Artículo de método

Aislamiento rápido de vesículas extracelulares derivadas de la leche materna humana

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DOI:

10.3791/67954

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14 de noviembre de 2025

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1Department of Pediatrics/Division of Neonatology and Center of Glial Biology in Medicine, University of Alabama at Birmingham School of Medicine, 2School of Health Professions/Department of Clinical and Diagnostic Sciences, University of Alabama at Birmingham, 3Department of Biological Sciences, Alabama State University, 4Department of Pediatric Surgery, Washington University-St. Louis

En este artículo

Resumen

Este protocolo está diseñado para acelerar y permitir el aislamiento efectivo de vesículas extracelulares de la leche materna humana con alta pureza.

Resumen

Las vesículas extracelulares (EV), partículas de tamaño nanométrico de aproximadamente 20-1000 nm de tamaño, están atrayendo rápidamente la atención por su potencial terapéutico. Específicamente, se ha demostrado que las vesículas extracelulares derivadas de la leche materna humana (HBMDEV) confieren protección en modelos experimentales de enterocolitis necrotizante, una enfermedad intestinal que afecta principalmente a los bebés prematuros, lo que resulta en una mortalidad de hasta el 50%. Sin embargo, las técnicas tradicionales de aislamiento de vesículas extracelulares, como la ultracentrifugación diferencial, la cromatografía de exclusión por tamaño, etc., requieren mucho tiempo o instrumentación especializada, ninguna de las cuales es práctica en el entorno clínico. Por lo tanto, existe la necesidad de un método de aislamiento simple que permita una rápida administración reactiva de HBMDEV a los pacientes. Aquí se propone una combinación de centrifugación de leche materna humana para eliminar la grasa y los desechos celulares, junto con una rápida ultrafiltración de la leche descremada restante que produce vesículas extracelulares funcionales y de alto rendimiento. El uso de esta técnica puede permitir el uso de HBMDEV como una opción terapéutica práctica en el entorno clínico.

Introducción

Las vesículas extracelulares (EV) son nanopartículas ubicuas de aproximadamente 20-1000 nm de tamaño, ya sea a través de vías endosomales (cuando los cuerpos microvesiculares se fusionan con la membrana plasmática, lo que facilita la liberación de carga celular en el espacio extracelular) o vías de la membrana plasmática (es decir, gemación). Los vehículos eléctricos contienen carga celular huésped como lípidos, proteínas, ácidos nucleicos, varios metabolitos y otros contenidos según su fuente. Además, las VE son importantes en la comunicación intercelular, la angiogénesis, la inmunosupresión, la remodelación del microambiente tumoral, la progresión del cáncer, etc.1,2,3,4. En particular, la leche materna humana (HBM) es rica en EV y fácilmente accesible para las madres lactantes5. Recientemente, las VE derivadas de la leche materna humana (HBMDEV) han atraído la atención como vectores terapéuticos para el tratamiento de enfermedades 1,2. Los recién nacidos prematuros o de bajo peso al nacer son susceptibles a varias infecciones, incluida la enterocolitis necrotizante. La enterocolitis necrotizante, caracterizada por necrosis ileal o colónica, varía desde una inflamación intestinal leve hasta una insuficiencia orgánica multisistémica con una tasa de mortalidad infantil de hasta el 50%6. El pretratamiento con VE derivadas de la leche materna es suficiente para proteger de la inflamación intestinal en modelos experimentales de ECN in vitro e in vivo 2,7. Por lo tanto, la utilización de HBMDEV puede ser una opción viable para el tratamiento de la ECN en entornos clínicos.

A pesar de la promesa terapéutica de los HBMDEV, existen limitaciones conocidas que utilizan las técnicas de aislamiento actuales, ya que requieren mucho tiempo o equipos especializados, ninguno de los cuales es universalmente práctico para el entorno clínico. El "estándar de oro" del aislamiento de VE implica varias rondas de ultracentrifugación diferencial, que, aunque produce un rendimiento satisfactorio de VE, puede afectar su integridad estructural y funcionalidad 8,9. Además, los tiempos de ultracentrifugación pueden ser de 2 h como mínimo, un recurso costoso en el entorno clínico9. Los kits de aislamiento han demostrado ahorrar tiempo y ser algo rentables. Sin embargo, el aislamiento con estos métodos también da como resultado bajos rendimientos y, por lo tanto, baja escalabilidad. Por lo tanto, existe la necesidad de técnicas de aislamiento de HBMDEV que ahorren tiempo y sean rentables sin sacrificar el rendimiento de los vehículos eléctricos.

Este protocolo tiene como objetivo describir un método paso a paso para aislar rápidamente las VE de HBM utilizando herramientas existentes clínicamente disponibles y aprobadas por la FDA. Para lograr esto, se utilizó centrifugación estándar y un sistema de extensión de filtro de grado clínico para aislar los vehículos eléctricos de HBM. Estas vesículas están dentro del rango de tamaño esperado, muestran una morfología consistente con las VE conocidas, están enriquecidas para marcadores de VE y son funcionalmente similares a las VE aisladas mediante técnicas tradicionales de aislamiento por ultracentrifugación. Por lo tanto, este protocolo de aislamiento de HBM EV puede permitir un aislamiento práctico y rápido y la aplicación de VE aislados de HBM en el entorno clínico.

Protocolo

La leche materna se recolectó en la Unidad Regional de Cuidados Intensivos de la Universidad de Alabama en Birmingham (UAB). Las muestras recolectadas se recolectaron después de que la leche materna se descongeló para uso del paciente, y el paciente no pudo tomar toda la alimentación. Estas alimentaciones normalmente se descartan, pero se recolectaron con fines de investigación. Se recogieron muestras de individuos no identificados y se almacenaron a -80 °C hasta el momento de los experimentos. La colección fue aprobada por la Junta de Revisión Interna de la UAB Protocolo N160203002. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Aislamiento de vesículas extracelulares (ultracentrifugación diferencial)

  1. En un gabinete de bioseguridad, diluya la leche materna 1:10 en PBS estéril en un tubo cónico de 15 ml.
  2. Centrifugar la leche materna a 300 x g durante 10 min a 4 °C. Después de la centrifugación, debe haber 3 capas distintas: grasa láctea (capa superior), suero o leche descremada (capa acuosa media) y las células y otros desechos (granulados en la parte inferior). En un gabinete de bioseguridad, filtre la grasa de la leche y las capas de suero a través de un filtro de 70 μm (permite una eliminación más fácil de la grasa) sin alterar el gránulo. Transfiera el flujo a un nuevo tubo.
  3. Centrifugar la muestra a 2600 x g durante 10 min a 4 °C. La grasa residual de la leche, las células y los desechos se eliminan en este paso. En un gabinete de bioseguridad, filtre el sobrenadante a través de un filtro de 70 μm. Transfiera el sobrenadante a un tubo de ultracentrífuga. Confirme que hay al menos 10 ml de líquido en el tubo antes de la ultracentrifugación.
  4. Ultracentrifugar la muestra a 20.000 x g durante 45 min a 4 °C. Después de la ultracentrifugación, puede haber tres capas similares al paso 1.2: grasa láctea, suero o leche descremada, y células y otros desechos. En un gabinete de bioseguridad, filtre la grasa de la leche y las capas de suero a través de un filtro de 70 μm sin alterar el pellet. Transfiera el sobrenadante a un tubo cónico de 15 ml.
  5. En un gabinete de bioseguridad, la jeringa filtra la leche materna con un filtro de 0,22 μm. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de ultracentrífuga. Confirme que hay al menos 10 ml de líquido en el tubo antes de la ultracentrifugación.
  6. Ultracentrifugar la muestra a 110.000 x g durante 70 min a 4 °C. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento en 10 ml de PBS estéril.
  7. Ultracentrifugar la muestra de nuevo a 110,00 x g durante 70 min a 4 °C.
  8. En un gabinete de bioseguridad, vuelva a suspender el sedimento en 150-200 μL de PBS estéril.

2. Aislamiento de vesículas extracelulares (método de filtración rápida)

  1. En un gabinete de bioseguridad, diluya la leche materna (1:10) en PBS estéril.
  2. Centrifugar la leche materna a 300 x g durante 10 min a 4°C. Después de la centrifugación, debe haber tres capas distintas: grasa láctea (capa superior), suero o leche descremada (capa acuosa media) y las células y otros desechos (granulados en la parte inferior). En un gabinete de bioseguridad, filtre la grasa de la leche y las capas de suero a través de un filtro de 70 μm (permite una eliminación más fácil de la grasa) sin alterar el gránulo. Transfiera el flujo a un nuevo tubo.
  3. Centrifugar la muestra a 2600 x g durante 10 min a 4°C. La grasa residual de la leche, las células y los desechos se eliminan en este paso. En un gabinete de bioseguridad, filtre el sobrenadante a través de un filtro de 70 μm. Transfiera el sobrenadante a un tubo de 15 ml.
  4. En un gabinete de bioseguridad, prepare un juego de extensión de filtro de 0,22 μm y 16 pulgadas con PBS de 5,4 ml.
    1. Para el sistema de cebado, tome 5.4 ml de PBS estéril en una jeringa y enjuague el sistema hasta que el PBS salga por el otro extremo del tubo.
  5. La jeringa filtra la leche materna a través de un juego de extensión de filtro de 0.22 μm y 16 pulgadas. La grasa residual de la leche, las células y los desechos se eliminan en este paso.
    NOTA: Es posible que se necesite más de un juego de extensión de filtro dependiendo de la cantidad de desechos presentes en la muestra.
  6. Recoja el flujo en un tubo cónico de 15 ml.

3. Análisis de seguimiento de nanovisión

  1. Diluir la muestra (1:1000) en PBS estéril. Las muestras filtradas rápidamente se pueden utilizar sin diluir.
  2. Corta brevemente la muestra en vórtice. Cargue 1 ml de la muestra en una jeringa de tuberculina.
  3. Conecte la jeringa al aparato de inyección y asegúrela.
  4. Ajuste la bomba de inyección a 50. Encienda la cámara para asegurarse de que las partículas vistas no sean demasiadas o muy pocas. Asegúrese de que el flujo de partículas sea constante sin saltos ni saltos repentinos en el flujo de muestras.
  5. Ajuste la bomba de inyección a 100. Ejecute el protocolo.
    NOTA: El software se configuró para leerse una vez por minuto para un total de 5 lecturas.
  6. Lea el ejemplo.
  7. Enjuague Nanosight entre muestras con PBS.
    NOTA: Se utilizó un sistema de análisis de seguimiento de nanopartículas para determinar el tamaño de partícula y la concentración de partículas por mililitro. La concentración promedio de la muestra ultracentrifugada fue de 3.30 e+08 +/- 4.08 e+06 partículas/mL, mientras que el método de filtración rápida fue de 5.50e+08 +/- 1.16e+08 partículas/mL.

4. Tinción negativa de vesículas extracelulares y microscopía electrónica de transmisión

NOTA: Las muestras con concentración de exosomas en el rango de 108 se utilizaron para microscopía electrónica de transmisión (TEM).

  1. Rejillas EM de cobre de malla recubiertas de película de carbono durante 25 s a 20 mA utilizando el aparato de descarga.
  2. Cargue 7 μL de la solución de suspensión EV en la rejilla e incube durante 1 min.
  3. Absorba el exceso con papel de filtro Whatman absorbiendo desde debajo de la rejilla para "tirar" de la muestra hacia la rejilla en lugar de alejarla de ella.
  4. Tiña la muestra inmediatamente con 7 μl de solución filtrada de acetato de uranilo (UA) al 1% en la superficie de la rejilla EM mediante una pipeta.
  5. Después de 15 s, el exceso de solución de UA se eliminó de la rejilla haciendo contacto con el borde de la rejilla con papel de filtro. Vea la muestra inmediatamente (dentro de las 24 h) en el TEM a 80 kv.

5. Concentración de proteínas

  1. La acetona precipita 250 μL de EV purificados (1:4) durante 1 h a -20 °C.
    NOTA: Utilice 100 μL de exosomas purificados para el método de ultracentrifugación.
  2. Centrifugar la muestra a 16.000 x g durante 30 min.
  3. Seque el pellet al aire, seguido de una nueva suspensión en 100 μL de tampón RIPA.
  4. Siga el protocolo del kit de ensayo de proteínas BCA para determinar las concentraciones de proteínas. La absorbancia se midió a 562 nm utilizando un lector de microplacas.
    NOTA: 1 ml de leche materna normalmente produce aproximadamente 1,3 μg/ml de proteína mediante ultracentrifugación y aproximadamente 0,2-1 μg/ml de proteína mediante filtración rápida.

6. Transferencia occidental

  1. Incube una muestra de proteína de 1 volumen con un marcador de carril de 4 volúmenes, reduzca el tampón de muestra y hiérvalo durante 7 min a 90 °C.
  2. Cargue y ejecute 10 μg de proteína en un gel SDS 10% a 70 V durante 15 min. A continuación, aumente la tensión a 100 V y haga funcionar durante 90 minutos más.
  3. Transfiera el gel a una membrana de nitrocelulosa utilizando el aparato semiseco durante 30 min a 15 V.
  4. Lave la membrana 3 veces con TBS-0.1% Tween (TBS-T) durante 10 min cada una.
  5. Bloquee la membrana durante 30 min con una solución tampón de bloqueo rápido (diluida a 1x).
  6. Incubar el anticuerpo primario (Hsp70-1:1000; CD63-1:1000 y CD9-1:1000) en 1x solución tampón, durante la noche a 4 °C en un balancín 10,11,12.
  7. Lave la membrana tres veces durante 10 minutos cada una con TBS-T.
  8. Agregue (H + L) anticuerpo secundario anti-ratón conjugado HRP, a una dilución de 1: 1000 para todas las proteínas interrogadas (Hsp70, CD9 y CD63) en leche al 2% en TBS-T e incube durante 2 h a temperatura ambiente en un balancín.
  9. Lave la membrana tres veces durante 10 minutos cada una con TBS-T.
  10. Revele usando ECL (1: 1) y filme con revelador.

7. Cultivo in vitro de células IEC-6

  1. Siembra 1.0 x 106 células en un matraz T-25 en 5 mL de medio RPMI completo. Deje que las células se adhieran durante la noche.
  2. Retire el medio completo y lave con 1-2 ml de PBS.
  3. Aspire PBS y agregue 5 ml de RPMI completo sin EV.
  4. Agregue una concentración final de 400 μM H2O2 por pocillo y 10 μg/ml de EV simultáneamente a las células durante la noche.
  5. Retire los medios y lave las células con 1-2 ml de PBS.
  6. Aspire el PBS y agregue 1 ml de tripsina.
    1. Coloque las células en la incubadora a 37 ° C durante 5 min.
  7. Desactive la tripsina agregando el doble del volumen de RPMI completo. Transfiera las células a un tubo de 15 ml y centrifugue a 125 x g durante 5 min.
  8. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento en 1 ml de PBS.
  9. Cuente las células usando un contador de celdas.

Resultados

Aislamiento de vehículos eléctricos mediante ultracentrifugación y aislamiento rápido
Dogmáticamente, el aislamiento de EV de HBM implica centrifugación para eliminar la grasa de la leche y otras partículas grandes, seguida de filtrado, varias rondas de ultracentrifugación y resuspensión de la muestra enriquecida con EV en PBS. El método de filtración rápida utiliza la centrifugación para eliminar la grasa de la leche y los desechos celulares, seguido de la filtración a través de un filtro de extensión de filtro de 0,22 μm, eliminando aún más los desechos residuales, lo que produce una muestra enriquecida con EV comparable a la ultracentrifugación tradicional (Figura 1).

Caracterización de HBMDEV a partir del sistema de filtración rápida de extensión de filtro
El análisis de seguimiento de nanosight reveló un tamaño de partícula comparable entre los HBMDEV ultracentrifugados (Figura 2A) y los aislados de filtro rápido (Figura 2B). Ambos métodos indican que los VE aislados tienen un tamaño medio de aproximadamente 100 nm. Los EV transportan diversas cargas (es decir, proteínas, lípidos, miARN, etc.) para la secreción de las células huésped a sus diversos objetivos. Por lo tanto, la primera proteína diana examinada fue la proteína de choque térmico 70 (Hsp70), una proteína que se sabe que se transporta a través de EV13. El análisis de Western blot muestra que las VE aisladas mediante filtración rápida mostraron una expresión comparable de Hsp70, como las aisladas mediante ultracentrifugación (Figura 3A y Figura complementaria 1A). Además, las VE se pueden identificar a través de la expresión superficial de tetraspaninas como CD9 y CD6314. El análisis de Western blot reveló que las VE aisladas mediante filtración rápida expresan CD9 (Figura 3B y Figura complementaria 2B) y CD63 (Figura 3C y Figura complementaria 3C). Por último, el análisis morfológico de los HBMDEV mediante microscopía electrónica de transmisión reveló una morfología de vesículas similar entre las dos técnicas de aislamiento (Figura 4A-D).

Varios laboratorios han demostrado que las VE confieren propiedades protectoras que promueven la supervivencia celular durante el estrés celular 2,3,7. Al igual que en informes publicados anteriormente, las VE aisladas mediante el método de filtración rápida pueden proteger las células epiteliales intestinales (IEC-6) de la muerte celular inducida por peróxido de hidrógeno2 (Figura 5A, B). Estos datos sugieren que los HBMDEV aislados mediante el método de filtración rápida no solo poseen cualidades comparativas a los aislados mediante ultracentrifugación diferencial, sino que también son funcionalmente similares.

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Figura 1: Esquema que delinea las diferencias entre los métodos de ultracentrifugación y filtración rápida del aislamiento de VE de la leche materna humana. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Análisis de seguimiento de nanosight de VE aisladas de leche materna humana mediante ultracentrifugación y método de filtración rápida. (A) NTA de VE de leche materna humana (diluido 1:1000 en 1x PBS) aislado mediante ultracentrifugación. Los datos mostrados son una representación única de 3-4 ensayos independientes. (B) NTA de EV de leche materna humana aisladas mediante filtración rápida. Los datos mostrados son una representación única de 3-4 ensayos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Análisis de Western blot de VE aislados mediante ultracentrifugación y filtración rápida. (A) Exposición de un segundo de 10 μg de proteína de choque térmico 70 (Hsp70). "L" denota escalera, "U" denota ultracentrifugación y "R" denota filtración rápida. Las muestras obtenidas por filtración rápida se concentraron aún más por centrifugación a 110.000 × g durante 70 min, realizada dos veces. La imagen mostrada representa uno de los cuatro ensayos independientes. (B) Vigésimo segunda exposición de 10 μg de CD9. "L" denota escalera, "U" denota ultracentrifugación y "R" denota filtración rápida. Las muestras de filtración rápida se concentraron por centrifugación a 110.000 × g durante 70 min, realizadas dos veces. La imagen mostrada representa uno de los cuatro ensayos independientes. (C) Vigésimo segunda exposición de 10 μg de CD63. "L" denota escalera, "U" denota ultracentrifugación y "R" denota filtración rápida. Las muestras de filtración rápida se concentraron por centrifugación a 110.000 × g durante 70 min, realizadas dos veces. La imagen mostrada representa uno de los cuatro ensayos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Análisis de microscopía electrónica de transmisión de VE aislados mediante ultracentrifugación y filtración rápida. (A) Micrografía electrónica de VE aislada mediante ultracentrifugación con un aumento de 8.000× de frecuencia. Barra de escala = 800 nm. La imagen mostrada representa uno de los tres ensayos independientes. (B) Micrografía electrónica de VE aisladas mediante ultracentrifugación a 20.000× de aumento. Barra de escala = 200 nm. La imagen mostrada representa uno de los tres ensayos independientes. (C) Micrografía electrónica de vehículos eléctricos aislados mediante filtración rápida con un aumento del 8.000×. Barra de escala = 800 nm. Los VE se concentraron por centrifugación a 110.000 × g durante 70 min, realizada dos veces. La imagen mostrada representa uno de los tres ensayos independientes. (D) Micrografía electrónica de VE aisladas mediante filtración rápida con un aumento de 20.000×. Barra de escala = 200 nm. Los VE se concentraron por centrifugación a 110.000 × g durante 70 min, realizada dos veces. La imagen mostrada representa uno de los tres ensayos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Análisis funcional de los vehículos eléctricos aislados mediante ultracentrifugación y filtración rápida. (A) Viabilidad celular de células IEC-6 cultivadas en medio RPMI-1640 completo sin EV. Las células se trataron durante la noche con 400 μM H, 2O, 2 y 10 μg/mL de EV simultáneamente. Los datos mostrados representan uno de dos ensayos independientes. (B) Recuentos celulares de células IEC-6 cultivadas en medio RPMI-1640 completo sin EV. Las células se trataron durante la noche con 400 μM H, 2O, 2 y 10 μg/mL de EV simultáneamente. Los datos mostrados representan uno de dos ensayos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Caracterización de Western blot de Hsp70 en VE aisladas mediante ultracentrifugación y filtración rápida. Exposición en un segundo de 10 μg de proteína de choque térmico 70 (Hsp70). "L" denota escalera, "U" denota ultracentrifugación y "R" denota filtración rápida. Las muestras de filtración rápida se concentraron por centrifugación a 110.000 × g durante 70 min, realizadas dos veces. Cada muestra representa una única réplica biológica. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Caracterización de Western blot de CD9 en VE aislados mediante ultracentrifugación y filtración rápida. Exposición de cinco minutos de 10 μg de CD9. "L" denota escalera, "U" denota ultracentrifugación y "R" denota filtración rápida. Las muestras de filtración rápida se concentraron por centrifugación a 110.000 × g durante 70 min, realizadas dos veces. Cada muestra representa una única réplica biológica. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 3: Caracterización de Western blot de CD63 en VE aislados mediante ultracentrifugación y filtración rápida. Exposición de diez minutos de 10 μg de CD63. "L" denota escalera, "U" denota ultracentrifugación y "R" denota filtración rápida. Las muestras de filtración rápida se concentraron por centrifugación a 110.000 × g durante 70 min, realizadas dos veces. Cada muestra representa una única réplica biológica. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Los VE están atrayendo la atención ya que la literatura sugiere que pueden regular varios mecanismos inflamatorios y pueden ofrecer beneficios protectores 2,7. Sin embargo, una limitación del uso práctico de las VE en entornos clínicos es el tiempo necesario para aislar las VE y extraer un rendimiento suficiente 8,15. Aquí, se ha esbozado un protocolo paso a paso para el aislamiento rápido y eficiente de los vehículos eléctricos de HBM utilizando un sistema de filtración aprobado por la FDA. La utilidad de este método reduce a la mitad los métodos tradicionales de aislamiento de vehículos eléctricos sin sacrificar el rendimiento. Por lo tanto, este protocolo puede permitir la aplicación terapéutica práctica de las VE derivadas de la leche materna humana en un entorno clínico, en caso de que se apruebe la terapia con VE en un futuro previsible.

Los protocolos de aislamiento de vehículos eléctricos existentes han demostrado un rendimiento constante y efectivo de los vehículos eléctricos a partir de su fluido fuente. Sin embargo, los medios tradicionales de aislamiento, ya sea el estándar de oro, la ultracentrifugación diferencial o el uso de kits comerciales, no están exentos de limitaciones. El aislamiento de los vehículos eléctricos mediante ultracentrifugación diferencial, aunque eficaz, requiere mucho tiempo con protocolos que implican tiempos de centrifugado combinados de un mínimo de ~3 h 2,8,15. El tiempo de aislamiento combinado con protocolos para cuantificar adecuadamente los números de EV haría que su uso bajo limitaciones de tiempo en un entorno clínico fuera un desafío. Además, los kits comerciales, aunque efectivos, son costosos. Además, el número de muestras que se pueden procesar por kit es bajo, dados los altos costos de estos kits 8,15.

Este protocolo ofrece una solución a estas limitaciones que ahorra tiempo y dinero sin sacrificar el rendimiento o la pureza de los vehículos eléctricos. Para que este protocolo sea efectivo, hay pasos clave que se deben seguir a la hora de llevar a cabo el protocolo. La dilución y centrifugación inicial de la leche materna humana son necesarias para la eliminación de los restos extracelulares y la grasa láctea de la muestra de leche. La eliminación de estos residuos es fundamental para evitar la obstrucción del sistema de extensión del filtro y, por lo tanto, evita tener que usar varios filtros para una muestra. Además, el lavado del sistema de extensión del filtro con PBS es fundamental, ya que prepara el filtro para preparar la muestra. El cebado ayuda a garantizar que la muestra no se pierda durante el proceso de cebado. Cabe señalar que, dependiendo del contenido de la muestra de leche materna, puede ser necesario más de un juego de extensión de filtro, independientemente de la dilución y centrifugación de la muestra antes de la filtración. En caso de que esto ocurra, se puede usar más de un filtro; sin embargo, el nuevo conjunto de extensión de filtro debe cebarse antes de la filtración de la muestra.

Este protocolo es efectivo y consistente para aislar las VE de la leche materna humana, sin embargo, hay un par de limitaciones a considerar. Son necesarios los pasos de centrífuga (~20 min de tiempo total entre ambos giros) antes de la filtración de la muestra. Los intentos de filtrar la muestra diluida sin centrifugación provocarán la obstrucción repetida del sistema de extensión del filtro, la pérdida de muestra y agregarán tiempo adicional al protocolo de aislamiento EV. Además, la muestra no era pura, como lo demuestra el análisis NTA y TEM. Los intentos de utilizar muestras que no han sido centrifugadas antes de la filtración pueden introducir contaminantes no deseados en la muestra, lo que puede producir efectos fuera del objetivo dependiendo de la futura aplicación posterior de vehículos eléctricos aislados. Además, este protocolo solo se ha implementado con respecto al aislamiento de VE de la leche materna humana. Por lo tanto, no se ha investigado la eficacia de este protocolo en el aislamiento de VE de otros fluidos. Dada la naturaleza acuosa de todos los fluidos corporales, no se prevé que haya diferencias en la pureza y el rendimiento de los vehículos eléctricos si se utiliza este protocolo para aislar los vehículos eléctricos de otras fuentes.

También hay que tener en cuenta que este protocolo es eficaz para aislar pequeñas vesículas extracelulares (sEV). Según la NTA, los vehículos eléctricos derivados de HBM tenían un tamaño de ~ 100 nm, lo que sugiere que los vehículos eléctricos más grandes no estaban presentes en la muestra. La razón es que las muestras se filtraron utilizando un filtro de 0,22 μm, que se utiliza principalmente para el aislamiento de exosomas y otras VE más pequeñas, un enfoque principal del laboratorio en el momento de este estudio. En teoría, la utilización de un filtro con tamaños de poro más grandes puede permitir el aislamiento de vehículos eléctricos más grandes. Sin embargo, estas preguntas están más allá del alcance de este estudio.

Los VE derivados de la leche materna humana representan una fuente terapéutica natural de fácil acceso para uso clínico. Una limitación para llevar el trabajo de VE al entorno clínico es aislar los VE en un método práctico que cualquier instalación podría usar. Este protocolo está diseñado para superar esa limitación y se puede aplicar fácilmente en el entorno hospitalario e implementarse utilizando un sistema de filtración existente de grado hospitalario aprobado por la FDA, disponible comercialmente, o se puede comprar por mucho menos que la ultracentrífuga estándar. Este método es rentable y produce una muestra pura y rica en EV a partir de un sistema de filtración que ya se utiliza en el entorno clínico.

Divulgaciones

El autor o autores declararon que no hay posibles conflictos de intereses con respecto a la investigación, autoría y/o publicación de este artículo.

Agradecimientos

Las imágenes y figuras se generaron utilizando biorender.com. La investigación informada en esta publicación fue apoyada por la Instalación de Imágenes de Alta Resolución de la UAB. Este trabajo fue apoyado por NIH/NICHD 5R21HD104481.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
(H+L) Anti-ratón conjugado con HRPBio-Rad1721011
(H+L) Anti-conejo conjugado HRPBio-Rad1706515
Filtro de jeringuilla 0,20Fisherbrand09-719C
Colador de celda mmm 0,70Corning431751
1,5 m Tris HCLFabricado internamente
Tubos de 15 mLHalcón352096
Conjunto de extensión de filtro de 16 pulgadasB-BRAUNFE2012F
1M Tris HCLTeknovaT1068
1x PBSGibco10010-031
Tubos de 50 mLHalcón353070
Amortiguador de muestra reductor 5xTermo Científica39000
AcilamidaFisher Scientifc BP1410-1
Anfotericina BGibco15290-018
Cámara AMT NanoSprint43 Mark-IIAMT
Anti-AntiGibco15240-062
Anti-CD63NovusbioNBP2-32830
Anti-CD9Invitrogen10626D
APSTermo Científica17874
Kit de ensayo de proteínas BCAPierce23227
Tubos BeckmanBeckman coulter 344059
BrightStar ECL QuimioluminiscenteAlkali ScientificXR92
FBS agotado por exosomasFisher ScientificNC0464480
Búfer de bloqueo rápidoPierce37575
Suero fetal bovinoTecnologías de la vida10082147
Hsp70InvitrogenMA3-006
Insulina humanaSigma-AldrichI9278-5ML
Peróxido de hidrógenoFisher ScientificH325-500
IEC-6 ATCCCRL-1592
JEOL 1400 FLASH TEMJEOL USA Inc
Amortiguador de muestra reducidor de marcadores de carrilTermo Científica39000
Leche en polvoBioworld30620074-1
Nanosight NS 300Malvern Instruments Ltd.
Membrana de nitrocelulosaTecnologías vitales88018
Aparato de descarga PELCO easiGlowTed Pella
Mini comprimidos inhibidores de proteasaPierceA32955
Amortiguador RIPAPierce89901
RPMI 1640Fisher Scientifc 11875119
SDSFisher Scientifc BP2436-200
Matraz T-25Termo Científica156367
TBSFabricado internamente
TEMEDBio-Rad161-0801
Tripsina EDTAGibso25200-056
Preadolescentes 20Termo CientíficaJ20605-AP

Referencias

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