Este artículo presenta métodos para la manipulación optogenética en Drosophila melanogaster, utilizando CsChrimson y GtACR2 para activar y silenciar neuronas específicas. Se describen cuatro experimentos que utilizan la optogenética para explorar los comportamientos termotácticos y gustativos, proporcionando información sobre los mecanismos neuronales subyacentes que gobiernan estos procesos.
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Artículo de método
Ensayos conductuales para la manipulación optogenética de circuitos neuronales en Drosophila melanogaster
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En este artículo
Resumen
Resumen
La optogenética se ha convertido en una técnica fundamental en neurociencia, ya que permite un control preciso de la actividad neuronal a través de la estimulación lumínica. Este estudio presenta configuraciones fáciles de implementar para aplicar métodos optogenéticos en Drosophila melanogaster. Dos herramientas optogenéticas, CsChrimson, un canal catiónico activado por luz roja, y GtACR2, un canal aniónico activado por luz azul, se emplearon en cuatro enfoques experimentales. Tres de estos enfoques involucran experimentos con una sola mosca: (1) un ensayo de preferencia posicional termotáctica optogenética de luz azul dirigido a células de calentamiento sensibles a la temperatura, (2) un ensayo de preferencia posicional optogenética de luz roja que activa las neuronas de detección amarga y (3) un ensayo de respuesta de extensión de probóscide que activa las neuronas de detección dulce. El cuarto enfoque (4) es una configuración de laberinto de moscas para evaluar las conductas de evitación utilizando múltiples moscas. La capacidad de manipular la actividad neuronal temporal y espacialmente ofrece información valiosa sobre el procesamiento sensorial y la toma de decisiones, lo que subraya el potencial de la optogenética para avanzar en nuestro conocimiento de la función neuronal. Estos métodos proporcionan un marco accesible y sólido para futuras investigaciones en neurociencia con el fin de mejorar la comprensión de vías neuronales específicas y sus resultados conductuales.
Introducción
La optogenética se ha convertido en una poderosa técnica que combina la óptica y la genética en neurociencia, proporcionando un control preciso y no invasivo sobre la actividad neuronal a través de la estimulaciónlumínica. En Drosophila melanogaster, un organismo modelo ampliamente utilizado, las herramientas optogenéticas permiten la activación e inhibición de neuronas específicas, lo que permite a los investigadores modular los circuitos neuronales. Entre las herramientas utilizadas, CsChrimson y GtACR (rodopsinas del canal aniónico Guillardia theta) proporcionan enfoques complementarios par....
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Protocolo
1. Cepas, cría de moscas y aspirador de moscas
- Deformaciones y mantenimiento
- Las cepas utilizadas en los experimentos incluyen HC-Gal410, Gr5a-Gal420 (Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC): 57592), Gr66a-Gal421 (BDSC: 57670), UAS-GtACR23, UAS-CsChrimson2 (BDSC: 55136). La parte trasera vuela a 25 °C en un medio de harina de maíz estándar bajo un ciclo de luz de 12 h: 12 h de oscuridad.
NOTA: 1 L de medio de harina de maíz contiene 1 L dH2O,....
- Las cepas utilizadas en los experimentos incluyen HC-Gal410, Gr5a-Gal420 (Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC): 57592), Gr66a-Gal421 (BDSC: 57670), UAS-GtACR23, UAS-CsChrimson2 (BDSC: 55136). La parte trasera vuela a 25 °C en un medio de harina de maíz estándar bajo un ciclo de luz de 12 h: 12 h de oscuridad.
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Resultados
Ensayo de preferencia posicional termotáctica optogenética de luz azul de una sola mosca
Se probaron cuatro condiciones: luz ambiental sin suplementación de ATR (luz de la habitación, ATR -), luz de la habitación con suplementación de ATR (luz de la habitación, ATR +), luz azul sin suplementación de ATR (azul, ATR -) y luz azul con suplementación de ATR (azul, ATR +). Las tres primeras condiciones sirvieron como controles. En los experimentos de control, las moscas evitaron el lado de 31 °C. En luz az.......
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Discusión
La manipulación optogenética ha transformado el campo de la neurociencia al permitir un control preciso de los circuitos neuronales con exactitud espacio-temporal27. Un circuito neuronal incluye poblaciones de neuronas interconectadas por sinapsis, que realizan funciones específicas tras la activación. Se ha completado el conectoma del cerebro completo de Drosophila, que ofrece una visión completa de las vías sinápticas dentro del cerebro de Drosophil.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no existen conflictos de intereses con respecto a la publicación de este artículo. Todos los autores han revelado cualquier conflicto potencial y afirman que no tienen relaciones financieras o personales que puedan influir en el trabajo presentado en este estudio.
Agradecimientos
Los diagramas esquemáticos de todas las figuras se crearon con Biorender.com. Este trabajo fue apoyado por NIH R01GM140130 (https://www.nigms.nih.gov/) a L.N. Los financiadores no participaron en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicación ni la preparación del manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Controlador LED de 1000 mA | Luxeon Star | 3021-D-E-1000 | |
| 5 mL Tubos de cultivo VWR, plástico, con tapones de doble posición | VWR | 60818-664 | |
| 780 Filtro de paso largo / IR 780 nm 100 mm x 100 mm | Filtros Lee | BH #LE8744 | Cortado a aproximadamente 47 x 100 se ajusta a la cubierta de plástico |
| Agfabric 6.5 pies x 15 pies Red de insectos Red de jardín para proteger plantas Verduras Flores Frutas | The Home Depot | EIBNW6515 | |
| de aluminio Sigma-Aldrich | 116-31-4 | retiniana | |
| (30,5 cm x 30,5 cm x 0,6 cm) | Amazon | comprado en Amazon | |
| Caja de plástico negra | LI-COR | 929-97101 | |
| CLORURO DE CALCIO ANHYDRO 25GR | Thermo Fisher Scientific | ||
| CX405 Handycam con sensor CMOS Exmor R | SONY | HDR-CX405 | |
| Elmer' s “ pegamento escolar" | Elmer | ||
| Alcohol etílico, puro (200 grados) | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Fisherbrand Isotemp Agitador de placa caliente | Fisher Scientific | SP88850200 | |
| Línea de mosca: Gr5a-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 57592 | |
| Línea de mosca: Gr66a-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 57670 | |
| Línea de mosca: HC-Gal4 (II) | Dr. Marco Gallio Lab | Un amable regalo | |
| Línea de moscas: UAS-CsChrimson | Bloomington Drosophila Stock Center | 55136 | |
| Línea de mosca: UAS-GtACR2/TM6B | Dr. Quentin Gaudry Lab | Un amable regalo | |
| Flystuff 62-101 Harina de maíz amarilla (11,3 kg), amarilla, 11,3 kg/unidad | Genesee Scientific | 62-101 | |
| Flystuff 62-107 Levadura Seca Inactiva, 10 Kg, Copo Nutricional, 10 Kg/Unidad | Genesee Scientific | 62-107 | |
| Flystuff 66-103 Nutri-Fly Drosophila Agar, Gelidium, 100 Malla, 5 Kg (11.02 lbs)/Unidad | Genesee Scientific | 66-103 | |
| FreeMascot OD 8+ 190 nm– 420 nm / 600 nm– Gafas de seguridad láser violeta/rojo/infrarrojo de longitud de onda de 1100 nm | Mascota Libre | B08LGMQ65S | comprado en Amazon |
| GoPro Hero8 Black | GoPro | 6365359 | |
| filtros LEE 100 veces; 100 mm Infra Red #87 Filtro Infrarrojo de Poliéster B | & H Photo | LE8744 | |
| Filtro de paso largo, vidrio coloreado, 50,8 x 50,8 mm, corte de 830 nm, RG830 | Newport | FSQ-RG830 | |
| 4-hidroxibenzoato de metilo, 99%, Thermo Scientific Chemicals | Thermo Fisher Scientific | ||
| MicroWell Mini Tray 60 Pocillos, Perfil Bajo NS PS | Thermal Scientific | NUNC 439225 | Las tapas se utilizan como "cubierta de plástico" |
| Olympus Plastics 24-160RS, 1000 µ L Olympus Puntas de pipeta ergonómicas de baja fijación, con bastidores, estériles, 8 gradillas de 96 puntas/unidad | Eppendorf | 24-160RS | |
| Parafilm M Película de sellado | Heathrow Scientific | HS234526B | 4 pulgadas x 125 pies |
| Cloruro de potasio, ACS, 99.0-100.5%, | Thermo Fisher Scientific | ||
| Prism | , GraphPad, | versión 9 | software de análisis de datos |
| Samco Graduate Transfer Pipettes | Thermo Fisher Scientific | 225 | |
| portaobjetos de | Fisher Scientific | 12-544-2 | Microscopio estereoscópico de 5 mm x 75 mm x 1,0 mm |
| Caja de espuma de poliestireno OLYMPUS CZ61 (27 cm de altura y veces; 22 cm de ancho y veces; 16 cm de longitud) | |||
| Sacarosa | Fisher Scientific | 225911 Sonda | |
| temperatura de superficie | Jeringa Fluke | 80PK-3A | |
| BD Integra | 305270 | ||
| Tate & Lyle 457 Dextrosa, Tate & Lyle, Pow, Tate & Lyle 457 Dextrosa, Tate & Lyle, Polvo, 50 lbs/Unidad | Genesee Scientific | 62-113 | |
| Termómetro de termopar de dígito grande calibrado trazable | por cple-parmer | UX-91210-07 | Termómetro BigDigit Tipo K Trazable de Fisherbrand |
| LED Triple | estriborSupply | 07007-PB000-D | 470 nm |
| Triple LED rojo de estribor | LEDSupply | 07007-PD000-F | 627 nm |
| Tygon PVC Clear Tubing 1/4" ID, 3/8" OD, 5 pies de longitud | Compañía de suministros McMaster Carr | 6516T21 | |
| Iluminador IR Univivi, 850nm 12 LEDs Iluminador IR de gran angular para visión nocturna | Univivi | 4331910725 | |
| Wakefield Thermal 25.4 mm Disipador de calor redondo Star LED Board - 882-100AB | Wakefield-Vette | 882-100AB | |
| Presentador inalámbrico | DinoFire Store B01410YNAM | comprado en Amazon |
Referencias
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Mauss, A. S., Busch, C., Borst....
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Reimpresiones y permisos
