Este protocolo describe un modelo efectivo de funcionamiento voluntario de la rueda que se puede implementar en varios contextos de investigación. A diferencia de otros modelos de carrera voluntaria, este método evita el alojamiento de aislamiento mientras realiza un seguimiento de las métricas de carrera en ratones individuales.
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Artículo de método
Seguimiento de métricas individuales de carrera en ratones mediante un protocolo voluntario de carrera de ruedas que minimiza el aislamiento social
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Resumen
Resumen
La carrera voluntaria de ruedas (VWR) en roedores se utiliza para evaluar el rendimiento y la resistencia y para simular el ejercicio. A diferencia de otros paradigmas de ejercicio que requieren estímulos aversivos para inducir el movimiento activo, correr con ruedas es voluntario. VWR generalmente consiste en colocar una rueda para correr dentro de la jaula de inicio del ratón. Sin embargo, el análisis de los parámetros del ejercicio generalmente solo se puede realizar cuando los ratones están alojados individualmente, mientras que los efectos generales de la jaula se pueden informar cuando los ratones están alojados en grupos. Por lo tanto, los modelos actuales obligan a los experimentadores a elegir entre medir los parámetros individuales del ejercicio en ratones de una sola casa o medir los efectos de grupo en ratones de casa en grupo; Dependiendo de la pregunta de investigación y el modelo, esto podría ser limitante.
Por lo tanto, el objetivo de este método es demostrar un protocolo que evalúa VWR en un modelo de ratón mediante la cuantificación de los parámetros de ejecución en ratones individuales, con un aislamiento mínimo. Informamos sobre el diseño del dispositivo, los preparativos preoperatorios y la configuración del experimento. Los resultados de un protocolo de entrenamiento de 6 semanas utilizando este modelo VWR sugieren que proporciona suficiente estímulo para aumentar la memoria de reconocimiento de objetos espaciales, comparable al efecto clínico del ejercicio. Este modelo sencillo y económico facilita la investigación del efecto de VWR en múltiples mediciones de la actividad de las ruedas, minimizando los factores que podrían limitar o afectar a los resultados experimentales.
Introducción
El ejercicio tiene un impacto beneficioso en la salud fisiológica y psicológica y puede mejorar la fisiopatología de numerosas enfermedades1. La actividad física es fundamental para la salud, y la Organización Mundial de la Salud (OMS) informó en 2020 que aumentar la actividad física reduce el riesgo de numerosas enfermedades, incluidos los trastornos psicológicos2. Además de la prevención de enfermedades, el ejercicio puede mejorar la función cerebral al estimular el flujo sanguíneo3, induciendo la neurogénesis, particularmente en el hipocampo4, una región clave del cerebro para el aprendizaje y la memoria, la regulación hormonal5, y la plasticidad sináptica a través del aumento de los niveles de factores neurotróficos derivados del cerebro6. A través de estos mecanismos, el ejercicio puede mejorar la función cognitiva y la memoria7,8,9. Los mecanismos neurobiológicos adicionales promovidos por el ejercicio apoyan la salud mental, incluida la liberación de endorfinas10, la reducción de cortisol11, la mejora de la calidad del sueño12 y la inhibición de la neuroinflamación13. Anteriormente hemos
demostró que el ejercicio voluntario puede promover la resiliencia al estrés crónico y al comportamiento similar a la ansiedad en ratones machos y hembras14. La evidencia de que la actividad física mejora los resultados en la enfermedad, combinada con la promoción de la salud mental, destaca la necesidad de estrategias para fomentar la actividad física, incluido el aumento de nuestra comprensión del potencial preventivo y terapéutico del ejercicio.
Un método para estudiar los efectos del ejercicio en la función biológica es utilizar modelos de ejercicio en roedores. Estos modelos son eficaces para aumentar el gasto cardíaco e inducir la producción de lactato a varios niveles dependiendo de la intensidad y la frecuencia del ejercicio. Los modelos comunes utilizados para estudiar el efecto terapéutico del ejercicio incluyen la natación, el entrenamiento en cinta de correr y el entrenamiento en intervalos de alta intensidad15. Un inconveniente de algunos modelos, sin embargo, es el ejercicio involuntario o forzado, que podría ser una experiencia estresante. Por ejemplo, cuando se somete a ratones a correr en cinta en un modelo de lesión por isquemia cerebral, se ha informado de un comportamiento similar a la ansiedad en la prueba de campo abierto, un aumento de los niveles de corticosterona, daño neuronal o aumento de los niveles de citoquinas16. Alternativamente, los modelos de ejercicio voluntario, incluido VWR, pueden evitar la experiencia potencialmente estresante, permitiendo que los roedores corran libremente, sin necesidad de acondicionamiento o refuerzo17. Por lo general, VWR se realiza proporcionando acceso continuo a una rueda de rodadura en una jaula que alberga 4-5 ratones o jaulas de ratones de una sola casa. Por lo tanto, VWR proporciona condiciones no estresantes, ya que no requiere un estímulo negativo ni una intervención directa del experimentador y puede proporcionar un mecanismo de afrontamiento o una experiencia de enriquecimiento18,19,20.
El objetivo de este método es proponer un protocolo VWR sencillo y económico que permita el seguimiento de las métricas de ejecución individuales con un aislamiento mínimo. Los ratones se alojan en grupos para evitar el aislamiento social prolongado, y los parámetros de carrera se registran para ratones individuales aislando a los ratones en una pista de atletismo durante solo 2 horas al día. Se proporcionan detalles para un modelo VWR de 6 semanas en el que 10 ratones C57BL/6 tuvieron acceso a ruedas de rodadura durante 2 h/día, mientras que 10 ratones C57BL/6 tuvieron acceso a ruedas bloqueadas. Los resultados confirmaron que este protocolo de VWR fue capaz de realizar un seguimiento de los parámetros individuales de carrera con un aislamiento mínimo y mediar los efectos beneficiosos del ejercicio en la memoria espacial inducida por el hipocampo en la prueba de reconocimiento de objetos espaciales (SORT).
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Protocolo
Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Rowan. Los ratones macho pesaban entre 20 g y 27 g y tenían entre 8 y 10 semanas de edad al inicio del estudio. Los ratones se mantuvieron en grupos de 4, en un ambiente controlado (ciclo luz/oscuridad de 12:12 h) con acceso ad libitum a alimento y agua.
1. Configuración de las ruedas
- En la circunferencia media exterior de cada rueda, pegue un imán. Este imán será detectado por el sensor del velocímetro para monitorear la VWR (Figura 1A).
- En el lado opuesto de la rueda, pegue un objeto de peso similar al del imán (una moneda) para contrarrestar y evitar rotaciones no deseadas debidas al peso del imán.
- Construya una plataforma para el velocímetro y la rueda. Utilizando una plancha blanca de espuma, corte una pieza con forma complementaria a la base de la rueda y adhiérala con cinta adhesiva a la base (Figura 1B).
- Después de insertar un juego nuevo de baterías en el velocímetro, configure el tamaño de la rueda durante la programación inicial midiendo la circunferencia exterior de la rueda.
- Adhiera el sensor del velocímetro a la plataforma. Asegúrese de que el sensor del velocímetro esté colocado paralelo al imán de la rueda para permitir una correcta grabación del movimiento (Figura 1C). Cada vez que el imán pase frente al sensor, se contará como una revolución.
- Envuelva el sensor y el cable con cinta adhesiva resistente para evitar que los ratones muerdan el cableado (Figura 1D).
Figura 1: Configuración del aparato de la rueda giratoria. (A) Un imán y una moneda pegados (flecha roja) en lados opuestos del borde exterior de la rueda. (B) Una plataforma hecha de cartón de espuma (flecha roja) utilizada como soporte para el sensor del velocímetro. (C) Sensor del velocímetro sobre la plataforma (flecha roja); (D) Sensor fijado con cinta (flecha roja) y configuración finalizada de la rueda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
2. Configuración del aparato
- Utilice el aparato conductual y divida la caja de 40 cm x 40 cm x 35 cm (h) en cuatro cuadrantes para probar individualmente a cuatro ratones al mismo tiempo.
- Corte dos piezas de cartón de espuma blanca según las siguientes dimensiones: L 30 cm, A 40 cm (Figura 2A).
- En el centro del lado de 40 cm de ancho del cartón de espuma, haga un corte de 20 cm para permitir la intersección de dos cartones de espuma.
- Cubra el cartón de espuma con papel adhesivo impermeable para facilitar la limpieza entre grupos.
- Divida la caja de 40 cm x 40 cm x 35 cm (h) en cuatro cuadrantes (20 cm x 20 cm x 30 cm (h)) utilizando dos cartones de espuma que se crucen (Figura 2B).
- Coloque una rueda preparada (verifique la configuración de la rueda anterior) en la esquina de cada cuadrante y sujete el cable a la pared. Fije los velocímetros al costado del aparato transparente de plexiglás (Figura 2C).
Figura 2: Configuración del aparato. (A) Tablero de espuma cortado y sujetado con cinta adhesiva; (B) Aparato de plexiglás dividido en cuatro cuadrantes; (C) una rueda colocada en la esquina de un cuadrante con el cable del velocímetro fijado con cinta en la pared. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
3. VWR
NOTA: Además de las métricas del velocímetro, utilizamos un software de seguimiento conductual, el sistema de seguimiento conductual ANY-maze, para proporcionar información adicional sobre el seguimiento conductual.
- Realice las sesiones de RLV diariamente, durante la fase clara a la misma hora cada día (de 9:00 a 11:00). Coloque los ratones sin ejercicio en áreas idénticas durante 2 h, pero con las ruedas bloqueadas. Bloquee las ruedas utilizando pegamento caliente para inmovilizar el centro de rotación y desactivar el giro.
- Coloque los ratones en la sala de RLV para que se habitúen durante 30-60 min.
- Reinicie todos los velocímetros.
- Coloque a cada ratón en la esquina del cuadrante donde pueda correr libremente durante 2 h.
- Después de 2 h, devuelva los ratones a su jaula de alojamiento y registre los datos de los velocímetros.
- Limpie las áreas y las ruedas con etanol al 70 % entre ambos grupos.
4. CLASIFICACIÓN
NOTA: Al final de 5 semanas de VWR, se realizó SORT para evaluar si el ejercicio mejoró la función del hipocampo según el protocolo publicado21.
- Realice las sesiones de habituación y la prueba SORT durante la fase de luz en una habitación con iluminación ambiente. Lleve a cabo las sesiones de habituación un día antes de la prueba SORT, durante las cuales traslade los ratones a jaulas individuales y llévelos a la sala de pruebas para un período de aclimatación de al menos 30 minutos.
- Asigne una de las esquinas del área como la "esquina de liberación" y asegúrese de que cada ratón se coloque mirando hacia dicha esquina para explorar libremente el área durante 6 minutos. Devuelva los ratones a sus jaulas individuales y limpie el área con etanol al 70 %.
- Repita el paso 4.1.1 dos veces, de modo que cada ratón realice tres sesiones de habituación. Una vez finalizadas las sesiones de habituación, devuelva todos los ratones a sus jaulas de origen.
- Después de 24 horas, regrese los ratones a la sala de pruebas y permítales habituarse durante 30-60 minutos en jaulas individuales antes de comenzar la prueba.
- Fije dos objetos diferentes en el área de manera contrabalanceada, a 6 x 6 cm de distancia de dos esquinas que no sean la de liberación.
- Coloque a cada ratón mirando hacia la esquina de liberación para que explore libremente los objetos durante 10 minutos. Devuelva a los ratones a sus jaulas individuales durante 20 minutos y limpie los objetos y el área con etanol al 70 %.
- Mueva uno de los dos objetos y fíjelo a 6 x 6 cm de distancia de una nueva esquina que no sea la de liberación, sin modificar la posición del otro objeto.
- Coloque a cada ratón mirando hacia la esquina de liberación para que explore libremente los objetos durante 10 minutos antes de regresarlo a su jaula de origen. Registre esta prueba mediante un software automatizado para medir el tiempo de exploración por objeto y calcule el porcentaje de tiempo de exploración de la siguiente manera:
% tiempo de exploración =
5. Análisis estadístico
- Expresar todos los datos como media ± EE.
- Realice análisis estadísticos utilizando software de análisis estadístico con una significancia establecida en p ≤ 0,05. Analice los resultados de SORT utilizando la prueba t de Student T-prueba.
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Resultados
En este estudio, 20 ratones machos C57BL/6 fueron asignados aleatoriamente a uno de los dos grupos: sin ejercicio (NO-EX) o ejercicio (VWR) durante 6 semanas. Los parámetros individuales de carrera se registraron diariamente en velocímetros y se representaron a continuación ± EE (Figura 3A-C). A lo largo de las 6 semanas, los ratones mostraron mayor actividad en la semana 2, durante la cual pasaron en promedio 2.135,87 ± 351,14 s en la rueda, recorriendo una distancia de 1,1...
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Discusión
Los investigadores utilizan varios paradigmas de ejercicio para evaluar la actividad física y sus efectos en roedores, incluidos los paradigmas de carrera voluntaria y forzada. En comparación con los paradigmas de ejercicio forzado, VWR permite que los ratones corran libremente a una intensidad más baja, lo que minimiza las condiciones estresantes22. Actualmente, los investigadores pueden recopilar parámetros de ejercicio de ratones individuales alojándolos en un solo lugar 23,24,25,26,27,28,29,30...
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Sistema de prueba de 5 comportamientos ANY-box | Stoelting | 65000 https://stoeltingco.com/Neuroscience/ANY-box-Multi-Configuration-Behavior-Apparatus~9838 | |
| Ciclocomputador Velocímetro y odómetros cableados para bicicletas | IPSXP | N/A | Cualquier velocímetro con cable que medurezca la distsencia, el tiempo, la velocidad podría funcionar |
| Forro protector adhesivo transparente | Marca Con-Tact N | /A | https://con-tactbrand.com/products/clear-cover%E2%84%A2-clear-matte?_pos=1&_fid=be2dc000c&_ss=c |
| Prisma GraphPad | |||
| Adhesivo instantáneo 496 Super Bonder | Loctite | S-24546 | https://www.uline.com/Product/Detail/S-24546/Adhesives-Glue-Epoxy/Loctite-Instant-Adhesive-496-Super-Bonder?pricode=WB0948&gadtype=pla&id= S-24546& gad_source=1& gclid=Cjw KCAjw68K4BhAuEiwAylp3klS0FN ur-l_xKkue1NUmruDDV48QO5b2tVH W9Bc08s9eZKmedj-yxBoCgIEQAvD_BwE |
| Pro Mag Imán de neodimio | Imanes aplicados | ND018-6 | Si elige otros imanes, asegúrese de que sean lo suficientemente fuertes como para ser detectados por el censor |
| Ruedas de ejercicio para animales pequeños Silent Spinner (mini 11.4 cm) | Kaytee | SKU# 100079369 https://www.kaytee.com/all-products/ | Ruedas para animales pequeños/Ruedas giratorias silenciosas |
| Tableros de espuma blancos | Pacon | 5553 | https://pacon.com/foam-board-350/pacon-foam-board-20-x-30-white-10pkg-2.html |
Referencias
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