Artículo de método

Un modelo de vejiga in vitro de infección del tracto urinario asociada a catéter

DOI:

10.3791/67966

⸱

24 de junio de 2025

 ,  , 
1The Department of Clinical Infection, Microbiology and Immunology, The University of Liverpool, 2Department of Life Sciences, The University of Bath

En este artículo

Resumen

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Este protocolo detalla un modelo in vitro del tracto urinario cateterizado, que se puede utilizar para estudiar las poblaciones de células bacterianas asociadas tanto al plancton como al biofilm en infecciones del tracto urinario asociadas al catéter simuladas. Este modelo se puede utilizar aún más para estudiar la eficacia de los productos antimicrobianos destinados a controlar las infecciones del tracto urinario.

Resumen

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Las infecciones del tracto urinario asociadas a catéteres (CAUTI, por sus siglas en inglés) se encuentran entre las infecciones más comunes asociadas a la atención médica. La formación de biopelículas en los catéteres urinarios es un aspecto clave en la patogénesis de estas infecciones, y con frecuencia conduce a la obstrucción de los catéteres y a complicaciones graves como pielonefritis y septicemia. Los enfoques para modelar y estudiar la formación de biopelículas en este entorno son esenciales tanto para una comprensión fundamental de los mecanismos que sustentan la patogénesis de CAUTI, como para el desarrollo y la evaluación preclínica sólida de estrategias terapéuticas efectivas para controlar CAUTI y la obstrucción del catéter. Este protocolo describe un modelo in vitro del tracto urinario cateterizado, que replica el sistema de drenaje cerrado con catéter tal como se utiliza en la práctica clínica, facilitando el estudio de la formación de CAUTI y biofilm del catéter en condiciones representativas. Además, este protocolo detalla la aplicación del modelo de vejiga in vitro para evaluar la eficacia de los productos de mantenimiento de catéteres antimicrobianos, incluidos los productos actualmente disponibles en la cadena de suministro del NHS.

Introducción

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Los catéteres urinarios se encuentran entre los dispositivos médicos más utilizados, con una prevalencia estimada del 19% en los centros de cuidados intensivos 1,2,3. Los catéteres se utilizan principalmente para ayudar en el manejo de la producción de orina en casos de disfunción de la vejiga, y se insertan directamente en la vejiga, lo que permite que la orina se vacíe de la vejiga a través de un lumen central 2,3. Los catéteres urinarios pueden utilizarse de forma intermitente, en la que se insertan en la vejiga periódicamente para drenar la orina, o se pueden utilizar catéteres permanentes, en los que los catéteres se dejan in situ en la vejiga para drenar la orina de forma continua 3,4. A pesar de su uso generalizado, los catéteres urinarios son el mayor factor de riesgo para el desarrollo de infecciones del tracto urinario (ITU), que representan aproximadamente una quinta parte de las infecciones asociadas a la asistencia sanitaria 5,6. De hecho, el propio catéter a menudo actúa como el sitio inicial de la colonización microbiana, proporcionando una superficie para que los uropatógenos se adhieran y colonicen aún más el tracto urinario 1,6,7,8. Prácticamente todos los pacientes sometidos a un cateterismo continuo a largo plazo (en el que el catéter se deja colocado durante ≥28 días) experimentarán bacteriuria, con un riesgo que aumenta en ~5% por cada día que el catéter está in situ 2,9,10,11. En consecuencia, alrededor del 80% de las infecciones urinarias se asocian con el uso de un catéter urinario6.

Las infecciones del tracto urinario asociadas a catéteres (IAC) representan una carga significativa para los servicios de salud, y a menudo se asocian con síntomas más graves de ITU superior (como ureteritis y pielonefritis) que las ITU no complicadas, así como un mayor riesgo de infecciones secundarias del torrente sanguíneo 1,7,12,13,14 . Los tratamientos estándar para las CAUTI incluyen la terapia con antibióticos, sin embargo, estas infecciones a menudo son recalcitrantes al tratamiento antimicrobiano como resultado del desarrollo de comunidades complejas de biopelículas en la superficie del catéter 15,16,17,18,19,20. De hecho, se estima que ~80% de los CAUTIs son el resultado de patógenos del tracto urinario formadores de biopelículas19. La formación de biopelículas se caracteriza por la unión de células bacterianas a las superficies de los catéteres y el desarrollo de comunidades incrustadas en una extensa matriz de sustancias poliméricas extracelulares (EPS)21,22,23,24. La producción de EPS es una característica definitoria de las comunidades de biopelículas y es responsable de muchas de las propiedades emergentes que muestran las células asociadas a las biopelículas, como la elevada resistencia a los agentes antimicrobianos y el aclaramiento inmunológico 21,22,24. El EPS puede desempeñar un papel directo en estos fenotipos al blindar físicamente las células y protegerlas de los antimicrobianos o efectores inmunes, así como indirectamente al facilitar el desarrollo de aspectos más amplios de las comunidades de biopelículas, como el microambiente fisicoquímico de la biopelícula y la formación de células persistentes 23,24,25,26. Además, algunos uropatógenos, incluido Proteus spp., que representan ~ 11% de los CAUTI, poseen potentes enzimas ureasa, lo que les permite hidrolizar la urea presente en la orina y resulta en un aumento general del pH urinario 2,27,28,29,30. Este aumento del pH va acompañado de la precipitación de cristales de fosfato de calcio y magnesio, que pueden incorporarse a la biopelícula en crecimiento, lo que da lugar a la biomineralización y a la formación de densas estructuras cristalinas de biopelícula que pueden bloquear los catéteres. Estos biofilms cristalinos no solo dificultan el tratamiento, sino que también pueden iniciar complicaciones graves como pielonefritis y septicemia 2,28,31,32,33,34.

El complejo nicho ambiental en el tracto urinario cateterizado y el importante papel de la formación de biopelículas en estas infecciones, plantean desafíos particulares en el estudio de la patogénesis de CAUTI. Los modelos de laboratorio simples y ampliamente utilizados para estudiar y cuantificar la formación de biopelículas, como los ensayos basados en placas de 96 pocillos, son inadecuados para el estudio de la formación de biopelículas en CATUI, particularmente las biopelículas cristalinas. Por ejemplo, estos modelos no tienen en cuenta aspectos clave del nicho CAUTI, como el complejo entorno de nutrientes proporcionado por la orina, cómo la superficie del catéter afecta la adhesión y la posterior producción de biopelículas, y el flujo continuo de medios urinarios 35,36,37,38,39,40. Además, los ensayos estándar utilizados para determinar la susceptibilidad antimicrobiana de los uropatógenos a menudo no reflejan la susceptibilidad clínica en el mundo real. Los ensayos de concentración inhibitoria mínima y las pruebas de suspensión microbiana se utilizan con frecuencia para inferir la susceptibilidad antimicrobiana de los patógenos CAUTI, pero generalmente no simulan variables importantes del entorno CAUTI, como el efecto que la presencia de un catéter urinario y cualquier formación posterior de biopelícula pueden tener sobre la susceptibilidad antimicrobiana 41,42,43.

En este estudio se detalla la configuración y ejecución de un modelo de vejiga in vitro que simula el entorno del tracto urinario cateterizado y replica un sistema de drenaje cerrado con catéter estándar utilizado en la práctica clínica, descrito por primera vez por Stickler et al.44 en 1999 (Figura 1). Este modelo utiliza catéteres de Foley de tamaño estándar (que actualmente están disponibles en la cadena de suministro del NHS) y medios de orina artificial (AUM) descritos anteriormente por Nzakizwanayo et al.45para simular la formación de CAUTI y biopelícula. El modelo de vejiga in vitro consiste en una cámara de vidrio de doble pared que actúa como "vejiga" y tiene una salida a través de la cual se puede insertar un catéter de Foley en la cámara de vidrio central. En la parte superior de la cámara de vidrio central, hay una entrada a través de la cual se puede suministrar AUM a la "vejiga" a un caudal biológicamente relevante utilizando una bomba peristáltica, que fluirá a través del catéter a través de los orificios oculares de drenaje hacia una bolsa de desechos. Además, la cámara exterior está conectada a un circuito de baño de agua, lo que permite mantener los modelos a una temperatura constante. El modelo de vejiga in vitro se puede inocular a través de la cámara central, lo que permite el estudio de patógenos CAUTI en un nicho biológicamente representativo. Además, dado que los modelos se cateterizan y se suministran constantemente con AUM frescos, se puede estudiar el crecimiento y la dinámica poblacional de las células planctónicas y asociadas a la biopelícula.

Estudios anteriores han utilizado modelos de vejiga in vitro para varias aplicaciones, incluido el estudio fundamental de la formación de biopelículas en patógenos CAUTI prominentes, incluidos Proteus mirabilis y Escherichia coli 43,45,46,47,48,49. Además, se ha utilizado el modelo in vitro para evaluar la eficacia de productos destinados a controlar la CAUTI o prevenir el bloqueo 50,51,52. Más recientemente, se han utilizado modelos para determinar si las adaptaciones y mutaciones relacionadas con la RAM afectan la formación de biopelículas y la patogénesis de CAUTI en P. mirabilis43,46. El modelo de vejiga in vitro también se ha utilizado para estudiar nuevos tratamientos antimicrobianos destinados al tratamiento de la CAUTI, incluidos los recubrimientos de catéteres teranósticos de nueva formulación y los tratamientos de terapia con fagos47,48. Este protocolo abarca la configuración y ejecución de modelos de vejiga in vitro, la enumeración de células planctónicas viables y asociadas a biopelículas a partir del modelo y la superficie del catéter urinario respectivamente, y la medición del pH urinario para controlar la producción de ureasa. También se detallan los protocolos para la evaluación de los productos antimicrobianos destinados a tratar o prevenir la CAUTI, incluidas las soluciones de irrigación de la vejiga y los geles lubricantes antimicrobianos, que actualmente están disponibles en la cadena de suministro del NHS.

Protocolo

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En la Figura 1 se muestra una representación esquemática de la configuración del modelo de vejiga in vitro. Los modelos de vejiga in vitro están diseñados para ser compatibles con los catéteres Foley estándar (las dimensiones que se muestran en la Figura 1 son compatibles con los catéteres franceses estándar de tamaño 14). Esterilice todo el equipo de modelo de vejiga in vitro y sujete cualquier tubo de silicona utilizado en el circuito de medios antes de usarlo. Se requiere un estricto cumplimiento de la técnica aséptica durante toda la configuración de los modelos in vitro, y se recomienda que el modelo se ensamble en condiciones estériles (es decir, en una cabina de seguridad microbiana de categoría II o en una campana de flujo laminar). Se recomienda un mínimo de n = 5 repeticiones para determinar la significación estadística de los experimentos con modelos de vejiga in vitro. Los detalles sobre los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de medios de orina artificiales

NOTA: Se recomienda el uso de medios de orina artificial (AUM) en modelos de vejiga in vitro debido a los altos volúmenes de medios necesarios para la experimentación y la variabilidad asociada con las muestras de orina humana. Este protocolo detalla la preparación de AUM como se describió anteriormente y optimizado para su uso en el modelo de vejiga in vitro por Nzakizwanayo et al. (5 L volumen final) 43,45,46,48,53,54.

  1. Preparar la solución AUM 1
    1. Pesar los siguientes compuestos y añadirlos a un frasco de borosilicato de 1 L lleno de 850 mL de agua desionizada: 3,25 g de cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl2,6H 2O), 23 g de cloruro de sodio (NaCl), 11,5 g de sulfato de sodio anhidro (Na2SO4), 3,25 g de citrato trisódico (Na3C6H5O7), 0,1 g de oxalato de sodio (Na2C2O4), 14 g de fosfato monopotásico (KH2PO4), 8 g de cloruro de potasio (KCl), 5 g de cloruro de amonio (NH4Cl), 25 g de gelatina y 5 g de caldo de triptona y soja.
  2. Mientras agita la solución de AUM, mida el pH con un medidor de pH y ajústelo a 5,75 (± 0,02) agregando 3 M de NaOH o HCl según corresponda.
    NOTA: Se debe agregar NaOH / HCl para el ajuste del pH a AUM gota a gota para evitar la precipitación de sal de la solución.
  3. Una vez ajustado el pH del AUM, rellene la solución hasta un volumen final de 1 L con agua desionizada y esterilización en autoclave.
    NOTA: Una vez estéril, la solución puede almacenarse hasta tres meses a temperatura ambiente (la solución AUM 1 debe desecharse si se observan precipitaciones o turbidez).
  4. Por separado, prepare la solución AUM 2, añadiendo 125 g de urea (CH4N2O) y 2,45 g de cloruro de calcio (CaCl2) a 400 ml de agua estéril desionizada en un vaso de precipitados estéril de 500 mL.
    NOTA: La preparación de la solución de urea cálcica 2 da como resultado una reacción endotérmica, por lo tanto, se recomienda que la solución AUM 2 se agite y caliente a ~ 50 °C en una placa caliente/agitador magnético mientras los compuestos se disuelven para evitar la congelación.
  5. Una vez que la urea y el cloruro de calcio se hayan disuelto, filtre la solución de esterilización 2 utilizando una bomba de vacío y unidades de filtro de nitrocelulosa de 0,45 μM, en una botella de vidrio estéril de 500 mL. Una vez esterilizada, la solución 2 es estable durante tres meses a 4 °C o un mes a temperatura ambiente
    NOTA: La solución AUM 2 debe descartarse si se observa precipitación o nubosidad.
  6. En una campana de flujo laminar o en una cabina de seguridad microbiológica de categoría II, combine asépticamente las soluciones AUM 1 y 2 con 3,6 L de agua desionizada estéril en una botella aspiradora de vidrio estéril de 5 L. Los activos bajo gestión deben ser de color amarillo pálido y transparentes.
  7. Con una pipeta serológica, extraiga 50 mL del volumen total de AUM y alícuota en un tubo de centrífuga de 50 mL, y reserve para su uso posterior.
  8. Selle la botella del aspirador con un tapón de goma o papel de aluminio y déjela a temperatura ambiente hasta que se ensamblen los modelos in vitro .
  9. Retire asépticamente 10 mL de AUM de la alícuota de 50 mL y reserve el resto de la solución para la preparación del inóculo. Con un medidor de pH, mida el pH de la alícuota AUM de 10 ml, que debe ser ~pH 6.1 (±0.2). Los AUM preparados son estables a temperatura ambiente durante aproximadamente un mes y deben descartarse si se producen precipitaciones o nubosidad.

2. Configuración del modelo de vejiga in vitro

  1. Inserte un catéter de Foley en la cámara de vidrio central del modelo de vejiga in vitro (esquema detallado en la Figura 1). Asegure el catéter en su lugar inflando el globo con la jeringa de agua estéril provista y conecte la bolsa de desechos al puerto del catéter.
  2. Conecte el dispositivo modelo de vejiga in vitro 45 al depósito AUM a través de un tubo de conexión. Conecte el tubo del circuito de medios a la bomba peristáltica según las instrucciones del fabricante, asegurándose de que el tubo tenga la tensión adecuada sin estirarse.
  3. Fije los modelos de vejiga in vitro a los soportes de sujeción y asegure las bolsas de residuos en los soportes debajo de los modelos para garantizar el flujo a través de los modelos por gravedad.
  4. Conecte la cámara exterior del modelo de vejiga a un baño de agua circulante a través de un tubo de silicona (Figura 1B). Ponga el baño de agua a calentar a 37 °C y encienda los circuladores del tanque.
    1. Deje correr baños de agua durante 30 minutos antes de inocular modelos de vejiga in vitro para garantizar que la temperatura sea estable a 37 °C y asegúrese de que el baño de agua permanezca lleno hasta el nivel de agua adecuado durante la experimentación.
  5. Retire las abrazaderas de los tubos de medios y configure las bombas peristálticas para que funcionen a aproximadamente 0,75 mL/min para replicar la producción de orina humana (~1080 mL/día). Los caudales reales se calcularán durante la experimentación.
  6. Ejecute AUM a través de los modelos de vejiga in vitro a través de la bomba peristáltica durante 30 minutos antes de la inoculación para confirmar que el flujo del medio está a una tasa constante y que el sistema de drenaje estéril está intacto.
  7. Drene los medios acumulados de la bolsa de residuos antes de experimentar. El volumen de los medios se puede medir para calcular los caudales exactos (detallados en el paso 4).

3. Inoculación de modelos de vejiga in vitro

  1. Prepare cultivos nocturnos para modelos de vejiga in vitro suspendiendo un bucle de colonias bacterianas cultivadas en agar sólido en 10 mL de caldo LB. Incubar durante la noche a 37 °C con agitación.
    NOTA: El modelo de vejiga in vitro se puede utilizar para estudiar una variedad de patógenos CAUTI, incluidas las cepas positivas para ureasa como Proteus mirabilis, y los medios de crecimiento utilizados se pueden modificar en consecuencia.
  2. Centrifugar todo el volumen de cultivo nocturno a 4.500 x g durante 10 min a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet en 10 mL de AUM y mida la absorbancia a OD595 nm con un espectrómetro.
  3. Normalice los cultivos resuspendidos a un diámetro exterior de595 nm de 1,0 y un volumen final de 10 mL en AUM utilizando la siguiente ecuación:
    figure-protocol-1
    donde, A1 es la absorbancia aDO 600 nm del cultivo nocturno, A2 es la absorbancia deseada a DO600 nm del inóculo (1,0), V2 es el volumen deseado del inóculo (10 mL) y V1 es el volumen requerido de cultivo nocturno para la normalización.
    NOTA: 10 mL de una suspensión OD595 nm 1.0 asegurarán que los modelos sean inoculados con aproximadamente 1010 UFC de la mayoría de las cepas bacterianas (validadas para Proteus mirabilis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus), replicando una infección establecida. El inóculo inicial puede modificarse en función de la especie utilizada o de la etapa de infección que se esté modelando (es decir, se puede utilizar una densidad de inóculo más baja para simular la infección en etapa temprana)47.
  4. Esterilice los modelos de vejiga in vitro con etanol al 70% y retire el tapón (entrada de medios) para que la cámara interna sea accesible. Extraer 10 mL de AUM del volumen dentro del modelo de vejiga utilizando una pipeta serológica.
    NOTA: Al inocular y tomar muestras de modelos in vitro desde la cámara central, asegúrese de que el trabajo sea rápido y aséptico, use siempre el EPP adecuado y descontamine regularmente los guantes y las superficies con etanol al 70%.
  5. Inocular los modelos de vejiga in vitro a través de la cámara central utilizando toda la suspensión normalizada de 10 mL y mezclar bien con una pipeta serológica. Extraer 10 mL de la cámara central de los modelos de vejiga in vitro utilizando una pipeta serológica y alícuota en un universal de 15 mL para posteriores cálculos de UFC/mL y medición del pH.
  6. Descontamine completamente las superficies externas del modelo de vejiga y el tapón con etanol al 70% y reemplace el tapón. Reanude brevemente el flujo de medios para asegurarse de que el nivel de AUM en la cámara central llegue al orificio ocular, antes de detener el flujo.
  7. Permita que los cultivos se establezcan en el modelo de vejiga durante 1 h antes de abrir el flujo de medios a través de la bomba peristáltica a ~0,75 mL/min.
  8. Mientras se establece el inóculo, prepare diluciones a partir de la muestra tomada de la cámara central.
    1. Diluir en serie 100 μL de muestra en 900 μL de PBS estéril hasta que la muestra se diluya a 10-7. Extraer 10 μL de las diluciones por triplicado en un medio sólido adecuado e incubar a 37 °C durante la noche.
    2. Después de la incubación, cuente las colonias en cada placa de dilución y calcule las UFC/ml exactas del inóculo inicial.
      NOTA: Si utiliza especies que pululan, es decir, Proteus mirabilis, utilice agar MacConkey sin sal (peptona 20,0 g/L, lactosa 10,0 g/L, sales biliares 5,0 g/L, rojo neutro 0,075 g/L y agar 12,0 g/L) para asegurarse de que las colonias individuales sigan siendo visibles para facilitar el conteo.
  9. Después de 1 h de incubación, conecte el flujo de medio a través de la bomba peristáltica para comenzar a ejecutar modelos de vejiga in vitro , anotando el momento en que se encienden los modelos.

4. Cálculo del caudal del modelo de vejiga in vitro

  1. Una vez que se han inoculado los modelos in vitro y se ha iniciado el flujo del medio, deje que los modelos funcionen durante 4 h. Detenga brevemente el flujo de medios y recoja todo el volumen de AUM residual de la bolsa de residuos en un matraz aforado a través del puerto de drenaje. Fíjate en el volumen recogido.
    NOTA: El caudal se puede calcular a partir del volumen de medios recolectados en el paso 2.7., sin embargo, se pueden obtener caudales más precisos ejecutando modelos durante más tiempo (es decir, se recomiendan 4 h), ya que esto reduce la probabilidad de que el aire residual en la tubería del circuito de medios afecte el caudal calculado.
  2. Reanude el flujo de medios a través de la bomba peristáltica, asegurándose de que el puerto de drenaje de la bolsa de residuos esté cerrado, para mantener un sistema de drenaje estéril.
  3. Para calcular el caudal real de los modelos in vitro , utilice la siguiente ecuación:
    figure-protocol-2
    NOTA: Se recomiendan caudales en el rango de 0.55-1.0 mL/min para replicar la producción de orina humana.
  4. Si el caudal del medio se calcula fuera del rango aceptable, deseche la réplica y ajuste las rpm en la bomba peristáltica para que se ajusten al rango aceptable.

5. Muestreo de células planctónicas del modelo de vejiga in vitro

NOTA: Los modelos de vejiga in vitro deben ser muestreados de forma rutinaria a lo largo de la experimentación para monitorear la dinámica de la población. Todos los modelos deben muestrearse inmediatamente después de la inoculación, en el punto de activación del flujo AUM, 4 h después de la inoculación (cuando se calcula el caudal) y en el punto en que se terminan los modelos (ya sea bloqueo o un criterio de valoración predeterminado). Si se ejecutan modelos durante >24 h, se recomienda que se tomen muestras cada 24 h para monitorear UFC/mL, y se pueden tomar muestras adicionales según lo requieran los usuarios.

  1. Descontaminar el tapón del modelo de vejiga con etanol al 70% y retirarlo para acceder a la cámara central.
  2. Evitando la punta del catéter y el balón, mezcle suavemente el contenido de la cámara central con una pipeta serológica.
  3. Con una pipeta serológica, extraiga una muestra de 10 ml de la cámara y transfiérala a un tubo estéril. Descontaminar inmediatamente el tapón con etanol al 70% y reemplazarlo, completando el circuito de drenaje estéril y cerrado.
  4. Extraiga 1 mL de la muestra con una pipeta y alícuota en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para diluciones en serie.
  5. Mida el pH de la muestra restante con un medidor de pH, asegurándose de que la muestra esté bien mezclada y de que el medidor de pH esté calibrado antes de usarlo.
  6. Diluir en serie la alícuota reservada de 1 mL de la muestra y colocar en un medio sólido apropiado como se describe anteriormente en el paso 3.8., colocando todas las diluciones.
    NOTA: Las muestras planctónicas tomadas del modelo de vejiga son apropiadas para otros análisis, incluidas las aplicaciones genómicas o de biología molecular (opcional).

6. Muestreo de células asociadas a biofilm a partir del modelo de vejiga in vitro

  1. Extracción y preparación del catéter
    NOTA: El muestreo de biopelícula de modelos de vejiga in vitro es un análisis de punto final, que requiere la desactivación de los modelos y la extracción de catéteres para su procesamiento.
    1. Desconecte la bolsa de residuos del catéter y drene cualquier residuo de orina del modelo desinflando el globo. Retire el catéter de la parte inferior del modelo con pinzas estériles.
    2. Coloque el catéter extraído sobre una tabla estéril y, con un bisturí estéril, corte el catéter en los puntos necesarios para la sección (se describe en la Figura 2).
    3. Asegúrese de que las secciones del catéter estén cortadas a lo largo para exponer el lumen; luego, con pinzas estériles, sumerja la sección del catéter 3 veces en PBS estéril para eliminar las células no adheridas.
      NOTA: Si toma imágenes de las secciones del catéter aguas abajo, es decir, mediante SEM, deje intactas las secciones de 1 cm (no corte a lo largo) y, en su lugar, elimine el exceso de humedad del lumen con una toalla de papel estéril antes de la fijación.
  2. Interrupción de la biopelícula para la enumeración de UFC/mL
    NOTA: Los protocolos que detallan la interrupción de las células asociadas a la biopelícula pueden requerir una mayor optimización si las biopelículas son ampliamente cristalinas o mucoides.
    1. Incubar la sección del catéter preparada en tripsina al 0,25% a 37 °C durante 30 min. El volumen de tripsina utilizado debe ser el mínimo requerido para cubrir el catéter; por ejemplo, para una sección de catéter de 1 cm cortada perpendicularmente, 1 ml de tripsina al 0,25% es suficiente.
    2. Después de la incubación, sonique la solución que contiene el catéter durante 10 minutos. A continuación, se puede retirar y desechar la sección del catéter. Para desactivar la tripsina, la solución celular debe diluirse inmediatamente en PBS estéril y colocarse en placas para los recuentos de UFC en medios sólidos apropiados, como se describió anteriormente en el paso 3.8.
  3. Cuantificación de biofilm catéter mediante tinción de cristal violeta
    1. Agregue las secciones de catéter preparadas a los pocillos en una placa de pocillos de fondo plano del tamaño adecuado. Utilice un volumen adecuado de solución de violeta cristalina al 0,1% para sumergir completamente la sección del catéter e incubar estáticamente a temperatura ambiente durante 15 minutos. Asegúrese de que también se incluya una sección de catéter estéril como control de fondo.
    2. Retire las secciones del catéter de la placa y transfiéralas a una nueva placa. Lave cada sección del catéter dos veces en agua destilada.
    3. Después de enjuagar, transfiera las secciones del catéter a una placa nueva y cúbralas con ácido acético al 33%. Incubar durante 15 min a temperatura ambiente.
    4. Retire la sección del catéter de la placa y, a continuación, con un lector de placas, mida el diámetro exterior de595 nm para cada réplica, utilizando los pocillos que contenían las secciones estériles del catéter como controles de fondo.

7. Pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos en el modelo de vejiga in vitro

NOTA: La mayoría de las terapias destinadas a controlar la infección del tracto urinario asociada al catéter son compatibles con los catéteres de Foley estándar, verifique la compatibilidad antes de comenzar los experimentos con modelos de vejiga in vitro .

  1. Geles lubricantes antimicrobianos
    NOTA: Para simular el uso de agentes lubricantes en la inserción del catéter, este paso debe realizarse durante el paso 2.1, inmediatamente antes de la inserción del catéter Foley. Después de insertar el catéter, el modelo debe conectarse inmediatamente, y el paso 2.6. debe omitirse para que el gel no se diluya y se drene antes de la inoculación. La inoculación debe realizarse el mismo día de la inserción del catéter. Los agentes lubricantes diseñados para su uso con catéteres se envasan como jeringas individuales, estériles y de un solo uso de 6 ml u 11 ml de volumen. Aproximadamente 5 mL de lubricante son suficientes para llenar tanto el cuello del modelo de vejiga como la capa de la base del modelo.
    1. Utilizando la técnica aséptica, inserte el extremo de la jeringa que contiene el agente lubricante en el cuello del modelo de vejiga e inserte 5 mL de gel para llenar el cuello e ingresar a la base de la cámara.
    2. Gire el modelo de modo que la base quede uniformemente cubierta con gel, luego inserte un catéter Foley en el modelo empujando la punta del catéter a través del gel y asegúrelo llenando el globo como de costumbre.
    3. Conecte el modelo al resto de la configuración, luego llene el lumen del modelo con orina hasta que comience a drenar. Tan pronto como la orina comience a drenar a través del orificio del catéter, detenga la bomba para evitar la pérdida de gel antes de la inoculación.
      1. Incubar los modelos durante 30 minutos para permitir que la orina alcance los 37 °C, luego inocular los modelos como se describió anteriormente para garantizar la uniformidad del tiempo de difusión de los componentes del gel en el volumen de orina.
    4. Inocular el modelo como se describe en el paso 3.5 y dejarlo incubar durante 1 h antes de encender las bombas peristálticas. En el momento de encender la bomba, tome una muestra planctónica de 1 mL y coloque las diluciones para los recuentos de UFC como se describe en el paso 3.8.
  2. Soluciones de riego
    NOTA: Las soluciones de riego a menudo están disponibles a granel o como "bolsas" individuales, estériles y de un solo uso. Si utiliza soluciones individuales, asegúrese de que sean compatibles con los puertos de drenaje de los catéteres que se van a utilizar antes de la experimentación. Si usa soluciones de irrigación a granel, asegúrese de usar catéteres de triple lumen y de seguir las instrucciones del fabricante para determinar el volumen/período de tiempo de administración del producto.
    1. Antes del tratamiento, se deben ejecutar modelos in vitro durante al menos 4 h para asegurarse de que las comunidades asociadas a la biopelícula hayan tenido tiempo suficiente para establecerse. Una vez que los modelos hayan funcionado durante 4 h, detenga el flujo del medio y tome una muestra de pretratamiento de la cámara interna de los modelos in vitro , como se detalla en el paso 5.
      NOTA: Si utiliza soluciones de riego a granel, continúe con el paso 7.2.5.
    2. Si utiliza una "bolsa" de irrigación individual, desconecte la bolsa de residuos del catéter y utilice la tapa suministrada con la bolsa para sellar la bolsa de residuos. Conecte inmediatamente la bolsa de solución de irrigación al catéter y, con una ligera presión, exprima el producto en el lumen central. Aplique según las instrucciones del fabricante (es decir, 15 minutos de aplicación).
    3. Una vez completado el tratamiento recomendado, permita que la solución residual drene de la cámara interna a través del orificio del ojo del catéter hacia la bolsa de irrigación, luego desconecte la bolsa. El contenido restante de la bolsa se puede desechar o utilizar para aplicaciones posteriores.
    4. Esterilizar el puerto de drenaje del catéter y el puerto de conexión de la bolsa de residuos con etanol al 70%, y volver a conectarlos, completando un sistema de drenaje estéril y cerrado.
      NOTA: Continúe con el paso 7.2.7 si usa bolsas de riego.
    5. Si usa un catéter de triple lumen, desinfecte el puerto de lumen de irrigación con etanol al 70% y comience a irrigar inmediatamente con una jeringa estéril según las instrucciones del fabricante.
      NOTA: Mida el volumen de orina residual en la bolsa de residuos antes de irrigar para que esto pueda tenerse en cuenta en cualquier cálculo de tiempo de bloqueo o caudal aguas abajo.
    6. Una vez que se complete la irrigación, deseche la jeringa y cualquier solución de irrigación residual que quede en la bolsa de desechos.
    7. Tome una muestra de postratamiento de la cámara central del modelo de vejiga in vitro , como se detalla en el paso 5, y reanude el flujo de AUM a través de la bomba peristáltica para continuar con la experimentación.

8. Finalización de la experimentación con modelos de vejiga in vitro

NOTA: Los organismos positivos para la ureasa, como P. mirabilis , pueden causar la obstrucción de los catéteres urinarios a través de la formación de biopelículas cristalinas. Por lo tanto, la obstrucción puede utilizarse como un criterio de valoración biológicamente relevante para los modelos de vejiga in vitro y se identifica visiblemente mediante la oclusión completa de los orificios oculares del catéter con biopelículas cristalinas y un aumento en el volumen de AUM en la cámara central de la "vejiga" de vidrio (Figura 3).

  1. Una vez que los modelos de vejiga in vitro hayan llegado al punto final predeterminado, que puede ser una obstrucción o un tiempo de ejecución definido, se apague el flujo de AUM a través de la bomba peristáltica y se tome una muestra del punto final de la cámara central como se describe en el paso 5.
  2. Cierre el flujo del baño de agua y desconecte el circuito de medios y la tubería del circuito del baño de agua de los modelos de vejiga in vitro .
  3. Retire los tapones de los modelos de vejiga in vitro y extraiga todo el volumen de orina residual con una pipeta serológica. Deseche cualquier medio contaminado de manera adecuada (es decir, esterilización en autoclave).
  4. Drene las bolsas de residuos y deseche los medios residuales. Desconecte las bolsas de residuos del catéter del puerto del catéter y deséchelas.
  5. Con una jeringa, desinfle lentamente los globos del catéter antes de quitar los catéteres de los modelos.
    NOTA: Si se utilizan especies bacterianas positivas para la ureasa, los catéteres pueden "pegarse" a las paredes de vidrio de los modelos in vitro . Evite aplicar grandes cantidades de fuerza a los catéteres y, en su lugar, continúe con el paso 8.6.
  6. Remoje los modelos in vitro en una solución limpiadora antimicrobiana al 5% (consulte la tabla de materiales) durante la noche, luego lávelos a fondo con agua para asegurarse de que se elimine cualquier desinfectante residual. Autoclave para esterilizar.
    NOTA: Si utiliza especies positivas para ureasa, añada un 5% p/v de ácido cítrico a la solución desinfectante para ayudar a disolver cualquier biomineralización en la cámara central. Esta solución ácida también ayudará a liberar los catéteres que se hayan adherido a los modelos al descomponer los depósitos de biopelícula cristalina.
  7. Desconecte la tubería del circuito de medios del depósito AUM y deseche cualquier medio residual. Enjuague la tubería con agua para eliminar cualquier AUM residual y autoclave.
  8. Para calcular el tiempo exacto de obstrucción, anote el volumen final en la bolsa de residuos y utilice la ecuación del paso 4.4 y el caudal calculado anteriormente para determinar el tiempo de obstrucción.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El éxito del funcionamiento del modelo de vejiga in vitro depende de la práctica de una buena técnica aséptica y de una observación cuidadosa de la turbidez de los medios a lo largo de la experimentación (Figura 3). Antes de la inoculación, el AUM estéril era de color amarillo pálido y transparente en la cámara central del modelo de vejiga in vitro (Figura 3A). El AUM en el depósito de medios debe permanecer claro durante toda la experimentación, ya que cualquier cambio de turbidez que ocurra puede indicar precipitación de sales de la solución o contaminación del medio. Si el AUM en el depósito de medios o en la tubería del circuito de medios se vuelve turbio o muestra un cambio drástico en el color, las réplicas deben descartarse y repetirse. Después de la inoculación, es claramente visible un aumento en la turbidez del AUM en la cámara central del modelo vesical in vitro (Figura 3B). Los cambios en la turbidez suelen ser más pronunciados en los organismos positivos a la ureasa, como P. mirabilis, pero aún deben ser visibles después de la inoculación en los organismos negativos a la ureasa. Después de que se inicia el flujo de AUM, a menudo se observa una reducción en la turbidez de AUM a medida que las células planctónicas se lavan, y no indica una falta de células viables en el modelo. La observación del nivel del medio en la cámara central también se puede utilizar para determinar el tiempo de bloqueo si se utilizan organismos positivos para la ureasa (Figura 3C). A medida que los modelos corren, el orificio del ojo y la punta del catéter deben ser completamente visibles para indicar el drenaje adecuado en las bolsas de desechos. Tras el bloqueo, el nivel de AUM en la cámara central se elevará por encima de los orificios oculares y la punta del catéter, lo que indica que el experimento está listo para cualquier lectura y terminación del punto final. Durante la experimentación, los efectos de la presión en el circuito de medios del modelo de vejiga in vitro pueden hacer que los modelos parezcan bloqueados. Si se sospecha de una obstrucción, verifique que el circuito AUM, el catéter y el tubo de la bolsa de residuos estén tensos antes de finalizar el ensayo, ya que cualquier posible burbuja de aire o torceduras en el tubo puede causar "esclusas de aire" e impedir que el catéter drene.

Durante los experimentos con modelos de vejiga in vitro , el muestreo planctónico puede proporcionar información valiosa sobre la dinámica de crecimiento dentro del modelo, así como sobre la progresión de CAUTI. El crecimiento celular, el pH y la formación de biopelículas se pueden monitorear a lo largo de la experimentación sin necesidad de terminar los modelos (Figura 4). Si se utilizan organismos ureasa positivos, los cálculos del tiempo de bloqueo se pueden utilizar como medida de la tasa de formación de biopelículas y se utilizan para comparar las propiedades de diferentes cepas bacterianas (Figura 4). La comparación de una cepa de tipo salvaje de P. mirabilis y un mutante LPS (inserción de mini-tn5 en waaC) demostró una extensión del tiempo hasta el bloqueo y, por lo tanto, una reducción de la formación de biopelículas en el mutante (Figura 4). Los microorganismos ureasa negativos no suelen bloquear los modelos de vejiga in vitro y, por lo tanto, se recomienda determinar un criterio de valoración establecido antes de la experimentación. En algunos casos, los microorganismos negativos a la ureasa pueden provocar la obstrucción del catéter. Por ejemplo, las cepas de ureasa negativa de Klebsiella pneumoniae pueden producir biopelículas mucoides extensas, sin embargo, estas suelen tardar mucho más que las biopelículas positivas para la ureasa en bloquear el drenaje, por lo que se sigue recomendando un criterio de valoración establecido.

La medición del pH a lo largo de la experimentación con modelos de vejiga también puede proporcionar información sobre las diferencias entre cepas, así como sobre el progreso de CAUTI. Si se utilizan organismos ureasa negativos, el pH en la cámara central del modelo de vejiga in vitro debe permanecer estable en gran medida durante toda la experimentación, aunque se esperan pequeñas fluctuaciones en el pH a medida que la dinámica de la población cambia en el transcurso del experimento. La inoculación de modelos in vitro con organismos ureasa positivos da como resultado un aumento significativo del pH con el tiempo, y el pH más alto generalmente se observa en el momento del bloqueo, donde se pueden observar lecturas de pH tan altas como ~8-9 (Figura 4B).

La enumeración de UFC/ml planctónica es un componente importante del modelado de la vejiga in vitro , ya que permite a los operadores evaluar si la inoculación ha sido exitosa y monitorear el progreso de la experimentación. La medición de UFC/ml al final de la experimentación puede resaltar cualquier diferencia en la colonización de la vejiga entre diferentes cepas bacterianas. Al comparar la cepa mutante mini-Tn5 de P. mirabilis con la de tipo salvaje, se observó una reducción significativa de UFC/mL en el momento del bloqueo (Figura 4C). Además, la enumeración de las UFC a partir de las biopelículas en la superficie del catéter y la cuantificación de la biomasa de la biopelícula pueden proporcionar información sobre la capacidad de diferentes patógenos para colonizar el tracto urinario cateterizado. Se utilizaron tinciones de violeta cristalino para determinar las diferencias en la formación de biopelícula entre una cepa HI4320 de P . mirabilis de tipo silvestre y los aislados pasados en clorhexidina (Figura 5). Las mediciones de densidad óptica a 595 nm demostraron que los aislados pasados en clorhexidina mostraron una reducción en la formación de biopelículas en comparación con el tipo salvaje y los controles pasados en ausencia de clorhexidina.

Dado que el objetivo del modelo de vejiga in vitro es replicar con precisión el nicho de CAUTI, los modelos también se pueden utilizar para estudiar los efectos de las terapias antimicrobianas destinadas a tratar CAUTI en un entorno clínicamente relevante. En el caso de los organismos con ureasa positiva, la comparación de los tiempos de bloqueo de los modelos tratados con los modelos no tratados puede proporcionar información útil sobre la eficacia del tratamiento. El tratamiento de modelos de vejiga in vitro inoculados con P. mirabilis con una solución de irrigación vesical con clorhexidina al 0,02% extendió significativamente el tiempo hasta la obstrucción en comparación con los modelos que no se trataron o se trataron con solución salina al 0,9% (Figura 6A). Además, el modelo de vejiga in vitro se puede utilizar para estudiar la actividad bactericida de las terapias antimicrobianas. El seguimiento de los cambios en las UFC/ml de las células planctónicas y asociadas a la biopelícula después del tratamiento antimicrobiano puede indicar si los tratamientos son eficaces. El tratamiento de los modelos de vejiga in vitro inoculados con P. mirabilis demostró una reducción de >7 log en las UFC/ml planctónicas inmediatamente después del tratamiento, en comparación con los modelos no tratados y con riego salino del 0,9% cuando se aplicaron según las instrucciones del fabricante (Figura 6B).

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Figura 1: Esquema de los principales componentes del modelo de vejiga in vitro . (A) El modelo de vejiga (sistema de drenaje cerrado): (1) cámara de vidrio de doble pared que simula la vejiga (2) entrada de medios, AU se suministra a través de una bomba peristáltica a la cámara interna del modelo de vejiga (3) entrada de agua suministrada a través de un baño de agua circulante a la cámara exterior (4) salida de agua (5) catéter Foley, insertado en la cámara interna (6) punto de conexión de lúmen de drenaje; Punto de conexión para bolsa de residuos/bolsas de riego (7) Bolsa de drenaje que recoge el flujo de salida de orina. (B) Esquema que representa la configuración del modelo de vejiga in vitro y la dirección del flujo de medios y agua a través del modelo. La orina artificial se almacena en un depósito de medios (1) a temperatura ambiente y se suministra al modelo a través de una bomba peristáltica (2) a un caudal constante de ~ 0,75 mL min-1 durante la duración del experimento. El medio fluye hacia la cámara central del recipiente de vidrio de doble pared que representa la vejiga (3) y drena a través del orificio ocular de un catéter de Foley (4) en una bolsa de drenaje (5), completando el sistema de drenaje cerrado estéril. El modelo de vejiga in vitro se mantiene a una temperatura constante de 37 °C a través de un baño de agua circulante (6), que fluye a través de la cámara exterior del recipiente de vidrio de doble pared. Las líneas discontinuas representan los tubos de silicona y las flechas representan la dirección del flujo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Corte de catéteres urinarios para procesar las células asociadas al biofilm. Puntos de ejemplo en un catéter urinario para la disección para la cuantificación posterior de la biopelícula. (A) Los catéteres se seccionan primero latitudinalmente en la región de 8 cm proximal a la punta/orificios oculares (donde se observa la mayor parte de la formación de biopelícula). Las secciones de 1 cm se retiran con bisturí, evitando generalmente la región que contiene el balón del catéter desinflado debido a las dificultades en la reproducibilidad del procesamiento (1-3). (B) Una vez que los catéteres se seccionan inicialmente en piezas de 1 cm, se realiza otro corte longitudinal en el lumen central para exponer cualquier biopelícula presente para una mayor cuantificación de la biopelícula, es decir, enumeración de UFC/mL de tinción de violeta cristalino. Las líneas discontinuas representan puntos de disección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Etapas de un experimento de modelo de vejiga in vitro . Imágenes de la cámara central modelo de vejiga in vitro , a lo largo de diferentes etapas de experimentación. (A) AUM en la cámara central modelo de vejiga in vitro antes de la inoculación. Los medios en la cámara central son completamente transparentes, lo que indica una esterilización exitosa, y la punta del catéter y los orificios de los ojos son visibles por encima de la línea de medios, lo que indica que el catéter se está drenando con éxito. (B) Medios en la cámara central modelo de vejiga in vitro después de la inoculación con P. mirabilis (4 h después de la inoculación). El éxito de la inoculación está indicado por el aumento de la turbidez del medio. La visibilidad de la punta del catéter y los orificios oculares indican que el AUM se está drenando con éxito a través del catéter y que no se ha producido ninguna obstrucción. (C) Un ejemplo de un modelo de vejiga in vitro bloqueada. La inoculación con P. mirabilis y la posterior formación de biofilm y mineralización han dado lugar a la obstrucción de los orificios oculares del catéter, impidiendo el drenaje y haciendo que el nivel de medios en la cámara central se eleve por encima de la punta del catéter. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Mediciones de punto final para un modelo de vejiga in vitro hasta la obstrucción. Ejemplo de mediciones de punto final en el momento del bloqueo de un modelo de vejiga in vitro inoculado con una cepa clínica de P. mirabilis, RS47 (WT), y una cepa mutante con formación de biopelícula atenuada, RS47-2 (mutante). (A) Tiempo de bloqueo (h) de WT y cepas mutantes de P. mirabilis. (B) pH de modelos de vejiga in vitro en el momento de la obstrucción. (C) UFC/mL de células planctónicas en cámara modelo de vejiga in vitro en el momento de la obstrucción. Todos los datos representan la media de cinco réplicas biológicas. Las barras de error muestran el error estándar de la media (SEM). *p ≤ 0,05; **p ≤ 0.01. Esta figura ha sido modificada a partir de Clarke et al.46. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Mediciones celulares asociadas a biofilm a partir del modelo de vejiga in vitro . Cuantificación de la formación de biopelículas de P. mirabilis , comparando la cepa de tipo salvaje HI4320 con poblaciones adaptadas con o sin clorhexidina (CHD) mediante tinción con violeta cristalino y medición de la densidad óptica (OD) a 595 nm. WT: P. mirabilis HI4320; 1, 3, 5: controles de paso sin exposición a la cardiopatía coronaria; 2, 4, 6: HI4320 conducido en 4 μg/mL CHD. Todos los datos representan la media de cinco réplicas biológicas. Las barras de error muestran SEM. *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Mediciones de modelos de vejiga in vitro después de un tratamiento antimicrobiano. Se tomaron muestras planctónicas de un modelo de vejiga in vitro inoculado con P. mirabilis, luego de la irrigación con una solución antimicrobiana de clorhexidina al 0,02% (100 mL) o un control salino al 0,9%. (A) Tiempo de obstrucción de los modelos de vejiga in vitro después de la irrigación. (B) UFC/mL planctónico inmediatamente después del tratamiento de riego. Todos los datos representan la media de cinco réplicas biológicas. Las barras de error muestran SEM. *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01; *p ≤ 0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

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El tracto urinario con cateterismo representa un nicho biológico complejo que puede ser difícil de replicar en un entorno de laboratorio. El modelo de vejiga in vitro se diseñó con el propósito de simular CAUTI y utiliza catéteres urinarios estándar para replicar el sistema de drenaje cerrado estéril utilizado en la práctica clínica. El tracto urinario con catéter es altamente susceptible a la infección, como lo demuestra el hecho de que los catéteres urinarios son el mayor factor de riesgo para el desarrollo de CAUTI 6,55. En consecuencia, la técnica aséptica cuidadosa es fundamental para el éxito de la ejecución de modelos de vejiga in vitro. La turbidez de los activos bajo gestión es un claro indicador de esterilidad, ya que los medios contaminados o caducados se turbiarán con el tiempo, lo que obligará a descartar todas las réplicas. También se debe utilizar una técnica aséptica cuidadosa al inocular y tomar muestras del modelo de vejiga in vitro, ya que al abrir la cámara central para agregar el inóculo preparado se rompe el sistema de drenaje estéril y cerrado, lo que hace que el modelo de vejiga in vitro sea susceptible a la contaminación. Para evitar la contaminación de la cámara central, se pueden utilizar catéteres de triple lumen para muestrear la población de células planctónicas (sujetando el lumen residual y drenando a través del lumen adicional). Se espera algún lavado en el punto de tiempo de 4 horas, pero es posible que sea necesario solucionar problemas si no se enumeran células planctónicas viables en este punto. Si no se enumeran células viables después de 4 h, es posible que sea necesario optimizar la densidad del inóculo o la formulación de AUM utilizada para apoyar mejor la colonización bacteriana. Además, el lavado del inóculo puede indicar un problema con el circuito de medios; Las torceduras dentro de la tubería podrían impedir un drenaje adecuado, lo que resultaría en la acumulación de metabolitos tóxicos que pueden impedir el crecimiento bacteriano, mientras que cualquier desinfectante residual utilizado para enjuagar la tubería del medio podría tener un efecto bactericida.

Este protocolo detalla la preparación de AUM según lo descrito previamente por Nzakizwanayo et al., ya que ha sido validado previamente para su uso en el modelo de vejiga in vitro con patógenos CAUTI prominentes, incluidos Proteus mirabilis y Escherichia coli 43,45,46,48 . Sin embargo, existe margen para modificar la formulación de AUM utilizada en el protocolo para seleccionar el crecimiento de otros patógenos. Se han publicado numerosas formulaciones diversas de AUM y, en cambio, podrían usarse en el circuito de medios 28,56,57,58,59,60. Además, los AUM en el depósito de medios se pueden complementar con nutrientes o antibióticos para seleccionar el crecimiento de patógenos específicos. Históricamente, los modelos de vejiga in vitro también se han suministrado con orina humana agrupada, sin embargo, los grandes volúmenes de medios necesarios para replicar un modelo de vejiga in vitro pueden hacer que la recolección de muestras humanas sea poco práctica53,54. Además, la composición de la orina humana puede variar mucho entre las muestras de los pacientes, lo que afecta a la reproducibilidad del experimento, ya que se ha demostrado que las diferencias en la concentración de hormonas, sales y proteínas, así como en el estado de hidratación, afectan al crecimiento bacteriano y a la formación de biopelículas 38,39,61,62.

El protocolo anterior detalla la inoculación del modelo de vejiga in vitro con ~10 10 UFC / mL replicando CAUTI en etapa tardía. Sin embargo, el sitio de inoculación del modelo de vejiga in vitro podría modificarse en ensayos futuros para replicar mejor las etapas anteriores de CAUTI, es decir, la colonización inicial del catéter urinario y la ascensión a la vejiga. La contaminación manual de los catéteres de Foley con un inóculo bacteriano conocido antes de la configuración de los modelos in vitro podría proporcionar información sobre las primeras etapas de CAUTI. De hecho, la densidad del inóculo se ha modificado en trabajos anteriores para replicar la infección en etapas tempranas; por ejemplo, Nzakizwanayo et al. modelos de vejiga in vitro inoculados con una UFC/mL inicial más baja (ca. 103 UFC/mL) para replicar la infección en estadiostempranos 47. Sin embargo, vale la pena señalar que la alteración de la densidad del inóculo puede resultar en un tiempo prolongado de bloqueo y requiere una validación adicional antes de la experimentación.

Además, si bien el protocolo detalla la inoculación del modelo in vitro con monocultivo bacteriano, hay margen para inocular modelos con patógenos fúngicos. Trabajos anteriores han sugerido que hasta el 8% de los CAUTIs resultan de la infección por Candida spp., que son capaces de producir biopelículas que a menudo son recalcitrantes al tratamiento antifúngico27,63. Además, el modelo de vejiga in vitro puede modificarse para adaptarse al estudio de la CAUTI polimicrobiana. De hecho, se ha sugerido que hasta el 86% de los CAUTI son polimicrobianos, y estas infecciones a menudo se asocian con síntomas más graves y una tasa de mortalidad más alta que la infección monoespecie 27,64,65,69. Los modelos in vitro pueden inocularse con múltiples especies para estudiar la formación de biopelículas polimicrobianas y la progresión de CAUTI, pero se debe realizar una validación cuidadosa de las comunidades polimicrobianas y la modificación de la densidad del inóculo antes de la inoculación. Estudios previos han utilizado el modelo de vejiga in vitro para monitorear las diferencias en la formación de biopelículas en una sola especie P. mirabilis CAUTI en comparación con CAUTI de doble especie con E. faecalis, destacando la interacción metabólica entre las cepas, lo que resultó en una mayor formación de biopelículas en comparación con la infección de una sola especie70.

Una de las principales ventajas de utilizar el modelo de vejiga in vitro para estudiar la CAUTI es la capacidad de observar la formación de biopelículas en la superficie de un catéter urinario estándar. La formación de biopelículas en CAUTI a menudo se inicia por la formación de películas acondicionadoras en la luz del catéter, compuestas por componentes orgánicos de la orina a los que los uropatógenos pueden adherirse, antes de proliferar y formar biopelículas maduras 2,18,71,72,73. Los ensayos estándar utilizados para estudiar la formación de biopelículas a menudo utilizan medios de crecimiento bacteriano estándar en lugar de AUM y, a menudo, se basan en la adherencia a microplacas o clavijas de poliestireno, es decir, el dispositivo Calgary; sin embargo, trabajos anteriores han sugerido que el entorno de nutrientes, el pH y los niveles de oxígeno del sistema, así como las propiedades físicas como el flujo y la diferencia en la estructura de la superficie (silicona frente a plásticos), pueden afectar la formación de biopelículas 36,37,74,75,76,77,78. Además, el cultivo de bacterias con una amplia actividad ureasa, como P. mirabilis en un sistema cerrado en AUM, puede resultar en la acumulación de metabolitos tóxicos, lo que puede resultar en la muerte celular78,79. Esto se mitiga en el modelo de vejiga in vitro, ya que el AUM en la cámara central se reemplaza constantemente con medios frescos a través del circuito de medios, lo que permite el estudio de las biopelículas de CAUTI en condiciones clínicamente más relevantes45. El funcionamiento diario del modelo de vejiga in vitro y el criterio de valoración seleccionado para los modelos dependen en gran medida de si los modelos están inoculados con microorganismos ureasa positivos o negativos. Teóricamente, los modelos in vitro podrían funcionar indefinidamente si se suministran con un volumen adecuado de AUM y si se mantiene la esterilidad del modelo; Sin embargo, se recomienda seleccionar un punto final antes de la experimentación, ya sea un bloqueo o un número arbitrario de días. En general, se recomienda que los modelos in vitro inoculados con microorganismos ureasa negativos se ejecuten durante ≤7 días para simular el entorno clínico, ya que esto suele ser suficiente para observar la formación de biopelículas en la mayoría de los organismos, al tiempo que se mantiene en línea con las intervenciones clínicas, ya que las mejores prácticas estándar indican que los catéteres deben reemplazarse una vez que estén visiblemente infectados 1,2. 3,47,48. Aunque es probable que los organismos positivos para la ureasa produzcan biopelículas cristalinas, existe una gran variación dentro de las cepas positivas para la ureasa en el tiempo hasta el bloqueo del modelo de vejiga in vitro, con algunas cepas de Proteus mirabilis que causan el bloqueo del catéter en menos de 10 h, y otras que tardan más de 30 h en bloquear39,46. Se podría utilizar una prueba de ureasa estándar antes de la experimentación con modelos de vejiga in vitro para determinar si se deben ejecutar modelos hasta el bloqueo o un criterio de valoración predefinido80.

Quizás la principal limitación del uso del modelo de vejiga in vitro para estudiar la formación de biopelículas es que las mediciones de biopelículas son una lectura de punto final, ya que requieren la extracción y disección del catéter urinario. Por el contrario, se pueden tomar muestras planctónicas del modelo de vejiga in vitro en cualquier momento durante la experimentación. Además, una vez que se toman muestras de biopelícula de los modelos de vejiga in vitro, se pueden utilizar numerosas técnicas posteriores adicionales para cuantificar mejor la producción de biopelícula. Estudios anteriores han utilizado la fotometría de llama para cuantificar la cantidad de calcio y magnesio presentes en las biopelículas cristalinas, y se pueden utilizar tinciones más complejas para identificar con precisión los componentes de la matriz de EPS de las biopelículas negativas a la ureasa 45,73,81,82,83,84.

En este trabajo también se describe la aplicación del modelo vesical in vitro para estudiar los efectos de terapias dirigidas al tratamiento de la CAUTI. El modelo de vejiga in vitro simula aspectos importantes del nicho de CAUTI, como el uso de AUM, así como la formación de biopelículas clínicamente relevantes y el aumento de la carga orgánica observado en CAUTI. Terapias como los antibióticos pueden añadirse directamente al tanque de AUM para simular la biodisponibilidad del fármaco clínicamente relevante, y estudios anteriores han utilizado fármacos reutilizados como la tioridazina y la fluoxetina para demostrar un efecto antibiofilm81. Además, los ensayos de concentración inhibitoria mínima y las pruebas de suspensión bacteriana se utilizan a menudo para inferir la actividad antimicrobiana de los biocidas, aunque hay poca evidencia que sugiera que los ensayos se correlacionan con la susceptibilidad a los biocidas en el mundo real 41,85,86,87,88. El modelo de vejiga in vitro es ventajoso para el ensayo de productos biocidas destinados a tratar o prevenir el CAUTI, ya que la presencia del catéter urinario y una simulación más representativa del nicho del CAUTI significan que productos como los geles lubricantes antimicrobianos y las soluciones de irrigación pueden probarse según las instrucciones del fabricante. Estudios anteriores también han utilizado el modelo de vejiga in vitro para determinar la efectividad de la terapia con fagos, y demostraron que el tratamiento con fagos podría extender el tiempo de bloqueo de P. mirabilis para bloquear el modelo de vejiga in vitro en más de 100 h47. El uso de un catéter Foley de tamaño estándar en el modelo de vejiga in vitro también significa que se pueden analizar nuevos catéteres recubiertos para determinar la actividad antimicrobiana. Trabajos anteriores de Slate et al. demostró que los catéteres recubiertos con un recubrimiento teranóstico de ciprofloxacino podían prolongar el tiempo de bloqueo de P. mirabilis en ~60 h en un modelo de vejiga in vitro 48. Esto pone de manifiesto la posible aplicación del modelo de vejiga in vitro en el estudio de nuevas terapias destinadas al tratamiento de CAUTI, lo que permite una evaluación más precisa de los antimicrobianos en un nicho simulado de CAUTI biológicamente relevante.

Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos al Dr. Jonathan Nzakizwanayo y al Dr. Anthony J. Slate por su experiencia compartida en el desarrollo de este protocolo. El trabajo en la Universidad de Bath fue financiado por el Consejo de Investigación Médica GW4 Biomed DTP como una beca para V.B. (MR/N0137941/1). B. V. J. también cuenta con el apoyo financiero del Dunhill Medical Trust (RPGF1906\171). La investigación de O.E.C. fue financiada por Kidney Research Northwest (RCN: 1144798). La figura 1 se crea con Biorender.com.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Extensión de cabezal de carga rápida 313 BombaWatson-Marlow313- extensión adicional del cabezal de la bomba
Bomba de velocidad variable con control manual 323S/DWatson-Marlow323S/DBomba peristáltica
3L Sacos de cama, estériles con grifos de palancaAtención médica del Gran Oso GDW173
Tubo de silicona curado con platino de 3 mm de diámetro interiorFisher10111801Tubo de circuito AUM pequeño (conecte el tubo de la bomba a los modelos)
Tubo de silicona curado con platino de 5 mm de diámetro interior Fisher10539201 Tubo de circuito AUM medio (conecte el tubo de la bomba al depósito AUM)
Cloruro de amonio (NH4Cl)Fisher11473713
sulfato de sodio anhidro (Na2SO4)Fisher11498717
Azlon Conector cónico Fisher10712807Se utiliza para conectar diferentes longitudes de tubería en el circuito AUM
Colgadores de bolsas de camaAtención médica del Gran Oso 10705P
Abrazaderas de tubo de grifo de pellizco Bochem, 25 mm de diámetroFisher11805101
cloruro de calcio (CaCl2)Fisher10021681
Ácido cítrico monohidratado MerckC1909-500GSe utiliza para eliminar la biopelícula cristalina de los modelos después de la experimentación
Fisherbrand  Pipetas de vidrio graduadas de clase B tipo 1Fisher11992168Se utiliza para suministrar modelos de cuchillas in vitro con AUM a través de gelatina de tapón perforada
VWR24360.233
Graphpad prism 10GraphPadV10.0Software analítico utilizado para graficar los resultados de los modelos de vejiga in vitro y el análisis estadístico.
Medidor de pH de sobremesa Hanna HI 2211-02Phillip Harris PP00057414
Modelo in vitro vejiga --Equipo a medida como lo describieron anteriormente Nzakizwanayo et al. (2019).
Instillagel 6 mL gel lubricantemydoctorshop.co.uk40-006Geles lubricantes utilizados en la sección 7.1.; hay otros proveedores disponibles.
Kartell Plastilab Conector cónico desigualFisher11914289Se utiliza para conectar tubos de diferentes diámetros
Agar MacConkey sin sal (deshidratado)Fisher10472643Para la enumeración de colonias individuales de bacterias de enjambre, es decir, cloruro de magnesio Proteus mirabilis
hexahidratado (MgCl2.6H2O)Fisher10386743
fosfato monopotásico (KH2PO4)Fisher10573181
Nalgene Conector en forma de YFisher10186070Se utiliza para ejecutar múltiples circuitos AUM desde un depósito AUM (1-4 modelos por tanque) 
cloruro de potasio (KCl)Fisher10375810
Pyrex Botella de aspirador con enchufe lateral de vidrio esmerilado, capacidad: 5000 mL11347884depósito AUM
Tapones de goma con un orificio, diámetro exterior: 37 mm, rojo, diámetro: 37 mmFisher11517612Se utiliza en el depósito AUM y para suministrar modelos in vitro con AUM
Catéter Foley francés 100 % silicona talla 14 con jeringa estéril de agua para infladoAtención médica del Gran Oso 4833-0514
cloruro de sodio (NaCl)Fisher10735921
oxalato de sodio (Na2C2O4)Fisher10442211
Teknon Biocleanse concentrado biocida limpiador 5L Fisher12447580Se utiliza para esterilizar modelos después de la experimentación
Citrato trisódico (Na3C6H5O7)Fisher11434993
caldo de soja triptona Urea10198002Fisher
(CH4N2O)Fisher10404185
Uro-Tainer M NaCl 0,9%B.BraunFB99833Bolsa de irrigación vesical salina utilizada en la sección 7.2. 
Watson-Marlow Pumpsil Tubo de silicona curado con platino de 1,6 mm de diámetro interiorFisher12406280Tubo de circuito AUM grueso (para uso en bomba perstáltica)
peristáltica Fisher

Referencias

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