Este artículo presenta un protocolo completo para PmbExM, una técnica de microscopía de expansión diseñada específicamente para biopelículas de Proteus mirabilis . PmbExM utiliza un tratamiento enzimático escalonado de muestras de biopelícula para lograr una expansión isotrópica de 4,3 veces, lo que permite el análisis de superresolución de la organización espacial de las estructuras celulares y subcelulares dentro de estas comunidades microbianas sésiles.
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Artículo de método
Obtención de imágenes de superresolución del biofilm de Proteus mirabilis mediante microscopía de expansión
En este artículo
Resumen
Resumen
El acceso a información visual detallada y datos cuantitativos de muestras microbiológicas mediante microscopía óptica convencional está limitado por la barrera de difracción. Una solución para mejorar la resolución es la microscopía de expansión (ExM), una técnica de superresolución innovadora y rentable que amplía físicamente las muestras aproximadamente cuatro veces su tamaño original. Para una expansión exitosa, es esencial homogeneizar las propiedades mecánicas del material biológico. Los biofilms son comunidades bacterianas, adheridas a una superficie e incrustadas en una matriz extracelular que producen; requieren que los protocolos ExM se adapten para acomodar sus componentes estructurales únicos. En este artículo se presenta el biofilm ExM (PmbExM) de Proteus mirabilis , una variante especializada del ExM que permite la visualización en superresolución de biofilms de P. mirabilis cultivados durante 48 h. El protocolo se centra en la degradación selectiva de los componentes estructurales clave de las muestras a través de digestiones enzimáticas en serie, optimizadas cerca de sus condiciones teóricas. PmbExM utiliza una combinación de enzimas, que incluyen α-amilasa, celulasa y glucósidos licucasa-hidrolasas para la hidrólisis de polisacáridos; mutanolisina para la hidrólisis de peptidoglicano; y proteinasa K para la hidrólisis de proteínas. Estos procedimientos de digestión son independientes del proceso de gelificación, lo que permite modificaciones para cumplir con requisitos específicos de homogeneización en diferentes modelos de biopelícula. Esta adaptabilidad ofrece un gran potencial para su aplicación en diversas especies bacterianas y condiciones de crecimiento. ExM se ha aplicado a diferentes especies de biopelículas con factores de expansión subóptimos en general. Por el contrario, PmbExM alcanza el factor de expansión máximo teórico del hidrogel ExM de acrilamida-acrilato estándar, sin distorsión significativa de la morfología o la topología. El objetivo de este trabajo es proporcionar un protocolo de superresolución accesible para visualizar la arquitectura, el ensamblaje y las características celulares e intracelulares de las biopelículas de P. mirabilis .
Introducción
La microscopía de fluorescencia es una herramienta ampliamente utilizada para estudiar la arquitectura, la composición y la función de las biopelículas1. Sin embargo, la capacidad de la microscopía óptica para resolver las características estructurales, celulares y subcelulares de las biopelículas está limitada por la barrera de difracción. La microscopía de expansión (ExM) es una técnica de superresolución innovadora, accesible y fácil de usar que tiene un gran potencial para revelar la estructura de la biopelícula más allá del límite de difracción 2,3....
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Protocolo
El proceso general de PmbExM se resume en la Figura 1. Consulte el Archivo Suplementario 1 para encontrar la composición de todas las soluciones nombradas (es decir, solución de monómero, solución de digestión de proteinasa K, etc.) utilizadas en este trabajo. Del mismo modo, consulte el Archivo Suplementario 2, el Archivo Suplementario 3 y el Archivo Suplementario 4 para obtener una rutina simplificada de procesamiento y análisis de datos que puede ser utilizada por investigadores sin vasta experiencia en el procesamiento de imágenes. El protocolo se puede realizar cómodamente durante un....
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Resultados
PmbExM amplió el biofilm de P. mirabilis 4,3 veces y conservó la morfología y topología
La Figura 3A-D evidencia la magnificación física de las células de biofilm de P. mirabilis y el aumento de la resolución provocado por la técnica. Además, esto no solo se observó en regiones delgadas de biopelícula donde las células se organizan en un diseño similar a una sola capa, sino también en .......
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Discusión
Pasos críticos de PmbExM
Al igual que con cualquier variante ExM, uno de los pasos más críticos del protocolo es la homogeneización de las propiedades mecánicas de la muestra. En el caso del PmbExM, esto se consigue a través de una serie de tratamientos enzimáticos. Una digestión insuficiente puede dar lugar a FE bajas y a daños potenciales en la morfología y/o topología de la biopelícula, lo que da lugar a una resolución subóptima y a resultados poco fiables. Por el .......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener conflictos de intereses financieros o personales relacionados con este trabajo.
Agradecimientos
Los autores expresan su agradecimiento al Dr. Juan Eduardo Rodríguez y al Prof. Dr. Ulrich Kubitschek (U-Bonn) por su contribución a la implementación de las técnicas de expansión en SCIAN-Lab. Este trabajo fue financiado por los proyectos ANID ICM P09-015-F (SH, DC, KP, JJW), FONDECYT 1211988 (SH, DC, KP), FONDECYT 3220832 (JJW), FONDEQUIP EQM210020 (DC, KP, JJW, JT, NCH, PS, SH); Núcleo SELFO NCN2024_068 (SH, KP, JJW), CORFO 16CTTS- 66.390, MINEDUC grant RED 21994 (SH), BASAL FB210005 (SH), DAAD 57519605 (SH, NC), Centro CTI230006 (SH), FONDEF ID 23I10337 (SH), y Proyecto Regional Binacional Cooperación SUR-SUR AUCI / AGCID BIL-URY-....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| &alfa;-Amilasa de Bacillus sp. | Sigma-Aldrich | 10070 | Digestión de polisacáridos |
| 0,1% (p/v) solución de agua de poli-L-lisina | Sigma-Aldrich | P8920 | Inmovilización de muestras para imágenes |
| Cubreobjetos de vidrio de 12 mm | Chemglass Life Sciences | CLS-1760 Componente de | cámara de gelificación |
| Cámara C13440-20CU de 16 bits | Hamamatsu Photonics | No disponible | Cámara digital CMOS para adquisición de imágenes |
| Cubreobjetos de vidrio de 24 mm x 50 mm | Chemglass Life Sciences | CLS-1764 | Manipulación/manipulación de muestras |
| Cámara de imágenes impresa en 3D | Diseño | interno-Opción | cámara de imágenes |
| 4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-oxilo (4-hidroxi-TEMPO) | Componente de solución gelificante | Sigma-Aldrich | 176141 |
| Placa inferior de vidrio de 6 pocillos con paredes negras | CelVis | P06-1.5H-N Opción de cámara de | imágenes |
| Ácido acético | Componente tampón enzimático | Sigma-Aldrich | 818755 |
| Acrilamida | Sigma-Aldrich | A4058 | Componente de solución de monómero |
| Persulfato de amonio | Sigma-Aldrich | A3678 | Componente de solución gelificante |
| Microscopio Axiovert 200 | Zeiss | No disponible | Microscopio confocal |
| Cloruro de calcio | Sigma-Aldrich | C8106 | Componente tampón enzimático |
| C-Apochromat 63x 1,2 NA Objetivo de inmersión en agua | Zeiss | No disponible | Objetivo de microscopio |
| Celulasa de Aspergillus niger | Sigma-Aldrich | 22178 | Digestión de polisacáridos |
| Chamlide CMB Cámara de imágenes magnéticas de plato de 35 mm | Instrumento de células vivas | No disponible | Opción |
| de cámara de imágenes Dimetilsulfóxido Sigma-Aldrich | 472301 | MA-NHS solución madre de reactivo de anclaje | |
| Fosfato disódico | Sigma-Aldrich | S3264 | Componente tampón enzimático |
| Etanol | Sigma-Aldrich | E7023 | Limpieza y esterilización |
| Ácido etilendiaminotetraacético | Merck | 324503 | Componente tampón enzimático |
| Poliestireno Falcon Placas de 24 pocillos | Corning | 351147 | Plataforma de procedimientos generales |
| FIJI Software | Institutos Nacionales de | Salud-Software | de procesamiento de imágenes |
| Glicerol Componente | tampón enzimático | Sigma-Aldrich | G7893 |
| Clorhidrato de guanidina | Thermo Scientific | 24115 | Componente tampón enzimático |
| Software Huygens Software | Scientific Volume Imaging-Deconvolution | para la restauración de imágenes | |
| Ácido clorhídrico | Supelco | 1.00317 | Preparación de tampón |
| Papel tisú Kimwipes | Fisher Scientiffic | 06-666 | Eliminación del exceso de agua |
| Pinzas de laboratorio | Microscopía electrónica Ciencias | M5E | Manipulación/manipulación general de muestras |
| Caldo Luria Bertani | Invitrogen | 12795-027 | Medio de crecimiento de biofilm |
| Liticasa de Arthrobacter luteus | Sigma-Aldrich | L4025 | Digestión de polisacáridos |
| Cloruro | de magnesio Sigma-Aldrich | D5652 | Componente tampón enzimático |
| Éster de ácido metacrílico N-hidroxisuccinimidilo | Sigma-Aldrich | 730300 | Reactivo de anclaje |
| Metanol | Sigma-Aldrich | 32213 | Deshidratación y almacenamiento de muestras |
| MicrobioJ | - | - | Software de procesamiento de imágenes plugin |
| Microscopía portaobjetos de vidrio | Chemglass Life Sciences | CG-8221 Componente de | la cámara de gelificación |
| Fosfato monosódico | Sigma-Aldrich | S9638 | Componente de tampón enzimático |
| Mutanólisina de Streptomyces globisporus | Sigma-Aldrich | M990 | Digestión de peptidoglicano |
| N, N, N', N'-tetrametiletilendiamina | solución gelificante | Sigma-Aldrich | T7024 |
| , N & prime;-metilenbisacrilamida | Sigma-Aldrich | M1533 | Componente de solución de monómero |
| Nunc 40,4 mm placas de Petri con fondo de vidrio | Thermo Fisher | 12-567-400 | Opción de cámara |
| de imágenes Paraformaldehído | Sigma-Aldrich | 158127 | Fijación de muestras |
| Solución salina de tampón de fosfato | Sigma-Aldrich | 79383 | Componente de solución de monómero, lavado, tampón enzimático |
| Proteinasa K de Engyodontium album | Invitrogen | 25530-031 | Digestión de proteínas |
| Proteus mirabilis ATCC 12453 | Microbiológicos | 0440P | Sujeto de estudio |
| Pincel plano pequeño | Ferretería | local-Manipulación | /manipulación de muestras |
| Acetato de sodio | Sigma-Aldrich | 241245 | Componente tampón enzimático |
| Acrilato de sodio | Sigma-Aldrich | 408220 | Componente de solución monómera |
| Bicarbonato de sodio | Sigma-Aldrich | S5761 | Componente tampón enzimático |
| Cloruro | de sodioSigma-Aldrich | S9888 | Componente de solución de monómero, Componente de tampón enzimático |
| Hidróxido de sodio | Sigma-Aldrich | 221465 | Limpieza de portaobjetos de vidrio |
| Línea láser de estado sólido | Omicron | No disponible | 488, 568 y 647 nm Línea de láser de excitación |
| SYTO 61 tinción de ácido nucleico | Invitrogen | S11343 | Colorante fluorescente |
| Tris(hidroximetil)aminometano clorhidrato | SAFC | 108219 | Componente tampón enzimático |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Perpermeabilización de muestras, componente tampón enzimático |
| Software de captura Volocity 7.0.0 | Quorum | Technologies-Software controlador | de adquisición Microscoy |
| Volocity ViewSistema de disco giratorio | Vox Perkin-Elmer | No disponible | Sistema de disco giratorio para confocal microscopio |
| Aglutinina de germen de trigo – Alexa Fluor 488 conjugado de lectina fluorescente | Invitrogen | W11261 | Colorante fluorescente |
Referencias
- Franklin, M. J., Chang, C., Akiyama, T., Bothner, B. New technologies for studying biofilms. Microbiol Spectr. 3 (4), 10(2015).
- Valdivieso González, D., Jara, J., Almendro-Vedia, V. G., Orgaz, B., López-Montero, I. Expansion microscopy applied to mono- and dual-species biofilms. NPJ Biofilms....
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Reimpresiones y permisos
