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Artículo de método

Identificación de microglía y macrófagos infiltrantes periféricos en la médula espinal lesionada mediante citometría de flujo

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DOI:

10.3791/67967

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24 de junio de 2025

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1Clinical Laboratory, the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Laboratory Medicine, Bengbu Medical University, 3Anhui Province Key Laboratory of Immunology in Chronic Diseases, Bengbu Medical University, 4The Second Affiliated Hospital of South China University, 5Anhui Province Key Laboratory of Basic and Translational Research of Inflammation-related Diseases, Bengbu Medical University

En este artículo

Resumen

La identificación de la microglía (MG) y los macrófagos infiltrantes periféricos (Mø) en la médula espinal lesionada es difícil. En este protocolo, se utilizó la citometría de flujo (FCM) para identificar MG similares a M1, MG similares a M2, Mø similares a M1 y Mø similares a M2, respectivamente. Esta tecnología también se puede aplicar a otras enfermedades del sistema nervioso central para comprender el papel de MG y Mø.

Resumen

En una médula espinal sana, los macrófagos infiltrantes periféricos son casi indetectables, y la microglía (MG) participa en el mantenimiento de la estabilidad del microambiente de la médula espinal mediante la fagocitosis, la eliminación de los desechos celulares y la producción de factores neurotróficos. Después de una lesión de la médula espinal (LME), las MG se activan y las células inmunitarias periféricas se infiltran en la médula espinal lesionada. Entre estas células inmunitarias, la MG activada y los macrófagos infiltrantes periféricos (Mø) desempeñan un papel crucial en el proceso patológico de la LME. Estas células se pueden distinguir en fenotipos proinflamatorios (similares a M1) y antiinflamatorios (similares a M2); Sin embargo, distinguirlos es un desafío debido a su similitud en morfología y muchos marcadores celulares. La citometría de flujo (FCM), una técnica ampliamente utilizada en el campo biomédico, puede detectar simultáneamente múltiples parámetros celulares como el tamaño de la célula, el tamaño de las partículas, la superficie celular y los marcadores intracelulares en un solo experimento. A lo largo de años de investigación, se intentó identificar la MG y la Mø en la médula espinal y se optimizó continuamente para desarrollar un método de detección estable. Este método permite la identificación de MG similar a M1/M2 y Mø similar a M1/M2 después de SCI mediante la detección de los perfiles de expresión de CD45, CD11b, CD68, CCR7 y otros marcadores. En este protocolo, las células CD11b+CD45−/CD68+CCR7+ bajo, CD11b+CD45−/CD68+CCR7-, CD11b+CD45 CD68+CCR7+ altoy CD11b+CD45CD68+CCR7- pueden identificarse como MG similares a M1, MG M2, Mø M1 y Mø M2, respectivamente.

Introducción

La lesión de la médula espinal (LME) es el resultado de un daño de la médula espinal causado por varias razones. La LME tiene una alta tasa de discapacidad y, en la actualidad, no existen opciones de tratamiento efectivas, lo que la convierte en uno de los problemas de salud pública más graves en el mundo 1,2. El proceso fisiopatológico de la LM es complejo y se divide en dos etapas. Inicialmente, el traumatismo mecánico de la lesión causa inmediatamente una disfunción celular aguda y la muerte celular. Luego, el daño secundario conduce a una mayor disfunción celular y muerte celular durante días, semanas o incluso meses. Dentro de los mecanismos de lesión secundaria, se ha demostrado que la inflamación es un determinante clave de la gravedad del daño secundario, lo que en última instancia dicta la muerte celular yla funcionalidad celular. Las características de las respuestas inflamatorias son la infiltración y activación de células inflamatorias dentro de la médula espinal lesionada, lo que conduce a un aumento de las células inflamatorias y los factores inflamatorios, creando un microambiente inflamatorio y, finalmente, causando disfunción de la médula espinal4.

La microglía del sistema nervioso central (SNC) y los macrófagos infiltrantes periféricos desempeñan un papel fundamental en la respuesta inflamatoria tras una lesión medular (LME)5,6. Como macrófagos residentes del SNC, la microglía constituye el 5%-10% de las células del SNC y son esenciales para la recuperación de la LME 7,8. La microglía puede engullir y eliminar los desechos celulares después de una lesión de la médula espinal, mediando la formación de cicatrices en proceso de curación 9,10. Sin embargo, la activación excesiva de la microglía puede conducir a una respuesta inflamatoria sostenida y promover la formación de cicatrices gliales, que impiden la regeneración axonal11. Después de la LME, la microglía activada exhibe principalmente dos fenotipos: M1 y M212,13. El fenotipo tipo M1 es proinflamatorio, promoviendo la síntesis de factores inflamatorios que contribuyen a la apoptosis celular y a la lesión secundaria. La microglía similar a M1 también tiene efectos neurotóxicos, exacerbando las lesiones y la apoptosis neuronal14,15. Por el contrario, el fenotipo tipo M2 tiene propiedades antiinflamatorias y promueve la angiogénesis, la remielinización, el crecimiento axonal y la reparación de tejidos16,17. La microglía similar a M2 desempeña un papel crucial en la modulación de la inflamación y los procesos de reparación.

Los macrófagos periféricos se infiltran en el sitio de la lesión después de una lesión medular a través de las barreras y la vasculatura de la médula espinal dañadas17,18, regulando aún más la respuesta inflamatoria, la fagocitosis, la formación de cicatrices y la regeneración del tejido neural 19,20. Los macrófagos infiltrantes periféricos pueden reducir la respuesta inflamatoria después de la lesión de la médula espinal, fagocitar los restos de tejido21, promover la regeneración neuronal y la remodelación de la matriz. Sin embargo, una respuesta inflamatoria sostenida mediada por macrófagos infiltrantes periféricos puede conducir a una lesión secundaria, lo que es perjudicial para la recuperación a largo plazo22,23. Los macrófagos infiltrantes periféricos similares a M1 tienen una fuerte capacidad fagocítica y presentadora de antígenos, capaces de eliminar las células necróticas24. Sin embargo, su secreción excesiva de citocinas proinflamatorias, especies reactivas de oxígeno (ROS) y especies reactivas de nitrógeno (RNS) puede dañar las neuronas y las células gliales, lo que conduce a una apoptosis neuronal más grave. Por el contrario, los macrófagos infiltrantes periféricos tipo M2 pueden inhibir la apoptosis neuronal y mitigar la respuesta inflamatoria después de la LME, promoviendo así la reparación del tejido neural26.

La microglía activada y los macrófagos infiltrantes periféricamente después de una lesión medular presentan similitudes morfológicas y moleculares en la expresión que dificultan su diferenciación. La citometría de flujo (FCM), una técnica ampliamente adoptada, se emplea para analizar la expresión de la superficie celular y las moléculas intracelulares, identificar diferentes subpoblaciones celulares y, al mismo tiempo, evaluar múltiples parámetros de células individuales. Se ha llevado a cabo un ensayo de FCM estable para distinguir la microglía activada de los macrófagos infiltrantes periféricos, lo que facilita la investigación de sus funciones en la LME. En este artículo se describe el método de detección estable que se ha desarrollado.

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Protocolo

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética en Cuidado Animal de la Universidad Médica de Bengbu (No. 2020-050). El cuidado de los animales cumplió con las regulaciones proporcionadas por el Ministerio de Ciencia y Tecnología de China. Se obtuvieron y utilizaron comercialmente un total de 18 ratones hembra C57/BL6 de ocho semanas de edad. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Experimentación y preparación animal

  1. Aloje a los ratones en jaulas ventiladas antes de la cirugía. Mantenga un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y proporcione acceso gratuito a alimentos y agua. Mantenga la temperatura ambiente ambiente entre 20 y 22 °C y la humedad entre el 30% y el 70% durante una semana de aclimatación.
  2. Esterilice los instrumentos quirúrgicos para los ratones mediante autoclave y séquelos antes de usar. Someta los instrumentos y la sala de cirugía animal a la esterilización ultravioleta media hora antes de la cirugía. Agrupe y etiquete los ratones de acuerdo con el principio de agrupación aleatoria. Registre y registre sus pesos para su uso posterior.
  3. Anestesiar a los ratones con un cóctel de ketamina (80 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg) mediante inyección intraperitoneal (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente). Afeita el vello de la espalda desde las vértebras T8 hasta T10.

2. Preparación del modelo de ratón SCI

  1. Desinfecte el área quirúrgica con un hisopo de yodo de la cabeza a la cola, centrándose en T9, seguido de la desinfección con un hisopo con alcohol al 75%. Realice una incisión de 1 cm en la piel centrada en T9. Diseccione la fascia, el músculo y los ligamentos que rodean T9 durante 1 cm.
    1. Separe el músculo adyacente a la apófisis espinosa T9 para exponer T9. Utilice tijeras oftálmicas para descubrir y eliminar la lámina entre T9 y T10, exponiendo completamente la médula espinal ubicada en T9, que tiene aproximadamente 2 mm de diámetro.
      NOTA: Al levantar la lámina T9, asegúrese de que las tijeras no toquen la médula espinal.
  2. Estabilizar la columna vertebral sujetando las apófisis espinosas de T7 y T11. Cree un modelo de LME moderado utilizando una varilla con un diámetro de 1,3 mm y una fuerza de 0,5 N. Observe cómo la cola se enrosca hacia arriba y la extremidad trasera se contrae después de la LME. En el caso de los ratones operados de forma simulada, se debe realizar únicamente una laminectomía sin contusión.
  3. Lograr la hemostasia en el sitio de la incisión. Realice el cierre por capas con suturas quirúrgicas estériles 5-0. Para la aproximación muscular, agarre la fascia profunda con pinzas Adson con dientes y suture la capa de panículo carnoso con monofilamento absorbible 5-0, insertando la aguja perpendicularmente a 2 mm del borde de la herida para lograr mordidas simétricas de espesor completo (2-3 mm de profundidad) espaciadas a 3 mm.
    1. Haz nudos cuadrados con tensión controlada para alinear anatómicamente los planos fasciales. Vuelva a colocar los bordes de la piel con unas tijeras micro Iris para crear una eversión epidérmica de 1 mm. Alinee la dermis con precisión con las pinzas de relojero y asegúrela con suturas no absorbibles 5-0 interrumpidas simples espaciadas a 2 mm de distancia, asegurando una coaptación uniforme sin espacios muertos subcutáneos.
    2. Desinfecte la línea de sutura con hisopos de yodo usando movimientos unidireccionales desde el centro de la herida hacia afuera. Frote suavemente la sangre residual con una gasa humedecida con solución salina y aplique una capa delgada de ungüento antibiótico triple a lo largo de la incisión.
  4. Después de la cirugía, coloque a los ratones en una jaula mantenida a una temperatura y humedad adecuadas. Proporcione cuidado para orinar dos veces al día (por la mañana y por la noche) para ayudar a los ratones hasta que recuperen la micción independiente.
  5. Inyectar a cada ratón por vía subcutánea 0,5 mL de solución salina y antibióticos (gentamicina, 2000-2500 U/ratón) diariamente para prevenir la infección.

3. Aislamiento de tejido de la médula espinal de ratones C57/BL6

  1. Anestesiar a los ratones antes de la cirugía (paso 1.3). Una vez completamente anestesiados, fijarlos en la mesa quirúrgica en posición supina. Los ratones operados de forma simulada se tratan de forma similar.
  2. Haga una incisión transversal en la cavidad torácica, debajo del esternón y a lo largo del diafragma para exponer el corazón. Estabilizar suavemente el corazón con hemostáticos e insertar la cánula de perfusión en el ventrículo apical izquierdo, haciéndolo avanzar hacia la aorta.
    1. Cortar inmediatamente la aurícula derecha y comenzar la perfusión a una velocidad de 250 mL/h con 10 mL de solución de PBS. La perfusión se considera exitosa cuando el líquido que drena de la aurícula derecha pasa de rojo sanguinolento a transparente e incoloro, o cuando el hígado pasa de rojo a blanco27.
  3. Transecta la columna vertebral en el extremo de la cola del ratón para exponer el agujero vertebral. Con unas tijeras oftálmicas, diseccione cuidadosamente el tejido de la médula espinal 0,5 cm por encima y por debajo del sitio de la lesión. Colocar el tejido aislado de la médula espinal en una placa de cultivo estéril y libre de enzimas que contenga un 5% de tampón de tinción y almacenarlo en hielo a 4 °C para su uso posterior en la centrifugación en gradiente de densidad de polivinilpirrolidona (PVP) recubierta de sílice coloidal.
    NOTA: Al diseccionar la médula espinal cerca del centro de la lesión, asegúrese de la integridad del tejido para evitar desgarrar o dañar la médula espinal en el sitio de la lesión. El tampón de tinción (SB) al 5% consta de 2,5 mL de suero fetal bovino (FBS) y 47,5 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS).

4. Centrifugación en gradiente de densidad mediante sílice coloidal recubierta con polivinilpirrolidona

  1. Coloque el tejido de la médula espinal en un colador de células de malla 300 y triélelo con el émbolo de una jeringa desechable de 5 mL/10 mL. Después de la molienda, filtre la suspensión de la celda a través del filtro de malla 300 en un tubo de centrífuga de 15 ml para la centrifugación (5 min, 110 x g, temperatura ambiente).
    1. Después de la centrifugación, agregue 1 mL de solución de digestión celular de tripsina al sedimento celular e incube en una incubadora de cultivo celular a 37 °C durante 15 min. Detenga la digestión agregando 1,5 mL de suero fetal bovino, luego centrifugue nuevamente (110 x g, 5 min, temperatura ambiente). Vuelva a suspender el sedimento celular en 1 mL de tampón de tinción (SB) al 5%.
  2. Agregue secuencialmente 4 mL de solución de polivinilpirrolidona recubierta de sílice coloidal al 70%, 4 mL de solución de polivinilpirrolidona recubierta de sílice coloidal al 30% y 1 mL de la solución celular resuspendida SB al 5% a un tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugar la mezcla (300 x g, 30 min, 20 °C).
    NOTA: Prepare el reactivo de separación de polivinilpirrolidona recubierto de sílice coloidal como una mezcla 9:1 de polivinilpirrolidona recubierta de sílice coloidal y 10× PBS. Diluir la solución de polivinilpirrolidona recubierta de sílice coloidal al 70% con 1× PBS y la solución de polivinilpirrolidona recubierta de sílice coloidal al 30% con medio de cultivo celular DMEM o RPMI 1640.
  3. Después de la centrifugación, las células formarán capas en el tubo de centrífuga (Figura 1). Deseche los restos de células y las capas de plaquetas por encima de la marca de calibración de 8 mL. Aspire cuidadosamente la solución restante (hasta la marca de calibración de 1,5 mL) y deseche el sedimento por debajo de la marca.
    1. Transfiera la solución restante a un nuevo tubo de centrífuga de 15 mL y agregue 1× PBS para llevar el volumen total a 15 mL para la centrifugación (400 x g, 5 min, 4 °C).
  4. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento celular en SB al 5%. Transfiera la solución a un tubo de citometría de flujo (FCM) para su lavado y centrifugación (110 x g, 5 min, 4 °C). Vuelva a suspender el sedimento celular en el tubo FCM con 200 μL de SB al 5%.

5. Tinción de FCM

  1. Divida 200 μL de la suspensión celular en partes iguales en dos nuevos tubos de citometría de flujo. Etiquete un tubo como "Control de isotipo" y el otro como "Tinción específica".
  2. Procedimiento de tinción
    1. Al tubo de "Control de isotipo", agregue los siguientes anticuerpos con isotipos: IgG2b kappa de rata marcada con PE, IgG2b kappa de rata marcada con FITC, IgG2b kappa de rata marcada con APC y IgG2b kappa de rata marcada con APC-eFluor 780.
    2. Al tubo de "tinción específica", agregue el siguiente panel de anticuerpos marcados con fluorescencia de acuerdo con las proporciones de dilución recomendadas: Rat anti-mouse CD45 APC, Rat anti-mouse CD11b PE, Rat anti-mouse CD68 FITC y Rat anti-mouse CCR7 APC-eFluor 780.
    3. Incubar los tubos a temperatura ambiente, protegidos de la luz, durante 30 min.
  3. Lave las células teñidas dos veces agregando 1 mL de SB cada vez. Centrifugar las células (110 x g, 5 min, 4 °C). Finalmente, fije las celdas con paraformaldehído (PFA) al 2% para el análisis de citometría de flujo.

6. Detección de FCM

NOTA: Para más detalles del procedimiento, consultar los informes anteriores 27,28.

  1. Analice las muestras utilizando el citómetro de flujo con el software compatible (consulte la tabla de materiales).
    1. Primero, analice el tubo de control del isotipo para establecer el gráfico primario (FSC en el eje x y SSC en el eje y). Ajuste los voltajes de dispersión directa (FSC) y dispersión lateral (SSC) para posicionar la población de celdas dentro de un rango apropiado.
    2. Configure dos gráficos adicionales: uno con IgG-APC en el eje x e IgG-PE en el eje y. Otro con IgG-FITC en el eje x e IgG APC-Cy7 (nota: se detectó APC-eFluor 780 en este canal) en el eje y.
    3. Ajuste los voltajes del canal de fluorescencia para IgG-APC, IgG-PE, IgG-FITC e IgG APC-Cy7 para posicionar la población celular dentro de los 103 de la región doble negativa.
  2. Una vez que los voltajes FSC y SSC, así como los voltajes del canal de fluorescencia, se han ajustado y optimizado utilizando el tubo de control de isotipo, estos ajustes deben permanecer sin cambios. Proceda a analizar los tubos experimentales teñidos con anticuerpos.
    1. Establezca un gráfico primario con CD11b-PE en el eje x y SSC en el eje y. Configure otro gráfico con CD68-FITC en el eje x y CCR7 APC-Cy7 en el eje y. Usando el tubo de control de isotipo como referencia, establezca los valores de referencia y delinee la "región" para las células CD11b+ . En el gráfico primario, controle la región de la célula CD11b+ y defínala como la "puerta P1 ".
    2. A continuación, seleccione el gráfico con CD68-FITC en el eje x y CCR7 APC-Cy7 en el eje y. Haga clic con el botón derecho y elija Mostrar población, luego elija P1. Esto mostrará las poblaciones de células dentro del grupo CD11b+ que expresan CD68+/CCR7+ o CD68+/CCR7-. Recopile 50.000 eventos por muestra.
    3. Después de adquirir los datos, ajuste la compensación de fluorescencia según sea necesario. Analice y determine el porcentaje de células CD11b+ , CD68+ , CCR7+ (similares a M1) y CD11b+ , CD68+ , CCR7- (similares a M2). El porcentaje promedio de celdas marcadas positivamente se expresa como un porcentaje de la población total de la muestra.
  3. Utilizando los parámetros de voltaje bien ajustados del tubo de control de isotipo, proceda con el análisis de los tubos experimentales.
    1. En primer lugar, se establece un gráfico con CD45-APC y CD11b-PE, seguido de dos gráficos con CD68-FITC y CCR7 APC-Cy7. Recoja 50.000 eventos por muestra y, después de adquirir los datos, ajuste la compensación de fluorescencia.
    2. En los gráficos de pseudocolor CD45/CD11b, analice las "regiones" para las celdas CD11b+ CD45−/low y CD11b+ CD45high para cada muestra. A continuación, analice las células CD68+ CCR7+ y las células CD68+ CCR7- dentro de estas dos regiones.
    3. Integre los análisis para determinar los porcentajes de las siguientes poblaciones celulares: CD11b+ CD45−/bajo CD68+ CCR7+ (microglía tipo M1), CD11b+ CD45−/CD68+ CCR7- (microglía tipo M2), CD11b+ CD45 CD68+ CCR7+ alto (macrófagos tipo M1), CD11b+ CD45 CD68+ CCR7- alto (macrófagos tipo M2).
      NOTA: El porcentaje promedio de celdas marcadas positivamente se expresa como un porcentaje de la población total de la muestra.

7. Análisis de datos de FCM

  1. Inicie el software de análisis de citometría de flujo y arrastre los archivos del experimento de citometría de flujo a la sección "Todas las muestras" de la interfaz. Los experimentos de citometría de flujo se mostrarán debajo de "Todas las muestras" en la interfaz. Comience analizando el tubo de control del isotipo para determinar el umbral entre las señales de fluorescencia positivas y negativas.
    1. Haga doble clic en la muestra del tubo de control de isotipo para que aparezca una ventana gráfica que muestra un diagrama de puntos bidimensional. Seleccione FSC-A para el eje x y SSC-A para el eje y. Haga clic en el botón Puerta rectangular en la parte superior de la interfaz y use el rectángulo para seleccionar el área después de eliminar los desechos celulares (Figura 2A).
    2. Haga doble clic en el área seleccionada para generar una nueva ventana gráfica. Elija FITC para el eje x e Histograma para el eje y. Haga clic en el botón Region Gate en la parte superior de la interfaz para establecer una puerta en el histograma de un solo parámetro para determinar el umbral entre las señales de fluorescencia negativas y positivas. La puerta de la región definirá el área positiva (Figura 2A).
      NOTA: El área con valores FSC más pequeños representa desechos celulares.
    3. Para cada uno de los cuatro anticuerpos fluorescentes utilizados en el experimento, determine el umbral entre las señales negativas y positivas utilizando la muestra del tubo de control del isotipo. En el eje x, cambie secuencialmente los fluorocromos a PE, APC y APC-Cy7, manteniendo el eje y como histograma.
    4. Utilice la herramienta de puerta de región en el histograma de un solo parámetro para establecer puertas y determinar el umbral entre las señales negativas y positivas para cada uno de los cuatro anticuerpos fluorescentes (Figura 2A).
  2. Para analizar las proporciones de células similares a M1 y M2:
    1. Haga doble clic en la muestra de tubo experimental para que aparezca un diagrama de puntos bidimensional. Seleccione FSC-A para el eje x y SSC-A para el eje y. Haga clic en el botón Puerta rectangular en la parte superior de la interfaz y use el rectángulo para seleccionar el área después de eliminar los desechos celulares (Figura 2B).
    2. Haga doble clic en el área seleccionada para generar una nueva ventana gráfica. Elija CD11b-PE para el eje x y SSC-A para el eje y. Haga clic en el botón Puerta rectangular en la parte superior de la interfaz y, utilizando como referencia el umbral PE positivo/negativo establecido por el control de isotipo, defina la puerta CD11b+ (Figura 2B).
    3. Haga doble clic en el área de la puerta CD11b+ para generar una nueva ventana gráfica. Seleccione CD68-FITC para el eje x y CCR7 APC-Cy7 para el eje y. Haga clic en el botón Cross Gate . Utilizando como referencia los umbrales positivo/negativo FITC y APC-Cy7 establecidos por el control de isotipo, utilice la puerta cruzada para categorizar las células, determinando las proporciones de células CD11b+, CD68+, CCR7+ (similares a M1) y CD11b+ , CD68+ , CCR7- (similares a M2) (Figura 2B).
      NOTA: Los principios de compuerta para analizar las proporciones de macrófagos similares a M1 (Mø similar a M1), macrófagos similares a M2 (Mø similar a M2), microglía similar a M1 (MG similar a M1) y microglía similar a M2 (MG similar a M2) son consistentes con los utilizados para analizar células similares a M1 y M2. Los umbrales para distinguir las señales de fluorescencia positivas y negativas se basan en el tubo de control del isotipo, que sirve como referencia para establecer las puertas. El proceso de operación del software se ilustra en la Figura 2B, y los perfiles de expresión de marcadores utilizados para determinar las proporciones de celdas se describen en detalle en la sección de resultados representativos.

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Resultados

Las células inmunitarias del tejido de la médula espinal se separan mediante sílice coloidal recubierta con centrifugación en gradiente de densidad de polivinilpirrolidona. Durante el proceso de centrifugación, las células se distribuyen en diferentes capas de acuerdo con sus densidades de flotación, logrando así la separación celular (Figura 1). De arriba a abajo, la distribución es la siguiente: restos celulares, capa rica en células mononucleares, capa rica en linfocitos y, en la parte in...

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Discusión

La creación exitosa de un modelo animal de LME es esencial. El modelo de LME se estableció exponiendo la médula espinal en el segmento T9 a una fuerza de 0,5 N. El éxito del modelo animal quedó demostrado por la enroscamiento de la cola del ratón, ambas extremidades traseras experimentando espasmos y la parálisis de las extremidades posteriores, lo que imposibilitaba que el ratón caminara después de la LME (véase el paso 2.3). Los cuidados postoperatorios son fundamentales para la superv...

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Divulgaciones

No se declararon conflictos de interés.

Agradecimientos

Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 82072416); y el fondo del equipo de innovación científica y tecnológica de alto nivel del Primer Hospital Afiliado de la Facultad de Medicina de Bengbu (BYYFY2022TD001).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1&veces; PBS  SolarbioP1020
10&veces; PBS  SolarbioP1022
18 ratones C57/BL6 hembras de ocho semanas de edadCavens Laboratory Animal Ltd, Chang Zhou, China
Rata antiratón CCR7 marcado con APC-eFluor 780 (IgG2b kappa)Invitrogen47-1971-820.25μ g/prueba
Rata IgG2b marcada con APC-eFluor 780 Control de isotiposInvitrogen47-4321-820.25μ g/prueba
Rata anti-ratón CD45 marcado con APC (IgG2b kappa)Invitrogen17-0451-820.125μ g/prueba
Rata IgG2b etiquetada con APC Control de isotiposInvitrogen17-4031-820.125μ g/prueba
DMEMGibco11965092
Suero fetal bovinoLonseraS711-001
Rata anti-ratón CD68 marcado con FITC (IgG2b kappa)Invitrogen  MA5-166760.25μ g/prueba
Rata IgG2b etiquetada con FITC Control de isotiposInvitrogen11-4031-820.25μ g/prueba
ParaformaldehidoBiosharp23319084
Rata anti-ratón CD11b marcado con PE (IgG2b kappa)Invitrogen12-0112-810.25μ g/prueba
Rata IgG2b marcada con PE kappa  Control de isotiposInvitrogen12-4031-820.25μ g/prueba
Percoll  SolarbioP8370
Solución de tripsinaBiosharpBL526A

Referencias

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