Cell-free dot blot como plataforma de inmunoensayo práctica y adaptable para la detección de la respuesta de anticuerpos en sueros humanos y animales

Resumen

Describimos una plataforma de inmunoensayo recientemente desarrollada basada en los principios de la biología sintética libre de células y la técnica dot-blot para la detección personalizable de la respuesta de anticuerpos en sueros humanos y animales.

Resumen

La serie de brotes patógenos mundiales de las dos últimas décadas ha puesto de relieve la importancia de las estrategias de serovigilancia. Las plataformas de inmunoensayo que sirven para detectar anticuerpos específicos de la enfermedad en los sueros de los pacientes son el núcleo de la serovigilancia. Algunos ejemplos comunes son los ensayos de inmunoabsorción enzimática y los ensayos de flujo lateral; Sin embargo, si bien estos son métodos estándar de oro, requieren consumibles específicos para patógenos y equipos especializados, lo que limita su uso fuera de laboratorios con buenos recursos.

Recientemente hemos desarrollado una novedosa plataforma de inmunoensayo llamada Cell-Free Dot-Blot (CFDB) y la hemos validado utilizando sueros humanos y animales contra el SARS-CoV-2. A diferencia de los inmunoensayos convencionales, las muestras de suero de pacientes con CFDB se inmovilizan a una fase sólida (membrana de nitrocelulosa), mientras que el antígeno objetivo se suspende en la fase móvil del ensayo. Para mejorar el acceso a las capacidades de serovigilancia, los antígenos CFDB se producen bajo demanda y con una infraestructura de baja carga utilizando la expresión de proteínas in vitro . Aquí, el antígeno se fusiona con una etiqueta peptídica que se puede detectar utilizando una sola proteína reportera universal para cualquier ensayo CFDB. El resultado es que el CFDB no requiere acceso a un lector de placas de pocillos múltiples ni a componentes de ensayos moleculares comerciales purificados. Con estas consideraciones de diseño, CFDB aborda las deficiencias de las plataformas de inmunoensayo existentes al proporcionar accesibilidad a laboratorios no centralizados, adaptabilidad para patógenos emergentes y asequibilidad para las comunidades de bajos ingresos.

En el presente artículo, proporcionaremos un protocolo paso a paso para preparar y realizar un inmunoensayo CFDB. Utilizando nuestro trabajo reciente sobre el SARS-CoV-2 CFDB como ejemplo, cubriremos el diseño de ADN de antígenos para la producción libre de células bajo demanda, seguido de la preparación de la proteína reportera CFDB, la inmovilización de muestras de suero en la fase sólida y, finalmente, los pasos de unión y detección de antígenos del ensayo. Anticipamos que siguiendo estas instrucciones, los investigadores podrán adaptar el ensayo CFDB para detectar respuestas inmunitarias en sueros humanos y animales a cualquier patógeno dado.

Introducción

La pandemia de COVID-19 puso de manifiesto la necesidad crítica de contar con herramientas de diagnóstico asequibles y escalables, en particular para entornos de bajos recursos¹. Los inmunoensayos convencionales, como los ensayos de inmunoabsorción enzimática (ELISA), han demostrado ser esenciales para detectar respuestas inmunitarias ^2,3. Sin embargo, su alto costo, la dependencia de reactivos complejos y la dependencia de equipos especializados limitan su accesibilidad, especialmente durante las crisis sanitarias mundiales. En respuesta a estos desafí....

Protocolo

Todos los experimentos con hámsters se realizaron en el Laboratorio Nacional de Microbiología (NML) de la Agencia de Salud Pública de Canadá, aprobados por el Centro Canadiense de Ciencias para la Salud Humana y Animal, y siguiendo las directrices del Consejo Canadiense de Cuidado Animal. Todas las muestras de suero/plasma humano se obtuvieron comercialmente para pruebas internas o fueron proporcionadas por colaboradores clínicos al NML para pruebas independientes en el NML.

1. Diseño y preparación de plantillas de expresión lineal de antígenos (LETs)

1. Diseñar los LETs de expresión libre de células para el antíge....

Resultados

Amplificación por PCR de la plantilla de expresión lineal para el antígeno diana
Para amplificar por PCR el LET NP del SARS-CoV-2, se utilizaron cebadores universales Ter directos e inversos como se describe en la sección 1.2 del protocolo y se comprobó 1 μL del producto en un gel de agarosa (Figura 4) antes de proceder a la purificación del producto PCR.

Discusión

La COVID-19 ha puesto de manifiesto la importancia de contar con diagnósticos accesibles y sólidos para controlar los brotes de infección y optimizar las estrategias sanitarias mundiales. Las pruebas serológicas que detectan anticuerpos protectores resultaron esenciales para rastrear los patrones de transmisibilidad de las nuevas variantes, identificar los puntos calientes, guiar el desarrollo de vacunas, clasificar los casos sospechosos y proteger a las poblaciones vulnerables

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1 kb escalera de ADN	NEB	N3232	Utilizado como marcador de tamaño para geles de agarosa
20 Aminoácidos	Sigma-Aldrich	LAA21-1KT	Un componente de la reacción libre de células Solución B Punzón de
biopsia de 2 mm	Integra Miltex	33-31-P/25	Para la preparación de
clorhidrato de ácido 5-aminolevulínico de la rejilla maestra CFDB	Sigma-Aldrich	A3785	Precursor de hemo para la inducción de SpyCatcher2-Apex2
Polvo de agarosa	BioShop	AGA002	Para el análisis electroforético del ADN
Anti-SARS-CoV2-Nucleocápside anticuerpo	Sinobiológico	40588-T62	Para la detección WB del antígeno NP producido libremente
Bio-Rad ChemiDoc  XRS+	Bio-Rad	N/A Instrumento	generador de imágenes en gel
Concentradores centrífugos	Cytiva	28-9323-60	Para la concentración y el intercambio tampón de proteínas
Centrífuga	Eppendorf	EP022628257	Para la recolección de cultivos bacterianos
Coenzima  Un hidrato de sal de sodio (CoA)	Sigma-Aldrich	C3144	Un componente de la reacción libre de células Solución A
Color pre-teñido estándar (amplio rango)	NEB	P7719	Utilizado como marcador de tamaño para geles SDS-PAGE
de suero Covid-19	RayBiotech	CoV-PosSet	Sueros precaracterizados para la verificación y optimización de reactivos/condiciones
CFDBD-(&menos;)-3-Sal disódica del ácido fosfoglicérico (3-PGA)	Sigma-Aldrich	P8877	Un componente de la reacción libre de células Solución B
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	10197777001	Componente de los tampones
E. coli 5-alfa	NEB	C2987	para la preparación de plásmidos
E. coli BL21	NEB	C2530	Para la preparación de lisados libres de células
E. coli BL21 (DE3)	NEB	C2527	Para la expresión de SpyCatcher2-Apex2
Comprimido inhibidor de la proteasa sin EDTA	Sigma-Aldrich	11836153001	Un componente del tampón de lisis de E. coli
Eppendorf  Nuevo Brunswick   Incubadora Innova 43/43R Agitador	Eppendorf	EPM1320	Incubadora para el cultivo de células de E. coli para la expresión de proteínas y la preparación de lisado libre de células
Ácido folínico	Sigma-Aldrich	47612	Un componente de la solución de reacción libre de células A
Glicerol	Sigma-Aldrich	G9012	Componente de SpyCatcher2-Apex2 tampón de almacenamiento
Cloruro de Hemin	Sigma-Aldrich	H9039	Para la suplementación con hemo de SpyCatcher2-Apex2
Peróxido de hidrógeno 30%	Sigma-Aldrich	H1009	Para la fabricación de reactivos ECL
Software de laboratorio de imágenes	Bio-Rad	1709690	para el instrumento de imagen ChemiDoc gel
Isopropil-b-D-1-tiogalactopiranósido	Bioshop	IPT001	Para la inducción de SpyCatcher2-Apex2 expressikon
Sulfato de Kanamicina	Sigma-Aldrich	60615	Para la preparación de SpyCatcher2-Apex2 cultivo bacteriano
LB agar BioShop		LBL406	Para el crecimiento de E. coli
Caldo LB	BioShop	LBL407	Para el crecimiento de E. coli
luminol	Sigma-Aldrich	A4685	Para la fabricación de reactivo ECL
Lisozima	Sigma-Aldrich	L6876	Para la lisis de células bacterianas
Acetato de magnesio	Sigma-Aldrich	M5661	Un componente de la reacción libre de células Solución B
NEBExpress Resina Ni	NEB	S1428S	Para la purificación de SpyCatcher2-Apex2
Leche en polvo desnatada	Bioshop	SKI400	Para el bloqueo de membranas WB y CFDB
Parafilm	Bemis	2099-1337410	Para la incubación ECL de transferencias CFDB
p-cumárico	Sigma-Aldrich	C9008	Para la fabricación del reactivo ECL
pET24b-SpyCatcher2-Apex2 plásmido	Pardee Laboratorio	N/A	Utilizado para la expresión de la proteína SpyCatcher2-Apex2
Placa de Petri	Fisherbrand	FB0875712	Contenedor para incubación de membrana WB y CFDB
Solución salina tamponada con fosfato 10%	BioShop	PBS405	Componente de los tampones
Glutamato	Sigma-Aldrich	G1501	Un componente de la reacción libre de células Solución B
Oxalato de potasio monohidratado (ácido oxálico)	Sigma-Aldrich	223425	Un componente de la reacción libre de células Solución A
Gel prefabricado SDS-PAGE	BioRad	4561036EDU	Para el análisis electroforético de la proteína
Q5 ADN polimerasa de alta fidelidad	NEB	M0491	Para la amplificación por PCR de LETS
Kit de purificación QIAquick PCR	Qiagen	28106	Para la purificación de LETs
Juego de soluciones de ribonucleótidos	NEB	N0450S	Un componente de la reacción libre de células Solución A
Leche desnatada en polvo	BioShop	SKI400	Se utiliza como agente bloqueante para Western blot y CFDB
Cloruro de sodio	Sigma-Aldrich	S9625	Un componente de los tampones de purificación de proteínas
Sonicator	Qsonica	Q500	Para la lisis de células bacterianas
Espermidina	Sigma-Aldrich	S2626	Un componente de la reacción libre de células Solución A
Filtro de jeringa	Sigma-Aldrich	SLGSR33SS	Para la esterilización de tampones y soluciones
Termociclador	BioRad	T100	Instrumento para la incubación de reacciones de PCR
ARN de transferencia (ARNt)	Sigma-Aldrich	R8759	Un componente de la solución
salina tamponada	Thermo Scientific	J60764. K2	Componente de tampón de lavado WB y CFDB
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503	Para hacer tampón tris
Tunair SS-5012 Matraz de medio deflector para agitar, 2,5 L	Cole-Parmer	RK-01835-39	Recipiente para el cultivo de células de E. coli para la expresión de proteínas y la preparación de lisado libre de células
Tween-20	BioShop	TWN510	Componente del tampón de lavado WB y CFDB
Pinza	Almedic	7728-A10-100	Para el manejo de la membrana CFDB NC
Espectrofotómetro UV-Vis	Thermo Scientific	13400518	Se utiliza para la medición de la concentración de ácidos nucleicos y ADN y el cultivo bacteriano OD
de referencia internacional de la OMS para la inmunoglubulina anti-SARS-CoV-2	NISBC	20/268	Sueros precaracterizados para la verificación y optimización de reactivos/condiciones
CFDBβ-Nicotinamida adenina dinucleótido hidrato (NAD)	Sigma-Aldrich	10127965001	Un componente de la reacción libre de células Solución A

Panel ácido de potasio de reacción libre A Tris Panel