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Un ensayo de dosis infecciosa de cultivo de tejidos (TCID50) en tiempo real y sin marcador, optimizado y sin marcador, utilizando impedancia para la cuantificación automatizada de títulos virales

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DOI:

10.3791/67956

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9 de enero de 2026

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1Agilent Technologies, Inc.

En este artículo

Resumen

El ensayo TCID50 aquí reportado utiliza mediciones de impedancia en tiempo real sin etiqueta y el módulo de Virología del sistema para monitorizar objetivamente los efectos citopáticos (CPE) inducidos por virus en tiempo real. Este ensayo simplificado reduce significativamente el tiempo de trabajo práctico, al tiempo que permite mediciones cuantitativas de CPE cinética de alto rendimiento y permite cálculos automatizados y en tiempo real de TCID50.

Resumen

Medir el título viral, la concentración de un virus en una muestra, es un procedimiento fundamental en la investigación virológica. Aunque esenciales, métodos tradicionales como el ensayo de placas y el ensayo TCID50 pueden ser lentos, requieren tinción o marcado de reactivos, y a menudo implican interpretación subjetiva, especialmente cuando los efectos citopáticos (EPC) son sutiles o difíciles de cuantificar mediante imágenes. Por ejemplo, los ensayos TCID50 pueden emplear tintes de viabilidad como MTT o MTS, mientras que los ensayos de placas dependen de imágenes y tinción para visualizar placas virales, ambas pueden introducir variabilidad. Además, estos métodos tradicionales solo ofrecen una instantánea estática de la infectividad viral, limitando la capacidad de captar las interacciones dinámicas entre virus y células permisivas. Para superar las limitaciones actuales en la medición del título viral, se desarrolló un ensayo TCID50 simplificado utilizando tecnología basada en impedancias para medir la CPE de forma objetiva, no invasiva y en tiempo real, eliminando la necesidad de etiquetas. En este estudio, se utilizaron dos modelos celulares permisivos por virus para validar el ensayo de impedancia-TCID50: el adenovirus marcado con GFP (Adv-GFP) en células HEK293A y el virus de la gripe A (IAV) en células MDCK. El flujo de trabajo es sencillo, abarcando la siembra celular, la inoculación contra virus, la monitorización en tiempo real y el análisis automático de TCID50 por parte del software. Durante toda la infección, los valores de TCID50 fueron calculados automáticamente por el software del sistema usando la fórmula Reed-Muench en todos los momentos registrados. Los valores TCID50 de IAV obtenidos mediante lecturas de impedancia eran comparables a los generados por el ensayo convencional TCID50 basado en tinción de violeta cristalina. Estos resultados demuestran que la cuantificación del virus puede lograrse de forma precisa y eficiente utilizando la medición de impedancias en combinación con el Módulo de Virología del software del sistema. El nuevo ensayo simplifica los métodos tradicionales y proporciona una visión más amplia de la dinámica viral, apoyando así la investigación virológica avanzada y ampliando las posibles aplicaciones clínicas.

Introducción

A medida que la investigación en virología evoluciona rápidamente, la cuantificación precisa de la infectividad viral sigue siendo crucial para comprender los mecanismos virales, desarrollar terapias antivirales y evaluar la eficacia de las vacunas. Uno de los procedimientos más importantes es medir el título viral, la concentración de partículas virales en una muestra. El ensayo TCID50, que cuantifica el número de partículas virales infecciosas necesarias para producir CPE en el 50% de las células inoculadas, es uno de los métodos más utilizados para determinar el título viral funcional. Este ensayo final, ampliamente utilizado, es especialmente valioso para virus que no forman placas y puede servir como alternativa al ensayode placas 1.

En general, el ensayo TCID50 tarda entre 2 y 14 días, dependiendo del virus y de las células permisivas. La ECP, incluyendo cambios en la proliferación celular, morfología y viabilidad, se evalúa mediante (1) medición colorimétrica tras la adición de reactivos, como el ensayo MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-bromuro de difeniltetrazolio) y el ensayo MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetifenol)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio), utilizando un ensayolector de placas 2, o (2) evaluación visual de cambios morfológicos o relacionados con el cultivo utilizando plataformas de imagen óptica — por ejemplo, evaluar la CPE midiendo el porcentajede confluencia 3, o (3) la detección visual de la CPE mediante tinción de violeta cristalina tras la fijación de pozos tratados con virus con formalina o paraformaldehído (PFA). La tasa positiva de infección viral derivada del número de réplicas CPE positivas en cada dilución viral es la base para el cálculo de TCID50. La dilución en la que el 50% de los cultivos presentan CPE se calcula estadísticamente usando fórmulasestablecidas 4, como Reed-Muench, Spearman-Karber y Improved-Karber, y el resultado se informa como TCID50 por mililitro (TCID50/mL).

Los ensayos tradicionales de TCID50 y placas son ampliamente reconocidos como el estándar de oro para la cuantificación viral funcional y pueden aportar información invaluable. Sin embargo, estos ensayos suelen ser tediosos, tardados y requieren tinción manual para visualizar la CPE, lo que resulta en bajo rendimiento, mayores riesgos de error humano y subjetividad. Para virus altamente infecciosos o letales, minimizar el tiempo de exposición a virus y reducir los residuos que contienen virus por pasos adicionales, como la tinción, son consideraciones importantes para mejorar la bioseguridad. Excepto el ensayo TCID50 basado en imagen sin etiqueta, la mayoría de los ensayos TCID50 y de placas también son ensayos de punto final, lo que puede resultar en un momento de evaluación de títulos subóptimo y limitar la capacidad de observar las interacciones dinámicas entre virus y células hospedadoras. Para superar estas limitaciones, se desarrolló y estableció un ensayo TCID50 simplificado, libre de etiquetas y en tiempo real. Aunque conceptualmente es similar al ensayo convencional TCID50, el nuevo método aprovecha lecturas de impedancia celular, capturadas y analizadas por el sistema RTCA MP, para monitorizar la infección de forma objetiva y continua a lo largo del tiempo.

Se ha demostrado y verificado que la biodetección basada en impedancia proporciona una lectura compuesta cualitativa y cuantitativa del número celular, morfología y resistencia de unión célula-sustrato de manera no invasivay libre de marcadores 5,6. Estudios previos han demostrado que la CPE inducida por virus puede cuantificarse con precisión en tiempo real utilizando mediciones de impedancia RTCA 7,8,9. En lugar de informar valores de impedancia en bruto, los sistemas utilizan un parámetro sin unidades llamado Índice de Celda (CI) para reflejar los cambios en la impedancia debidos a eventos celulares. Por ejemplo, a medida que las células se adhieren, se dispersan y crecen en el fondo del pozo, el IC aumenta. Por el contrario, cuando las células mueren, se encogen o se desprenden, como durante una infección viral, la IC disminuye.

Teniendo en cuenta los prometedores informes sobre el uso de impedancia para medir la ECP, este estudio pretendió demostrar que el ensayo TCID50 basado en impedancia es una alternativa fiable y precisa a la cuantificación viral convencional. El módulo de Virología del software del sistema permite el cálculo automatizado de TCID50 durante toda la medición CPE en tiempo real, agilizando y acortando el proceso de ensayo y proporcionando valiosas perspectivas sobre la cinética de la replicación viral y su interacción con células permisivas.

Protocolo

Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Ensayo TCID50 basado en impedancias

NOTA: Como ilustra la Figura 1 , un ensayo TCID50 basado en impedancia consta de cuatro pasos, que incluyen la siembra permisiva de células en una placa biosensor, la preparación e inoculación de la dilución del virus, la medición de CPE en el sistema y, finalmente, el análisis de datos y el cálculo de TCID50 utilizando el módulo de Virología del software del sistema.

  1. Preparación del ensayo: reanimación y subcultivo de células permisivas
    NOTA: Este paso debe realizarse una semana antes del ensayo. Para minimizar la variación entre experimentos, se recomienda encarecidamente preparar un banco de células permisivas con el mismo número de pasaje para su uso en el ensayo. No uses células mayores de 15 conductos tras la compra por parte del proveedor de telefonía.
    1. Deshielo, criopreserva células permisivas
      1. Medio de crecimiento celular tibio en un baño maria a 37 °C durante al menos 30 minutos. Por ejemplo, se utilizó el Medio Águila Modificado (DMEM) de Dulbecco, suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) y 1% penicilina/estreptomicina, para el cultivo HEK293A.
      2. Descongelar un vial de células del banco de celdas criopreservado para ensayos TCID50 girándolo suavemente en un baño de agua a 37 °C durante 1-2 minutos hasta que queden algunos cristales de hielo; No sumergas la tapa. Limpia el vial con etanol al 70% y colócalo en una campana laminar.
      3. Transfiere suavemente las células a un nuevo tubo cónico de 50 mL y añade 9 mL de medio de crecimiento calentado a las células.
      4. Centrifuga la suspensión de celdas a 300 x g durante 4 minutos a temperatura ambiente.
      5. Descarta el sobrenadante y vuelve a suspender las células en 15 mL de medio de crecimiento calentado. Transfierelos a un nuevo frasco T75.
      6. Cultivar células hasta una confluencia del 80%-90% en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2.
    2. Subcultivo de células permisivas.
      1. Monitoriza las células hasta que alcancen una confluencia del 80%-90%.
      2. Retira el medio que contiene suero del matraz y enjuaga suavemente la monocapa celular una vez con la solución fisiológica de Dulbecco (DPBS) libre de Mg y Ca.
      3. Tripsiniza las células distribuyendo uniformemente 2 mL de solución de tripsina/EDTA al 0,05% por matraz T75 y dejando el termo en una incubadora a 37 °C durante 1-3 minutos.
        NOTA: No sobre-tripsinize las células, ya que esto puede ser perjudicial para ellas.
      4. Detener la tripsinización añadiendo 8 mL de medios que contienen suero para diluir el volumen original de tripsina al menos cinco veces. Transfiere 2,5 mL de la suspensión de la celda a un nuevo matraz T75 y luego añade 8 mL de medio de cultivo.
        NOTA: Evite usar celdas permisivas recién descongeladas para el ensayo TCID50. En su lugar, utiliza células cultivadas con una confluencia del 80%-90%. Para reducir la variabilidad interexperimental, las células revividas deben mantenerse durante un máximo de dos semanas tras el descongelamiento. Para asegurar una alta viabilidad y proliferación celular durante el cultivo de dos semanas: (1) cambiar el medio de crecimiento al menos dos veces por semana; (2) subcultivo de células cuando alcanzan una confluencia del 80%-90%. Para un mantenimiento prolongado que supera las dos semanas, se requiere validación.
  2. Título viral
    NOTA: Este paso debe realizarse en el Día 1.
    1. Medición del fondo de la placa biosensora
      1. Transfiera cuidadosamente 50 μL de medio precalentado a cada pozo utilizando una pipeta multicanal, utilizando la técnica de pipeteo inverso para minimizar la formación de burbujas y asegurar una dispensación de volumen constante.
      2. Coloca la placa en la estación de placas; abrir el software del sistema y seleccionar el módulo de Virología antes de comenzar el experimento. Introduce cualquier nota relevante en la pestaña Notas de Expansión e introduzca información de celdas, incluyendo nombre y número de celdas, en la subpestaña Celda de la pestaña de Diseño tras seleccionar los pozos correspondientes. Alternativamente, la información de la célula puede introducirse después de la siembra.
        NOTA: La medición del fondo de la placa debe realizarse antes de añadir celdas a los pozos de la placa. Las lecturas de fondo para todos los pozos deberían estar entre -0,063 y 0,063.
      3. En la pestaña Agenda , haz clic en el botón Añadir un paso para añadir el Paso 1, que está destinado a la medición del fondo de placas. Luego, inicia la grabación haciendo clic en el botón Iniciar .
      4. Quita la placa de la estación y colócala de nuevo en el capó para la siembra de celdas.
    2. Siembra permisiva de células en la placa biosensor de 96 pozos
      1. Tripsiniza las células permisivas del matraz T75.
      2. Cuenta las células y ajusta la suspensión celular a la concentración deseada. En este estudio, la concentración de HEK293A fue de 60.000 células/mL.
      3. Añade 100 μL de suspensión de celda a cada pozo de la placa.
        NOTA: La densidad celular adecuada es esencial. Una densidad de siembra subóptima podría resultar en un artefacto experimental. Por lo tanto, la densidad de siembra debe optimizarse antes de realizar un ensayo TCID50.
      4. Deja la placa en la campana a temperatura ambiente durante 30 minutos después de añadir la celda, permitiendo que las células se distribuyan uniformemente en el fondo del pozo.
        NOTA: No realizar este paso podría provocar grandes variaciones de pozo a pozo.
      5. Coloque la placa en la estación de placas dentro de una incubadora a 37 °C con 5% deCO2.
      6. Ve a la pestaña de Programación del software y añade el Paso 2 usando la configuración predeterminada de grabación: 100 barridos y un intervalo de 15 minutos. Esto iniciará el monitoreo de impedancias/IC cada 15 minutos, permitiendo una evaluación en tiempo real de la unión y proliferación celular como un paso de control de calidad celular (QC) previo a la inoculación viral.
        NOTA: Día 2 - Para maximizar la reproducibilidad y consistencia del ensayo entre experimentos, es fundamental evaluar el rendimiento de las células en el sistema antes de pasar al siguiente paso. Dado que el IC refleja la unión y el crecimiento celular, los valores de IC durante el periodo de 20-28 horas posteriores a la siembra sirven como un parámetro clave de control de calidad. Tanto el valor como la cinética del IC son específicos de cada célula. En este estudio, para HEK293A células sembradas a 6.000 células por pozo y cultivadas durante 20-28 horas, el IC debería superar 2. Si el IC no alcanza 2 en 20-28 horas tras la siembra, el cultivo celular HEK293A se considera que no ha superado el control de calidad (QC), y el posterior ensayo TCID50 no se realizará. Este criterio garantiza una alta reproducibilidad de los resultados experimentales.
    3. Preparación de diluciones en serie viral
      1. Calcula el volumen total del medio (DMEM + 2% FBS + 1% penicilina / estreptomicina) necesario para preparar las diluciones y caliéntalo en un baño maria a 37 °C durante 30 minutos. El medio se utilizará durante el resto del experimento.
      2. Descongela rápidamente un vial de stock viral aliquotado en un baño maria a 37 °C durante 1-2 minutos hasta que todos los cristales de hielo se hayan derretido.
      3. Preparar virus diluidos en serie de 10 veces transfiriendo 20 μL del material viral a un tubo microcentrífuga de 1,5 mL que contenga 180 μL de medio precalentado en cada paso. Pipetea arriba y abajo para asegurar una mezcla adecuada del medio y el virus.
        NOTA: No sumergas la punta de la pipeta demasiado profundamente en la solución viral para evitar que el exceso de residuos de partículas virales salgan de la punta, lo que podría resultar en diluciones inexactas.
      4. Para evitar fluctuaciones en las lecturas de impedancia causadas por la adición de muestras del virus del resfriado, se equilibran las diluciones del virus incubándolas en la incubadora a 37 °C con un 5% de CO2 durante 20 minutos antes de la inoculación.
    4. Introduce la información sobre el tratamiento viral en la pestaña de Diseño
      1. En la pestaña de Distribución de placas del software; seleccionar los pozos para el tratamiento con título viral; haz clic en la subpestaña Tratamiento e introduce la dilución inicial, por ejemplo, 0.001 (10-3) en este experimento; introducir 10 como el "Factor de Dilución"; seleccione la dirección de dilución, de izquierda a derecha en este caso. La dilución viral se calculará automáticamente en función de la disposición de la placa y se mostrará en cada pozo correspondiente.
      2. A continuación, introduce el Volumen de Inoculación del virus y haz clic en el botón Aplicar para guardar toda la información del tratamiento. Este paso es esencial para calcular con precisión el TCID50/mL durante el análisis de datos.
      3. Asigna los pozos que no serán tratados con virus como controles negativos seleccionando los pozos apropiados y luego marcando Ctrl negativo en Tipo de pozo en la pestaña de Tratamiento .
        NOTA: Los pozos de control negativo deben designarse y añadirse a la página de Diseño; La omisión impedirá el cálculo de TCID50.
    5. Inoculación viral
      1. Cuando esté listo, pulsa el botón de Pausa en el software para detener la adquisición de datos. Retira la placa de la estación y colócala en la campana laminar.
      2. Retira cuidadosamente el medio de cultivo de los pozos de la placa usando una pipeta multicanal.
      3. Añade suavemente 50 μL de dilución viral usando una pipeta multicanal en la parte superior de la monocapa celular, evitando la interrupción del cultivo celular.
      4. Vuelve a colocar la placa en la Estación y añade el Paso 3 usando los ajustes de grabación por defecto (100 barridos y un intervalo de 15 minutos) en la pestaña de Programar para reanudar la impedancia de registro cada 15 minutos durante 2 horas, permitiendo que el virus se una a las celdas.
      5. Tras 2 horas de inoculación viral, pausa la grabación y retira la placa de la Estación a la capucha laminar.
      6. Añadir lentamente 150 μL de medio precalentado en los pozos usando una pipeta multicanal, evitando la interrupción de la monocapa celda; devuelva la matrícula a la estación.
      7. Reanuda el Paso 3 haciendo clic en Iniciar en la pestaña de Horario . Las señales de impedancia se miden continuamente cada 15 minutos durante todo el periodo de inoculación.
    6. Cálculo de TCID50 durante o después de que se complete el ensayo TCID50
      1. En la pestaña de Análisis de Datos , selecciona y añade todos los pozos utilizados en el ensayo al gráfico gráfico. El eje y del gráfico se determina mediante la opción seleccionada en el menú desplegable del eje Y .
      2. Ve a la sección de Parámetros . Seleccione TCID50 en la lista desplegable de parámetros para iniciar el cálculo de TCID50.
      3. Elige Gráfico de barras para el cálculo de TCID50 en un momento específico o selecciona TCID50 Dependiente del Tiempo para generar el curso temporal de TCID50 durante un periodo deseado durante la inoculación. El TCID50/mL se calculará y mostrará tras hacer clic en el botón de ejecución.

2. Ensayo Crystal Violet-TCID50

  1. Semillar celdas permisivas en una microplaca de 96 pozos a la densidad óptima de siembra descrita en el ensayo TCID50 basado en impedancia (pasos 1-2).
  2. Realizar la preparación por dilución serial del virus e inoculación según lo especificado en el ensayo TCID50 basado en impedancias.
  3. Fijación y tinte
    1. Tras finalizar el ensayo, descarta suavemente el sobrenadante de cada pozo y añade 100 μL de formaldehído al 4% para fijar las células.
    2. Incuba a 4 °C durante 1 hora y luego retira el fijador.
    3. Teñe las células fijas con Crystal Violet al 0,5% preparado en PBS. Incuba a temperatura ambiente durante 30 minutos.
    4. Lava la placa con agua del grifo hasta que se despeje el fondo. Deja que el plato se seque completamente al aire antes de puntuar.
      NOTA: Los residuos violeta cristalino se consideran peligrosos tanto bajo RCRA como bajo el Código de Regulaciones de California (CCR 66261.24). Recoge todas las soluciones cristalinas usadas, materiales contaminados (por ejemplo, papel de cocina, guantes) y enjuaga los residuos en un contenedor designado para residuos peligrosos. Elimina los residuos a través del contratista autorizado de Salud y Seguridad Ambiental (EH&S) de tu institución.
  4. Puntuación y cálculo TCID50
    1. Inspecciona visualmente cada pozo para detectar CPE. Un pozo positivo muestra destrucción parcial o total de una monocapa y tinciones más ligeras. Un pozo negativo conserva una monocapa intacta con manchas púrpura oscuro.
    2. Cuenta el número de pozos positivos y negativos por cada dilución.
    3. Calcula manualmente TCID50/mL usando el método Reed-Muench, basándote en un volumen de inoculación de 150 μL.

Resultados

Monitorización dinámica sin etiquetas, en tiempo real de CPE mediada por virus usando impedancia
Para confirmar que la CPE inducida por virus puede medirse de forma fiable y cuantitativa por impedancia, primero registramos los cambios celulares en HEK293A células tras la infección por Adv-GFP utilizando un sistema RTCA eSight que simultáneamente mide la impedancia y captura imágenes de células vivas de la misma población celular, proporcionando información perspicaz sobre el comportamiento celular. HEK293A células se sembraron en una placa biosensor de 96 pozos a una densidad de siembra de 6.000 células/pozo durante 24 horas y luego se infectaron con Adv-GFP a10,4 UIF/mL. Se registraron imágenes de impedancia y células vivas durante 250 horas tras la inoculación (Figura 2A). Para minimizar la variabilidad por diferencias en la siembra celular y revelar cambios relativos tras el tratamiento, se utilizó el Índice Celular Normalizado (NCI) para representar los cambios colectivos en el crecimiento, la unión y la viabilidad celular a lo largo del tiempo. El NCI se calcula dividiendo el IC en un momento dado por su IC en el momento de normalización (el tiempo antes de la inoculación). La traza cinética NCI del control no infectado (Figura 2A, traza negra) muestra un aumento gradual durante las primeras 48 horas, indicando una proliferación celular continua. A continuación, al final de la prueba se presenta una meseta, lo que indica que las células se habían confluído y cubrían toda la superficie de los biosensores de oro. En cambio, la cinética de los NCI de los pozos infectados por virus descendió por debajo del control 50 horas después de la inoculación y disminuyó progresivamente hasta alcanzar cero a las 100 horas.

La imagen de células vivas obtenida de la misma población celular confirmó visualmente que la señal de impedancia refleja de forma fiable la condición física de las células permisivas a medida que avanzan a lo largo de todo el continuo de la ECP. Como se muestra en la Figura 2A, existe una correlación inversa entre el NCI y la expresión de GFP viral en células HEK293A infectadas observada en las primeras 100 horas antes de la lisis completa de las células permisivas. Además, las imágenes de células vivas (Figura 2B) registradas en los momentos especificados demuestran además un estado celular permisivo durante la infección viral. El crecimiento celular persistió durante las primeras 48 horas tras la infección, mientras que las partículas virales permanecieron en niveles bajos dentro de las células. Sin embargo, a medida que avanzaba la replicación y la infección del virus, comenzó la muerte celular, evidenciada por una reducción de la confluencia y un aumento de la señal de GFP en las células huésped. Aproximadamente 100 horas después de la inoculación, la expresión viral de GFP comenzó a disminuir debido a la pérdida significativa de células permisivas viables. Este enfoque integrado refuerza la fiabilidad de la detección de CPE inducida por virus por impedancia, estableciendo una base sólida para el ensayo TCID50 basado en impedancias.

Cálculo automatizado de TCID50 derivado de la lectura de impedancia
Identificar con precisión los pozos positivos de CPE es crucial para un cálculo fiable de TCID50. Para evaluar si el ensayo TCID50 basado en impedancia puede diferenciar de forma precisa y objetiva entre CPE positiva y negativa con el apoyo del módulo de Virología del software del sistema, las células HEK293A se sembraron a 6.000 células/pozo durante 24 horas antes de la inoculación y tratadas con una serie de diluciones diez veces mayores de Adv-GFP, utilizando ocho réplicas (pozos) para cada dilución. La CPE inducida por Adv se grabó en tiempo real en el sistema RTCA. En la Figura 3A, las trazas cinéticas de impedancia, presentadas como NCI, se registraron y graficaron automáticamente a lo largo del experimento. La disminución del NCI tras la inoculación revela una CPE claramente dependiente de la dosis, demostrada por la fuerte correlación entre la cantidad de virus añadida y la velocidad a la que disminuye la señal de impedancia. Las células expuestas a altas cargas virales, entre 10-3 y 10-7 de dilución, mostraron descensos bruscos y consistentes en el NCI, reflejando una CPE robusta y uniforme en los pozos replicados. En contraste, con una dilución de virus 10-8 , la traza cinética mostró una gran variabilidad desde el inicio, lo que resultó en desviaciones estándar de NCI significativamente mayores, especialmente más allá de las 100 horas tras la inoculación. Cuando la carga viral se redujo aún más por debajo del umbral necesario para causar infección, en este caso, una dilución de 10-10 , el NCI se volvió indistinguible de los controles negativos. Estos datos sugieren que a una dilución de 10-8 , 1) el virus no pudo inducir CPE en todos los pozos repetidos con cinéticas similares; 2) esta dilución sería una línea divisoria entre las concentraciones que causan CPE en todas las repeticiones y aquellas que solo inducen CPE en algunas o ninguna de las replicaciones; Este resultado binario, infectado (indicado por cambios de IC inducidos por CPE) o no infectado (sin cambio de CI), forma la base para calcular TCID50 utilizando métodos estadísticos en el software del sistema. Por lo tanto, la profunda variación en el NCI observada a ciertas concentraciones virales es un indicador clave de la ocurrencia de infección parcial y podría ser crucial para la extrapolación necesaria para calcular el TCID50.

Al igual que en el ensayo clásico TCID50, el umbral para CPE positivo debe definirse antes de que el software incorporado pueda identificar automáticamente los pozos positivos para CPE. Dado que diferentes virus y modelos celulares permisivos pueden requerir umbrales distintos, el software permite a los usuarios configurar y refinar estos criterios dentro del módulo de Virología. Según datos empíricos, se aplicó el umbral predeterminado del software para CPE positiva, definido como el valor NCI del bien tratado con virus más de tres desviaciones estándar por debajo del NCI medio de los controles negativos (no inoculados), es decir, <tratado con virus NCI (NCI-3 X SD)ctrl negativo. Los pozos individuales se puntuaron entonces como positivos (+) o negativos (-) (Figura 3B). En este caso, el TCID50/mL de Adv-GFP se calculó posteriormente usando la fórmula Reed-Muench, una de las fórmulas incluidas en el software. Aparte de seleccionar o definir criterios para la CPE positiva, no se requerían acciones manuales para el cálculo del TCID50, ya que el software automatizaba completamente el proceso.

Seguimiento dinámico de TCID50 durante la infección viral
Para determinar la duración adecuada del ensayo TCID50, se extrajeron los valores de Adv-GFP en los momentos deseados tras la infección, comenzando a las 30 horas y continuando en incrementos de 30 horas hasta 240 horas. Se seleccionó deliberadamente un incremento de 30 horas, ya que se informa que la replicación del adenovirus tarda aproximadamente 30 horasy 10. Los valores de Adv-GFP TCID50 se representaron en función del tiempo (Figura 4). Una observación destacada es el aumento gradual de los valores de TCID50, que continúa hasta aproximadamente 150 horas después de la inoculación. Más allá de este punto, emerge una meseta, indicando un equilibrio donde probablemente los efectos citopáticos han alcanzado su saturación. El aumento dependiente del tiempo, seguido de la estabilización, sugiere una curva típica de replicación viral. La fase inicial se caracteriza por una propagación viral activa, culminando en un pico que refleja el máximo impacto citopático bajo las condiciones experimentales dadas. La fase de meseta del TCID50 puede reflejar un techo biológico en el que el proceso de infección viral ha implicado a la mayoría de las células permisivas, lo que resulta en una muerte celular significativa y la suspensión de la replicación del virus. El curso cinético del TCID50 sugiere que el ensayo puede terminarse seis a siete días después de la inoculación para el modelo de adenovirus-HEK293A, ya que se observó un valor estable de TCID50 de 8,9 × 109 TCID50/mL tan pronto como a las 150 horas.

Cuantificación del título del virus de la gripe A mediante el ensayo TCID50 basado en impedancias
Para investigar si el ensayo TCID50 basado en impedancia puede ampliarse a otros modelos virus-huésped, se realizó un ensayo TCID50 en células MDCK infectadas con IAV. Aunque se adaptaron a pequeñas variaciones en el medio de infección específicas para IAV, el procedimiento de ensayo central se mantuvo consistente con el establecido para adenovirus. La Figura 5A muestra el NCI de las células MDCK a lo largo del tiempo tras la inoculación, con diluciones IAV que van de 1 x 10-2 a 5 x 10-9. De forma similar a los resultados observados en las células HEK293 A infectadas con Adv, los pozos de control no infectados/negativos mostraron un NCI estable y consistente entre réplicas. Sin embargo, los pozos infectados por el virus revelaron un cambio en el NCI dependiente de la dosis. En las dosis bajas, 6,4 y 1,3 x 10-7 diluciones, se observó una desviación estándar elevada. Esto sugiere que en estas diluciones, la concentración del virus se acercaba a TCID50.

Los pozos positivos para CPE se identificaron usando los mismos criterios y umbral aplicados en el modelo Adv-HEK293A, concretamente, una desviación estándar triple por debajo de la media de los pozos control negativos. Los valores TCID50 basados en impedancia para IAV también se determinaron en varios momentos tras la inoculación. La Figura 5B muestra los valores medios de TCID50 de dos experimentos independientes. Excepto en el punto temporal temprano de 60 horas, los valores de TCID50 de 90 a 150 horas tras la infección demostraron buena estabilidad y consistencia, lo que indica que el ensayo TCID50 basado en impedancia para IAV puede completarse de forma fiable en cuatro días en lugar de cinco. Esta consistencia refuerza la robustez del método basado en impedancias, confirmando su adaptabilidad y fiabilidad entre diferentes patógenos virales.

Validación del ensayo TCID50 basado en impedancias usando el método convencional TCID50
Para verificar el TCID50 derivado de impedancia para la medición de concentración IAV, se realizaron ensayos TCID50 utilizando dos enfoques alternativos en paralelo: imagen sin etiqueta y tinción con violeta cristalina. Brevemente, se prepararon y sembraron células MDCK en placas microtituladas de 96 pozos. Al día siguiente, las células fueron inoculadas con una serie de diluciones IAV durante 5 días. Para el ensayo TCID50 basado en imagen, la imagen de células vivas se obtuvo cada 4 horas. Las concentraciones de diez muestras de IAV se evaluaron en el estudio de validación. La confluencia celular de pozos tratados con virus se comparó con la de los pozos negativos y no infectados que utilizan el software del sistema. Sin embargo, el análisis de imágenes para células MDCK fue especialmente complicado, como se ilustra en la Figura 6A. La diferenciación precisa entre celdas y espacios vacíos resultaba complicada debido a la morfología plana y a los bordes mal definidos de las células MDCK, lo que comprometía la identificación fiable de pozos positivos para CPE mediante análisis basados en imágenes. El uso de software de análisis de imágenes más avanzado y sofisticado puede mejorar la precisión de los cálculos TCID50 en talescasos 11. En este caso, la evaluación TCID50 basada en imagen sin etiqueta no tuvo éxito utilizando el software actual del sistema. Para el ensayo de tinción violeta cristalina-TCID50, las células se fijaron y teñieron el día 5 tras la inoculación, tal y como se describe en la sección de protocolo. La Figura 6B demuestra una fuerte correlación lineal entre los valores TCID50 basados en impedancias y basados en la tinción violeta cristalina, con una ecuación de regresión de y = 0,9582x y un R² = 0,9979. Este análisis comparativo subraya la fiabilidad del método basado en impedancias para la medición de títulos virales y su idoneidad para ensayos TCID50.

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Figura 1: Flujo de trabajo de ensayo TCID50 basado en impedancias. Paso 1: Siembra permisiva de células en la placa biosensor. Siembra las células permisivas en una placa con una densidad óptima de siembra. El crecimiento celular se monitoriza entonces en el sistema como parte del procedimiento de control de calidad celular (QC). Paso 2: preparación y inoculación del virus. Prepara stocks de virus diluidos en serie utilizando un factor de dilución definido por el usuario. Retira la placa del sistema y añade los virus a los pozos de la placa en una campana laminar. Paso 3: Medición y puntuación de CPE de pozos CPE-positivos utilizando el software del módulo de Virología. Devuelve la placa al sistema y reanuda el registro en tiempo real de la CPE inducida por el virus. El software identifica automáticamente los pozos positivos para CPE basándose en el umbral definido por el usuario para la detección de CPE. Paso 4: Cálculo del TCID50. Con la puntuación en tiempo real de pozos CPE-positivos frente a la inoculación viral, el software del módulo de virología puede calcular valores TCID50 en cualquier momento durante el ensayo. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 2: La ECP inducida por adenovirus se evaluó utilizando métodos basados tanto en impedancia como en imágenes (A) Perfilado dinámico de la impedancia (eje y izquierdo) y fluorescencia verde (eje y derecho) en células HEK293A a lo largo del tiempo tras la infección con Adv-GFP. El índice celular normalizado para células infectadas por adenovirus (infectadas por ADV con NCI, línea roja), células control negativas (NCI NC, línea negra) e intensidad total integrada de GFP (infectadas por Adv con GFP, línea verde) se representan en función del tiempo. La intensidad total integrada de la GFP refleja la expresión de GFP en células permisivas y sirve como indicador de infección viral. Los números (1-6) a lo largo del Índice Celular Normalizado corresponden a puntos temporales específicos durante el proceso de infección. Los datos se presentan como media ± SD (N = 8). (B) Imágenes secuenciales de HEK293A células antes y después de la infección con Adenovirus-GFP. (1) La imagen de referencia (0 h) es seguida de instantáneas a las 48 h (2), 72 h (3), 96 h (4), 120 h (5) y 200 h (6) después de la infección, ilustrando el cambio en el crecimiento celular, la viabilidad y la fluorescencia del adenovirus-GFP a lo largo del tiempo. Barras de escala = 160 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 3: EPC dependiente de la dosis del adenovirus-GFP en células HEK293A medida por impedancia. (A) HEK293A células se sembraron en una placa biosensor a una densidad de 6.000 células por pozo, y 24 horas después, se infectaron con una serie de adenovirus-GFP diluido 10 veces. Los datos se presentan como media ± SD (N = 8). Inserto: Índice celular normalizado de los pozos infectados con adenovirus-GFP en dilución 10-8 . Se omiten los datos de las diluciones 10-9, 10-11 y 10-12 para mayor claridad. (B) Los pozos/réplicas individuales en cada dilución del virus se puntuaron como CPE-positivo (+) o CPE-negativo (-). Cada columna de la placa se trató con una dilución viral diferente, con un gradiente de dilución que iba desde el más bajo en la columna 1 hasta el más alto en la columna 10. Las columnas 11 y 12 fueron pozos control negativos, sin tratamiento viral. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 4: El curso temporal de los valores de TCID50 derivados de mediciones de impedancia de CPE en células HEK293 tras ser infectadas con adenovirus-GFP. El TCID50/mL de adenovirus-GFP se calculó en los momentos específicos utilizando el módulo de Virología de cinco experimentos. Aunque el módulo de Virología proporciona tres fórmulas de cálculo TCID50, la fórmula Reed-Muench fue seleccionada para el cálculo TCID50. Los datos se presentan como media ± DS (N = 5). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 5: Evaluación del título del virus de la gripe A utilizando el ensayo TCID50 basado en impedancia. (A) EPC dependiente de la dosis de la IAV en células MDCK medida mediante impedancia. Las células MDCK se sembraron en una placa biosensor a 8.000 células/pozo e infectaron 24 horas después con una dilución en serie de cinco veces del virus de la gripe. Los datos se muestran como media ± DS (N = 8). Se omiten los datos de la dilución 2,6 × 10⁻⁸ para mayor claridad. (B) Curso temporal de los valores TCID50 derivados de mediciones de impedancia en células MDCK infectadas con IAV. Se utilizó el método Reed-Muench para el cálculo de TCID50. Los datos se presentan como media ± DE (N = 2). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 6: Correlación entre los ensayos TCID50 basados en impedancia y basados en tinción violeta cristalina. (A) Imagen de células MDCK inoculadas con IAV. Barra de escala = 160 μm. (B) Se realizó una comparación de valores TCID50/mL obtenidos mediante métodos basados en impedancia y teñido basados en violeta cristalino utilizando diez muestras IAV. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 7: Las interfaces representativas del software del módulo de Virología del sistema. El software simplifica el proceso de ensayo TCID50 basado en impedancias. (1) Disposición de la placa para registrar el diseño del experimento; (2) El índice celular o índice celular normalizado se representaba automáticamente y se mostraba por el software durante la inoculación viral; (3) el software proporciona flexibilidad para determinar criterios y elecciones de CPE positivo para la fórmula de cálculo TCID50; (4) El TCID50/mL puede determinarse en cualquier momento durante el ensayo. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Discusión

En este estudio, se demostró la aplicabilidad de la impedancia para la determinación del título viral utilizando modelos adenovirus-HEK293A y virus de la gripe A-MDCK. Otros también han validado la detección robusta y fiable de CPE inducida por virus utilizando sistemas RTCA en una amplia gama de virus, incluyendo ortopoxvirus12, virus del Nilo Occidental (WNV) y virus de la encefalitis de St. Louis (SLEV)13, virus chikungunya14, virus bursalinfeccioso 8, dengue quiméricofiebre amarilla 15, virus de hepatitisA 16, SARS-CoV-217 y virus deldengue 9.

El registro en tiempo real de CPE mediante impedancia permite descubrir caídas específicas del valor de IC dependientes del tiempo del virus en ciertos modelos celulares permisivos para virus. Fang et al. demostraron por primera vez que un parámetro cinético que caracteriza la EPC inducida por flavivirus, CIT50—definido como el tiempo hasta una disminución del 50% en la impedancia celular—es inversamente proporcional a la dosis infecciosa viral dentro de un rango específico. También demostraron que CIT50 es proporcional al recíproco del título de anticuerposneutralizantes 13. Desde entonces, Charretier et al. en Sanofi Pasteur han investigado este método de análisis celular en tiempo real basado en impedancias (RTCA) para determinar los títulos infecciosos virales durante el desarrollo del producto y proceso15 de la vacuna quimérica contra fiebre amarilla y dengue (CYD). Charretier et al.15 validaron además esta dosis infecciosa de cultivo celular basada en impedancia del 50% (CCID50) con un ensayo CCID50 basado en inmunotinción. Demostraron que el método RTCA basado en impedancias es aproximadamente 5 veces menos laborioso y 3,5 veces más rentable que el ensayo estándar CCID50 en un entorno industrial. En nuestro estudio, se demostró la validación del TCID50 basado en impedancia frente al ensayo tradicional Crystal Violet TCID50 para el CPE inducido por IAV. Además, se utilizó el módulo de software de Virología en el software RTCA. Los pozos positivos para CPE se identificaban automáticamente en función de criterios definidos por el usuario para los pozos positivos en CPE en el software; en nuestro caso, el grado de IC disminuye en comparación con los controles negativos. El TCID50 fue calculado por el software en consecuencia, permitiendo una determinación precisa del título sin depender del CIT50 ni arriesgarse a que la muestra de prueba salga del rango óptimo. Establecer un umbral adecuado para pozos positivos en CPE es crucial, ya que afecta directamente a la sensibilidad y especificidad del ensayo. Se recomienda que los usuarios determinen criterios específicos del virus comparando los cambios en el Índice Celular con los resultados de su método convencional validado. Estos umbrales empíricamente derivados pueden configurarse y refinarse dentro del módulo de Virología del software.

Como en otros ensayos basados en celdas, el estado de las celdas permisivas utilizadas en ensayos TCID50 basados en impedancia es fundamental para determinar el éxito de la prueba y la calidad de los resultados. Para asegurar una alta proliferación celular y viabilidad, se recomienda células frescas y de bajo paso. Además, crear un banco de celdas permisivas en el mismo pasaje puede mejorar la reproducibilidad entre experimentos. Como se indica en la Figura 3A, cuando las células permisivas estaban en condiciones óptimas, generaban señales de impedancia estables y consistentes en los controles no infectados durante todo el ensayo. Proporcionó una referencia base fiable para establecer un umbral para los pozos positivos en CPE, lo que resultó en una determinación precisa del título viral. Además, el ensayo TCID50 basado en impedancias es especialmente capaz de realizar control de calidad en células permisivas antes de la evaluación del título viral. El perfil característico de CI cinético de las células permisivas sanas sirve como una métrica fiable de control de calidad, asegurando que solo se utilicen poblaciones celulares viables y consistentes para la cuantificación viral, mejorando así la reproducibilidad y precisión del ensayo.

Para cada nuevo virus, también se debe realizar la optimización y validación del ensayo de impedancia TCID50 antes de la implementación. Factores clave, como las condiciones del cultivo celular, incluyendo el medio basal y la concentración de FBS, son fundamentales para lograr datos reproducibles de impedancia celular y mejorar la sensibilidad de la detección de CPE, como han destacado estudiosprevios 6,16. En este sentido, la tecnología basada en impedancias en tiempo real y sin etiquetas ha demostrado ser una herramienta sencilla, eficiente y valiosa para optimizar las condiciones de cultivo celular durante el desarrollo delensayo 16.

Una limitación del ensayo de impedancia-TCID50 surge con virus que no causan CPE, ya que el ensayo depende de CPE para generar cambios en la lectura de impedancias, que forma la base para el cálculo de TCID50. En tales casos, puede ser necesario identificar un modelo celular permisivo alternativo que pueda exhibir EPC inducida por el virus o adoptar un enfoque de inmunotinción, siempre que se disponga de un anticuerpo adecuado contra el antígeno viral específico. No obstante, este estudio demostró la capacidad del sistema MP RTCA para capturar CPE dependiente de la dosis y distinguir eficazmente entre poblaciones celulares infectadas y no infectadas mediante una lectura objetiva y sensible de impedancias.

La introducción del análisis dependiente del tiempo TCID50 representa un avance significativo respecto a las mediciones tradicionales de puntos finales. Simplifica el proceso de optimización del ensayo TCID50, ya que el momento óptimo para calcular e informar el título viral puede obtenerse fácilmente a partir de un único ensayo en tiempo real. Aunque los ensayos TCID50 sin etiqueta basados en imagen también pueden proporcionar valores TCID50 resueltos en el tiempo, su aplicabilidad está limitada a modelos de célula viral que presentan CPE reconocible por los algoritmos de software de imagen, como se demuestra en el modelo IAV-MDCK (Figura 6A). Además, utilizar impedancia sin etiqueta para la detección de CPE elimina las complicaciones de usar diversos reactivos y flujos de trabajo en varios pasos que potencialmente aumentan los riesgos asociados a errores humanos. Además de simplificar el flujo de trabajo, el módulo de Virología del software del sistema también agiliza el ensayo. Primero, comienza con una configuración sencilla de calendario de experimentos para grabación automática controlada por el sistema. A continuación, se realiza una puntuación espontánea en tiempo real de CPE positiva tras cada medición y concluye con el cálculo automatizado de TCID50 para una cuantificación sencilla de partículas de virus infecciosos (Figura 7). Esta automatización reduce significativamente el tiempo de interactuación, una mejora crucial, especialmente al tratar virus altamente infecciosos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,05% Tripsina 0,53 mM EDTA  (1x)Corning25-052-CI
12 reservorios de reactivos del canalVistaLab Technologies3054-1011
Adenovirus-GFPVector Biolabs 1060
Medio DMEMATCC30-2002
E-Plate VIEW 96Agilent300601020
Suero fetal bovinoAvantor97068-085
Celda Hek293AThermo Fisher Scientific y nbsp;  R70507
Solución de penicilina-estreptomicinaHyCloneSV30010
Suero tampón de fosfato (1x)HyCloneSH30256.01
Agasosa de la placa marinaLonza50101
xCELLigence sistema RTCA eSightAgilentS2833AA
xCELLigence sistema MP RTCAAgilent380601040

Referencias

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