distorsión significativa de la morfología o la topología. El objetivo de este trabajo es proporcionar un protocolo de superresolución accesible para visualizar la arquitectura, el ensamblaje y las características celulares e intracelulares de las biopelículas de P. mirabilis .

Introducción

La microscopía de fluorescencia es una herramienta ampliamente utilizada para estudiar la arquitectura, la composición y la función de las biopelículas1. Sin embargo, la capacidad de la microscopía óptica para resolver las características estructurales, celulares y subcelulares de las biopelículas está limitada por la barrera de difracción. La microscopía de expansión (ExM) es una técnica de superresolución innovadora, accesible y fácil de usar que tiene un gran potencial para revelar la estructura de la biopelícula más allá del límite de difracción 2,3. ExM mejora la resolución mediante la expansión isotrópica de muestras biológicas aproximadamente cuatro veces su tamaño original. El método implica la polimerización in situ de un hidrogel iónico hinchable en toda la muestra y la preservación de la disposición espacial relativa de los objetivos moleculares cuando se aplica con cuidado 4,5.

Para que ExM funcione correctamente, la homogeneización de las propiedades mecánicas del material biológico es un paso crucial6. Las variantes estándar de ExM se desarrollaron en cultivos de células y tejidos de mamíferos, donde lograron eficientemente la homogeneización solo a través de la digestión proteolítica de proteinasa K 4,5 o la desnaturalización de proteínas blandas con detergentes y autoclave7, produciendo una expansión isotrópica de 4 veces. Sin embargo, en el caso de las bacterias y las biopelículas bacterianas, la pared celular del peptidoglicano y los elementos de la matriz de EPS, como los polisacáridos estructurales, son obstáculos para la expansión 2,3,8,9.

Este artículo describe los procedimientos de la microscopía de expansión de biopelículas de Proteus mirabilis (PmbExM), una variante ExM personalizada diseñada para expandir biopelículas de P. mirabilis, un bacilo gramnegativo clínicamente relevante asociado con alta resistencia a antibióticos e infecciones del tracto urinario asociadas a catéteres10. PmbExM utiliza una combinación de tratamientos enzimáticos de mutanolisina, α-amilasa, celulasa, licitusa y proteinasa K para hidrolizar la pared celular del peptidoglicano, los polisacáridos y las proteínas, respectivamente. Los resultados demuestran que este método logra una expansión isotrópica de 4,3 veces de biopelículas de P. mirabilis de 48 horas de edad. La técnica permite la visualización en superresolución de la arquitectura, el ensamblaje y las características intracelulares de la biopelícula de P. mirabilis a través de la doble tinción3. Además, el PmbExM puede adaptarse a otros modelos de biopelícula ajustando los tratamientos enzimáticos para dirigirse a los componentes del biofilm específicos de cada especie.

El objetivo de este artículo es proporcionar una descripción detallada de los procedimientos involucrados en la gelificación, digestión, expansión y montaje de muestras de biopelícula para PmbExM. Además, este trabajo describe las condiciones de crecimiento bacteriano, los formatos de muestra y las técnicas de tinción fluorescente utilizadas por los autores, junto con una rutina de procesamiento y análisis de datos que puede ser fácilmente aplicada por investigadores con experiencia limitada en el procesamiento de imágenes. Para obtener una guía más completa y detallada sobre el procesamiento y análisis de imágenes, consulte Castagnini, D. et al.3.

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Protocolo

El proceso general de PmbExM se resume en la Figura 1. Consulte el Archivo Suplementario 1 para encontrar la composición de todas las soluciones nombradas (es decir, solución de monómero, solución de digestión de proteinasa K, etc.) utilizadas en este trabajo. Del mismo modo, consulte el Archivo Suplementario 2, el Archivo Suplementario 3 y el Archivo Suplementario 4 para obtener una rutina simplificada de procesamiento y análisis de datos que puede ser utilizada por investigadores sin vasta experiencia en el procesamiento de imágenes. El protocolo se puede realizar cómodamente durante un período de 2,5-3 semanas: la primera semana dedicada a la limpieza y esterilización de cubreobjetos, el crecimiento de biopelículas y la fijación de muestras; la segunda semana para la tinción de muestras y el propio protocolo PmbExM, y la tercera para el montaje de muestras y la adquisición de imágenes. Además, considere 1 semana de preparativos previos para los materiales y soluciones requeridos. Los detalles sobre los reactivos, materiales, equipos y software empleados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

figure-protocol-1
Figura 1: Anclaje, polimerización, digestión y diálisis del protocolo PmbExM para una expansión, observación y análisis exitosos de la biopelícula de P. mirabilis . La columna de la izquierda identifica seis estados de la muestra en los pasos seleccionados durante el protocolo de expansión. Comienza desde la muestra de biofilm fija, permeabilizada y teñida, siguiendo cuatro estados intermedios hasta el estado final gelificado y expandido, listo para la microscopía y el análisis de imágenes en superresolución. La matriz EPS de la biopelícula se muestra en verde, la pared celular bacteriana se representa mediante líneas púrpuras, la estructura general de la célula proteica se muestra en gris y el polímero ExM de acrilamida-acrilato se muestra como líneas azules onduladas. Todas las enzimas involucradas en el proceso están representadas por símbolos de Pac-Man: 3 glucósidos-hidrolasas (verde) para la hidrólisis de exopolisacáridos: α-amilasa, celulasa y licicasa; mutanolisina (púrpura) para la degradación de la pared celular del peptidoglicano; y proteinasa K (gris) para la digestión general de proteínas. Los colores de los símbolos de Pac-Man coinciden con las respectivas estructuras objetivo. Todos los objetos mostrados con baja opacidad o bordes discontinuos representan un estado de degradación enzimática. Esta figura es una modificación de Castagnini, D. et al.3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Limpieza y esterilización de cubreobjetos de vidrio para la formación de biopelículas

  1. Ultrasonidos cubreobjetos de vidrio de 12 mm en hidróxido de sodio 1 M durante 20 min a temperatura ambiente y luego enjuague con abundante agua desionizada.
  2. Ultrasónicamente los cubreobjetos en etanol al 70% (v/v) durante 15 min a temperatura ambiente y luego enjuague con etanol al 95% (v/v).
  3. Deje que los cubreobjetos se sequen al aire a temperatura ambiente.
  4. Esterilizar en autoclave.

2. Crecimiento de la biopelícula de Proteus mirabilis

  1. Cultivar P. mirabilis en 10 mL de caldo Luria Bertani (LB) durante 24 h a 37 °C sin agitar.
    NOTA: En este estudio se adquirió y empleó una cepa tipo de P. mirabilis disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales), pero se recomienda el uso de cualquier cepa de P. mirabilis que esté fácilmente disponible.
  2. Tome 1 mL del cultivo y agréguelo a 9 mL de caldo LB fresco y estéril para generar una suspensión bacteriana de dilución 1:10.
  3. Compruebe que la densidad óptica (OD) a 600 nm de la suspensión bacteriana 1:10 sea de 0,1. Ajustar, si es necesario, añadiendo pequeños volúmenes de cultivo fresco de LB o P. mirabilis hasta que alcance el diámetro exterior de600 = 0,1.
  4. Introducir cubreobjetos de vidrio de 12 mm (previamente limpiados y esterilizados) en una placa estéril de poliestireno de 24 pocillos (un cubreobjetos por pocillo).
    NOTA: Asegúrese de que toda la superficie del cubreobjetos toque el fondo del pozo. La biopelícula se formará en el lado del cubreobjetos, que está hacia arriba.
  5. Siembre los pocillos de la placa con 350 μL de la suspensión bacteriana OD600 = 0,1.
    NOTA: Se recomienda sembrar solo los pocillos internos de la placa, mientras se llenan los pocillos exteriores (es decir, los pocillos en las filas A y D y en las columnas 1 y 6) con agua estéril o caldo LB. Esto se debe a que los pozos exteriores son propensos a tasas de evaporación de líquido más altas que los pozos internos, lo que afecta el crecimiento de la biopelícula.
  6. Coloque la placa sembrada dentro de una incubadora y colóquela con 45 grados de inclinación.
    NOTA: Utilice material de laboratorio común, como tubos de centrífuga de 50 ml o cajas de puntas de micropipeta. La posición inclinada permitirá la formación de una interfaz aire-líquido en la superficie de los cubreobjetos en la que la biopelícula de P. mirabilis establecerá su región más gruesa.
  7. Deje que se formen biopelículas durante 48 h a 37 °C, sin agitar.
    NOTA: Esta configuración de crecimiento de biopelícula no es adecuada para tiempos de incubación superiores a 48 h debido a la desecación de la biopelícula debido a la evaporación del medio.

3. Fijación y almacenamiento de muestras de biofilm

  1. Retire con cuidado el medio de cultivo de los pocillos y lave suavemente los cubreobjetos que contienen biopelícula dos veces con 300 μL de solución salina tampón de fosfato estéril (PBS) durante 5 min a temperatura ambiente con una agitación muy suave.
    NOTA: Evite la destrucción de las biopelículas con el intercambio repetitivo de fluidos mediante el uso de pequeños volúmenes para incubaciones o lavados. 300-400 μL de líquido son suficientes para sumergir las biopelículas en una placa de 24 pocillos. Se recomienda encarecidamente un pipeteo lento y metódico, así como evitar golpear las biopelículas directamente con las soluciones intercambiadas.
  2. Retire con cuidado el PBS y reemplácelo con 400 μL de paraformaldehído (PFA) al 4% (p/v) en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente para la fijación de la biopelícula.
  3. Retire el PFA y reemplácelo con 300 μL de PBST al 1% (Triton X-100 v/v al 1% en PBS) para la permeabilización celular. Incubar durante 20 min a temperatura ambiente.
  4. Reemplace la solución de PBST al 1% con 300 μL de PBST al 0,3% (3% v/v Triton X-100 en PBS). Incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
  5. Retire el 0,3 % de PBST y sustitúyalo por 300 μL de una mezcla 50:50 de metanol y 0,3 % de PBST para la deshidratación de la muestra. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente y luego reemplazar la mezcla con 1 mL de metanol absoluto.
    NOTA: Agregue 1 mL de metanol lentamente, dirigiéndolo contra las paredes del pozo. Este mayor volumen de metanol se utiliza para evitar su evaporación completa durante el almacenamiento de la muestra.
  6. Almacene las muestras a -20 °C durante al menos 1 día y hasta un mes.
    NOTA: Se recomienda sellar las placas con una película de cera flexible para retrasar la evaporación del metanol y la desecación de las muestras.
  7. Tras su uso, rehidrate secuencialmente las muestras sustituyendo el metanol por 300 μL de una mezcla 50:50 de metanol y 0,3% PBST, y luego por 300 μL 0,3% PBST, a temperatura ambiente.

4. Tinción fluorescente de biofilm

  1. Incubar las muestras de biofilm rehidratado con 300 μL de 50 μg/mL de conjugado de lectina fluorescente de aglutinina de germen de trigo (en lo sucesivo denominado simplemente conjugado WGA; ver Tabla de Materiales) en PBS durante 20 min a temperatura ambiente para la tinción de pared celular/cápsula/exopolisacáridos.
    NOTA: Consulte los temas relevantes relacionados con la tinción fluorescente en la sección de discusión. A partir de ahora, proteja las muestras de la luz.
  2. Retire la solución conjugada de WGA y lave suavemente dos veces con 300 μL de PBS durante 10 min a temperatura ambiente.

5. Pasos de PmbExM

  1. Anclaje MA-NHS y polimerización acrilamida-acrilato
    1. Incubar las muestras de biopelícula teñidas con 400 μL de éster N-hidroxisuccinimidil de ácido metacrílico (MA-NHS) de ácido metacrílico (MA-NHS) en PBS durante 1 h a temperatura ambiente con agitación suave.
      NOTA: MA-NHS es un éster activado que es propenso a la hidrólisis en un medio acuoso, por lo tanto, trate las muestras inmediatamente después de preparar 1 mM en solución de PBS.
    2. Realizar tres lavados suaves de 10 min con 300 μL de PBS a temperatura ambiente.
    3. Retire el PBS y reemplácelo con 300 μL de solución de monómero. Incubar durante la noche (O.N.) a 4 °C.
    4. Construir las precámaras de gelificación. Utilice un portaobjetos de vidrio como base y coloque sobre él dos trozos de cinta adhesiva de doble cara doblada para que actúen como espaciadores de 400 μm. Coloque los espaciadores a 8-10 mm entre sí.
      NOTA: Consulte la Figura 2A para obtener más claridad sobre cómo construir la precámara de gelificación. La cinta de doble cara utilizada aquí tenía aproximadamente 100 μm de grosor, por lo que se recortó y se dobló sobre sí misma para crear espaciadores de 3 mm x 5 mm x 0,4 mm. Mida el grosor de la cinta adhesiva de doble cara disponible y colóquela en consecuencia. La absorción de la solución gelificante por los espaciadores de cinta es insignificante. Como alternativa a la cinta adhesiva de doble cara, los cubreobjetos de vidrio redondos de 12 mm se pueden adherir con gotas de agua y apilar hasta la altura requerida.
    5. Organice cámaras húmedas para proteger las muestras durante la polimerización de la desecación.
      NOTA: Una caja común de puntas de micropipeta se puede convertir fácilmente en una cámara húmeda quitando el andamio de plástico de las puntas y reemplazándolo con toallas de papel húmedas.
    6. Prepare un volumen de stock fresco de solución gelificante mezclando minuciosamente los volúmenes de solución de monómero, 10 % (p/v) de N, N, N', N'-tetrametiletilendiamina (TEMED), 0,5 % (p/v) de 4-hidroxi-TEMPO (4-HT) y persulfato de amonio (APS) al 10 % (p/v) en una proporción de 47:1:1:1, respectivamente. Mezcle el APS con el resto de los reactivos de la solución gelificante solo cuando se hayan realizado los pasos hasta 5.1.5.
      NOTA: El volumen total de solución gelificante madre a preparar dependerá de la cantidad de muestras de biopelícula que se estén procesando. Por ejemplo, para procesar tres muestras de biopelícula, prepare 900 μL de solución gelificante mezclando 846 μL de solución de monómero con 18 μL de TEMED al 10 % (p/p), 18 μL de 4-HT al 0,5 % (p/p) y 18 μL de APS al 10 % (p/p). Para evitar la polimerización prematura, el APS debe agregarse al final de la mezcla y solo cuando las muestras, las precámaras de gelificación y las cámaras húmedas estén listas para ser utilizadas. Mantenga todos los reactivos mencionados y la solución gelificante recién preparada enfriada durante este paso.
    7. Inmediatamente después de preparar la solución gelificante, retire suavemente la solución de monómero y reemplácela con 300 μL del primero. Incubar a 4 °C durante 5 min.
    8. Mientras se realiza el paso 5.1.7, retire la cubierta protectora restante de las tiras de cinta adhesiva de doble cara dispuestas en los portaobjetos de vidrio y, en el espacio entre ellas, coloque 40 μL de solución gelificante.
    9. Una vez finalizado el paso 5.1.7, retire cada cubreobjetos que contenga biopelícula de su pocillo y colóquelo encima de la gota de 40 μL de solución gelificante previamente colocada sobre un portaobjetos de vidrio. Oriente el cubreobjetos de modo que la biopelícula de su superficie entre en contacto con la solución gelificante.
    10. Termine la construcción de la cámara de gelificación presionando suavemente el cubreobjetos que contiene biopelícula con pinzas para asegurar su adherencia a los espaciadores de cinta de doble cara.
      NOTA: Esta configuración en forma de sándwich consiste en lo que se llama la cámara de gelificación (Figura 2B).
    11. Deje que las muestras polimericen dentro de una cámara húmeda e incube durante 2 h a 37 °C sin agitación.
    12. Visualice las muestras bajo microscopía de fluorescencia (consulte el paso 6.2.1) sin desmontar las cámaras de gelificación para la captura de imágenes previas a la expansión.
      NOTA: No deje las muestras gelificadas fuera de la cámara húmeda durante más de una hora, ya que los geles preexpandidos son propensos a la desecación, lo que hace que la muestra quede inutilizable. Consulte el paso SF2.3 (Archivo complementario 2) para conocer los procedimientos de adquisición previos a la expansión relevantes.
    13. Desmonte las cámaras de gelificación y recorte el exceso de gel alrededor de la región de interés en la muestra de biopelícula con una cuchilla quirúrgica.
      NOTA: Se recomienda encarecidamente recortar los geles para facilitar la manipulación y el montaje de las muestras expandidas. Además, para realizar un seguimiento de la orientación espacial de la región de interés dentro de las muestras, recorte los geles en una forma asimétrica o deje un recorte característico en el gel para reconocer fácilmente la orientación correcta.
    14. Coloque los cubreobjetos que contienen los geles recortados dentro de una nueva placa de 24 pocillos, con el gel hacia arriba.
      NOTA: En esta etapa, las muestras gelificadas deben permanecer adheridas a su cubreobjetos de vidrio originales.
  2. Digestión enzimática I-III y tinción de ADN
    NOTA: La homogeneización de las propiedades mecánicas de las muestras de biofilm de P. mirabilis sigue una serie de digestiones enzimáticas que los autores han categorizado en 3 pasos, en función de la estructura biológica que se pretende degradar: hidrólisis de polisacáridos (Digestión I), hidrólisis de peptidoglicano (Digestión II) e hidrólisis de proteínas (Digestión III).
    1. Digestión I
      1. Sumerja las muestras en 1 ml de solución de digestión de α-amilasa. Incubar el O.N. a 50 °C.
        NOTA: Se utilizan grandes volúmenes (es decir, 0,5-1 mL) de solución enzimática para evitar la desecación de la muestra debido a la alta temperatura de incubación.
      2. Retire la solución de α-amilasa y lave los geles durante 5 minutos a temperatura ambiente con 300 μL de tampón de digestión de celulasa.
      3. Retire el tampón de digestión de celulasa y reemplácelo con 500 μL de solución de digestión de celulasa. Incubar durante 2 h a 45 °C.
      4. Retirar la solución de digestión de la celulasa y lavar los geles durante 5 min a temperatura ambiente con 300 μL de tampón de digestión de la lyticasa.
      5. Retire el tampón de digestión de liticasa y reemplácelo con 500 μL de solución de digestión de liticasa. Incubar durante 2 h a 30 °C.
    2. Digestión II
      1. Retirar la solución de digestión de liticasa y lavar los geles durante 5 min a temperatura ambiente con 300 μL de tampón de digestión de mutanolisina.
      2. Retire el tampón de digestión de mutanolisina y reemplácelo con 1 ml de solución de digestión de mutanolisina. Incubar el O.N. a 55 °C.
    3. Digestión III
      1. Retirar la solución de digestión de mutanolisina y lavar los geles durante 5 min a temperatura ambiente con 300 μL de tampón de digestión de proteinasa K. Retire el tampón de digestión de proteinasa K y reemplácelo con 500 μL de solución de digestión de proteinasa K. Incubar durante 2 h a 37 °C.
    4. (OPCIONAL) Tinción de ADN
      1. Retirar la solución de proteinasa K y lavar los geles con 300 μL de 10x PBS durante 5 min a temperatura ambiente.
      2. Retire el PBS 10x y reemplácelo con 300 μL de tinción de ácido nucleico fluorescente rojo de 5 μM en PBS 10x durante 30 minutos a temperatura ambiente.
        NOTA: Consulte la sección de Discusión para obtener comentarios sobre la tinción de ADN para los procedimientos ExM.
  3. Expansión
    1. Extraer la solución de proteinasa K (o la solución de tinción de ADN si se ha realizado el paso opcional 5.2.4) y transferir los geles a una placa de Petri de 60 mm. Coloque un gel por placa de Petri.
      NOTA: Use un pincel plano pequeño para empujar el gel sobre su cubreobjetos de vidrio. Con pinzas de laboratorio, agarra el cubreobjetos de vidrio y úsalo como plataforma para el gel. Evite que el gel se caiga del cubreobjetos con la ayuda del cepillo al levantarlo del pocillo de la placa. Evite que los geles se plieguen sobre sí mismos.
    2. Llene la placa de Petri con el exceso de agua desionizada, sumerja completamente el gel e incube bajo agitación suave a temperatura ambiente durante 20 minutos. Cambia el agua 4-5 veces.
      NOTA: Tenga en cuenta que el gel expansivo se vuelve prácticamente invisible cuando se sumerge en agua. Coloque la placa de Petri a contraluz para facilitar la localización del gel y evitar dañarlo con la succión de la pipeta o micropipeta Pasteur durante los intercambios de agua.

figure-protocol-2
Figura 2: Cámara de gelificación y montaje de la muestra. (A) Cámara de pregelificación. En una corredera, coloque 2 espaciadores de cinta adhesiva de doble cara (amarillo). Un cubreobjetos de vidrio (figure-protocol-3 = 12 mm) se asienta encima como referencia de distancia. (B) Cámara de gelificación. La biopelícula bacteriana (verde) se forma en la superficie inferior del cubreobjetos. Los espaciadores de 400 μm de grosor (naranja) están hechos de recortes de cinta adhesiva de doble cara de 100 μm de grosor. Los espaciadores permiten que el gel incruste toda la muestra y evitan el desbordamiento de la solución gelificante desde los bordes de la cámara, evitando que la muestra se aplaste entre el portaobjetos y el cubreobjetos. (C) Cámaras de imagen impresas en 3D (visite el siguiente enlace para acceder a los archivos .stl https://github.com/scianlab/ExM). Una muestra de gel expandido (izquierda) y una muestra de gel expandido sumergida en agua desionizada (derecha). Los geles expandidos se vuelven prácticamente invisibles cuando se sumergen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

6. Observación y análisis

  1. Montaje de muestras expandidas
    1. Prepare las cámaras de imagen con recubrimiento de polilisina para la inmovilización de la muestra durante la obtención de imágenes11: Remoje la superficie de vidrio de la cámara de imagen (consulte la tabla de materiales) con poli-L-lisina al 0,1% (p/v) durante 20 minutos a temperatura ambiente.
    2. Retirar la solución de poli-L-lisina y realizar dos lavados con exceso de agua desionizada. Deje secar al aire durante 1 h o colóquelo dentro de una incubadora a 37 °C para acelerar el proceso de secado.
    3. Después del quinto ciclo de diálisis del paso 5.3.2, retire el agua que cubre los geles y use un cepillo plano pequeño para empujar la muestra sobre un cubreobjetos de vidrio de 24 mm x 50 mm. Utilice el cubreobjetos rectangular como plataforma para el gel y levántelo de la placa de Petri.
    4. Elimine el exceso de agua del gel con papel de seda para evitar que el agua bloquee el contacto directo entre la superficie del gel y el recubrimiento de polilisina en la superficie de vidrio de la cámara de imagen.
    5. Coloque con cuidado el gel sobre la superficie de vidrio de la cámara de imagen, evitando la retención de burbujas de aire entre el gel y el vidrio.
      NOTA: La superficie de vidrio de la cámara de imágenes debe estar completamente seca. Si se tomaron imágenes previas a la expansión, considere una orientación correcta del gel expandido para facilitar la búsqueda de los campos de visión capturados previamente en la muestra preexpandida.
    6. Agregue agua desionizada hasta que el gel esté completamente sumergido (consulte la Figura 2C).
      NOTA: Los geles expandidos deben permanecer hidratados durante todo el proceso de obtención de imágenes para evitar la contracción durante la captura.
  2. Adquisición de imágenes
    1. Visualice y capture imágenes de las muestras en un microscopio fluorescente de difracción limitada disponible.
      NOTA: Los autores utilizaron un microscopio confocal de disco giratorio, con un objetivo de inmersión en agua de 63x de 1,2 de apertura numérica (NA). Para la excitación de fluoróforos, se utilizó una línea láser de estado sólido a 488 y 647 nm. Las capturas se realizaron con una cámara digital CMOS de 16 bits controlada por software propietario (ver Tabla de Materiales). El tamaño del vóxel se estableció en 64,4 mm x 64,4 mm x 200 nm (ejes XYZ ).
  3. Tratamiento de imágenes
    1. Consulte el Archivo Suplementario 2 para encontrar una rutina de procesamiento de imágenes digitales para la segmentación de bacterias (sección SF2.1), la medición del ancho de celda (sección SF2.2), la determinación de EF (sección SF2.3) y la coincidencia de imágenes para condiciones preexpandidas y expandidas (sección SF2.4).

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Resultados

PmbExM amplió el biofilm de P. mirabilis 4,3 veces y conservó la morfología y topología
La Figura 3A-D evidencia la magnificación física de las células de biofilm de P. mirabilis y el aumento de la resolución provocado por la técnica. Además, esto no solo se observó en regiones delgadas de biopelícula donde las células se organizan en un diseño similar a una sola capa, sino también en ...

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Discusión

Pasos críticos de PmbExM
Al igual que con cualquier variante ExM, uno de los pasos más críticos del protocolo es la homogeneización de las propiedades mecánicas de la muestra. En el caso del PmbExM, esto se consigue a través de una serie de tratamientos enzimáticos. Una digestión insuficiente puede dar lugar a FE bajas y a daños potenciales en la morfología y/o topología de la biopelícula, lo que da lugar a una resolución subóptima y a resultados poco fiables. Por el ...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses financieros o personales relacionados con este trabajo.

Agradecimientos

Los autores expresan su agradecimiento al Dr. Juan Eduardo Rodríguez y al Prof. Dr. Ulrich Kubitschek (U-Bonn) por su contribución a la implementación de las técnicas de expansión en SCIAN-Lab. Este trabajo fue financiado por los proyectos ANID ICM P09-015-F (SH, DC, KP, JJW), FONDECYT 1211988 (SH, DC, KP), FONDECYT 3220832 (JJW), FONDEQUIP EQM210020 (DC, KP, JJW, JT, NCH, PS, SH); Núcleo SELFO NCN2024_068 (SH, KP, JJW), CORFO 16CTTS- 66.390, MINEDUC grant RED 21994 (SH), BASAL FB210005 (SH), DAAD 57519605 (SH, NC), Centro CTI230006 (SH), FONDEF ID 23I10337 (SH), y Proyecto Regional Binacional Cooperación SUR-SUR AUCI / AGCID BIL-URY-2019-661 (SH, NCH, PS, MJG).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
&alfa;-Amilasa de Bacillus sp.Sigma-Aldrich 10070Digestión de polisacáridos
0,1% (p/v) solución de agua de poli-L-lisina Sigma-AldrichP8920Inmovilización de muestras para imágenes
Cubreobjetos de vidrio de 12 mmChemglass Life SciencesCLS-1760 Componente decámara de gelificación
Cámara C13440-20CU de 16 bitsHamamatsu PhotonicsNo disponibleCámara digital CMOS para adquisición de imágenes
Cubreobjetos de vidrio de 24 mm x 50 mmChemglass Life SciencesCLS-1764Manipulación/manipulación de muestras
Cámara de imágenes impresa en 3DDiseñointerno-Opcióncámara de imágenes
4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-oxilo (4-hidroxi-TEMPO)Componente de solución gelificanteSigma-Aldrich176141
Placa inferior de vidrio de 6 pocillos con paredes negrasCelVisP06-1.5H-N Opción de cámara deimágenes
Ácido acético Componente tampón enzimáticoSigma-Aldrich818755
AcrilamidaSigma-AldrichA4058Componente de solución de monómero
Persulfato de amonioSigma-AldrichA3678Componente de solución gelificante
Microscopio Axiovert 200ZeissNo disponibleMicroscopio confocal
Cloruro de calcioSigma-AldrichC8106Componente tampón enzimático
C-Apochromat 63x 1,2 NA Objetivo de inmersión en aguaZeissNo disponibleObjetivo de microscopio
Celulasa de Aspergillus nigerSigma-Aldrich 22178Digestión de polisacáridos
Chamlide CMB Cámara de imágenes magnéticas de plato de 35 mmInstrumento de células vivasNo disponibleOpción
de cámara de imágenes Dimetilsulfóxido Sigma-Aldrich472301MA-NHS solución madre de reactivo de anclaje 
Fosfato disódicoSigma-AldrichS3264Componente tampón enzimático
EtanolSigma-AldrichE7023Limpieza y esterilización
Ácido etilendiaminotetraacéticoMerck324503Componente tampón enzimático
Poliestireno Falcon Placas de 24 pocillosCorning351147Plataforma de procedimientos generales
FIJI SoftwareInstitutos Nacionales deSalud-Softwarede procesamiento de imágenes
Glicerol Componentetampón enzimáticoSigma-AldrichG7893
Clorhidrato de guanidinaThermo Scientific24115Componente tampón enzimático
Software Huygens SoftwareScientific Volume Imaging-Deconvolutionpara la restauración de imágenes
Ácido clorhídricoSupelco1.00317Preparación de tampón
Papel tisú KimwipesFisher Scientiffic06-666Eliminación del exceso de agua
Pinzas de laboratorioMicroscopía electrónica CienciasM5EManipulación/manipulación general de muestras
Caldo Luria BertaniInvitrogen12795-027Medio de crecimiento de biofilm
Liticasa de Arthrobacter luteusSigma-Aldrich L4025Digestión de polisacáridos
Clorurode magnesio Sigma-AldrichD5652Componente tampón enzimático
Éster de ácido metacrílico N-hidroxisuccinimidiloSigma-Aldrich730300Reactivo de anclaje
MetanolSigma-Aldrich32213Deshidratación y almacenamiento de muestras
MicrobioJ --Software de procesamiento de imágenes plugin
Microscopía portaobjetos de vidrioChemglass Life SciencesCG-8221 Componente dela cámara de gelificación
Fosfato monosódicoSigma-AldrichS9638Componente de tampón enzimático
Mutanólisina de Streptomyces globisporusSigma-Aldrich M990Digestión de peptidoglicano
N, N, N', N'-tetrametiletilendiaminasolución gelificanteSigma-AldrichT7024
, N & prime;-metilenbisacrilamidaSigma-AldrichM1533Componente de solución de monómero
Nunc 40,4 mm placas de Petri con fondo de vidrioThermo Fisher12-567-400Opción de cámara
de imágenes ParaformaldehídoSigma-Aldrich158127Fijación de muestras
Solución salina de tampón de fosfatoSigma-Aldrich79383Componente de solución de monómero, lavado, tampón enzimático
Proteinasa K de Engyodontium albumInvitrogen25530-031Digestión de proteínas
Proteus mirabilis ATCC 12453Microbiológicos0440PSujeto de estudio
Pincel plano pequeñoFerreteríalocal-Manipulación/manipulación de muestras
Acetato de sodioSigma-Aldrich241245Componente tampón enzimático
Acrilato de sodioSigma-Aldrich408220Componente de solución monómera
Bicarbonato de sodioSigma-AldrichS5761Componente tampón enzimático
Clorurode sodioSigma-AldrichS9888Componente de solución de monómero, Componente de tampón enzimático
Hidróxido de sodioSigma-Aldrich221465Limpieza de portaobjetos de vidrio
Línea láser de estado sólidoOmicronNo disponible488, 568 y 647 nm Línea de láser de excitación
SYTO 61 tinción de ácido nucleicoInvitrogenS11343Colorante fluorescente
Tris(hidroximetil)aminometano clorhidratoSAFC108219Componente tampón enzimático
Triton X-100Sigma-AldrichX100Perpermeabilización de muestras, componente tampón enzimático
Software de captura Volocity 7.0.0QuorumTechnologies-Software controladorde adquisición Microscoy
Volocity ViewSistema de disco giratorioVox Perkin-ElmerNo disponibleSistema de disco giratorio para confocal microscopio
Aglutinina de germen de trigo – Alexa Fluor 488 conjugado de lectina fluorescenteInvitrogenW11261Colorante fluorescente
de Componente de N

Referencias

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