Describimos una plataforma de inmunoensayo recientemente desarrollada basada en los principios de la biología sintética libre de células y la técnica dot-blot para la detección personalizable de la respuesta de anticuerpos en sueros humanos y animales.
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Artículo de método
Cell-free dot blot como plataforma de inmunoensayo práctica y adaptable para la detección de la respuesta de anticuerpos en sueros humanos y animales
En este artículo
Resumen
Resumen
La serie de brotes patógenos mundiales de las dos últimas décadas ha puesto de relieve la importancia de las estrategias de serovigilancia. Las plataformas de inmunoensayo que sirven para detectar anticuerpos específicos de la enfermedad en los sueros de los pacientes son el núcleo de la serovigilancia. Algunos ejemplos comunes son los ensayos de inmunoabsorción enzimática y los ensayos de flujo lateral; Sin embargo, si bien estos son métodos estándar de oro, requieren consumibles específicos para patógenos y equipos especializados, lo que limita su uso fuera de laboratorios con buenos recursos.
Recientemente hemos desarrollado una novedosa plataforma de inmunoensayo llamada Cell-Free Dot-Blot (CFDB) y la hemos validado utilizando sueros humanos y animales contra el SARS-CoV-2. A diferencia de los inmunoensayos convencionales, las muestras de suero de pacientes con CFDB se inmovilizan a una fase sólida (membrana de nitrocelulosa), mientras que el antígeno objetivo se suspende en la fase móvil del ensayo. Para mejorar el acceso a las capacidades de serovigilancia, los antígenos CFDB se producen bajo demanda y con una infraestructura de baja carga utilizando la expresión de proteínas in vitro . Aquí, el antígeno se fusiona con una etiqueta peptídica que se puede detectar utilizando una sola proteína reportera universal para cualquier ensayo CFDB. El resultado es que el CFDB no requiere acceso a un lector de placas de pocillos múltiples ni a componentes de ensayos moleculares comerciales purificados. Con estas consideraciones de diseño, CFDB aborda las deficiencias de las plataformas de inmunoensayo existentes al proporcionar accesibilidad a laboratorios no centralizados, adaptabilidad para patógenos emergentes y asequibilidad para las comunidades de bajos ingresos.
En el presente artículo, proporcionaremos un protocolo paso a paso para preparar y realizar un inmunoensayo CFDB. Utilizando nuestro trabajo reciente sobre el SARS-CoV-2 CFDB como ejemplo, cubriremos el diseño de ADN de antígenos para la producción libre de células bajo demanda, seguido de la preparación de la proteína reportera CFDB, la inmovilización de muestras de suero en la fase sólida y, finalmente, los pasos de unión y detección de antígenos del ensayo. Anticipamos que siguiendo estas instrucciones, los investigadores podrán adaptar el ensayo CFDB para detectar respuestas inmunitarias en sueros humanos y animales a cualquier patógeno dado.
Introducción
La pandemia de COVID-19 puso de manifiesto la necesidad crítica de contar con herramientas de diagnóstico asequibles y escalables, en particular para entornos de bajos recursos1. Los inmunoensayos convencionales, como los ensayos de inmunoabsorción enzimática (ELISA), han demostrado ser esenciales para detectar respuestas inmunitarias 2,3. Sin embargo, su alto costo, la dependencia de reactivos complejos y la dependencia de equipos especializados limitan su accesibilidad, especialmente durante las crisis sanitarias mundiales. En respuesta a estos desafíos, desarrollamos el Cell-Free Dot Blot (CFDB), una plataforma de inmunoensayo adaptable y de bajo costo diseñada para la detección de anticuerpos anti-SARS-CoV-2 en sueros humanos y animales.
CFDB aprovecha la biología sintética libre de células para la producción rápida y bajo demanda de antígenos virales utilizando plantillas lineales de ADN 4,5. Esto elimina la necesidad de procesos tradicionales de clonación, expresión y purificación basados en células, lo que acelera significativamente la producción de antígenos y reduce los costos. El método CFDB simplifica la detección de anticuerpos mediante el uso de un formato de transferencia de puntos, en el que los sueros se manchan directamente en las membranas de nitrocelulosa. Este sistema evita la necesidad de costosas placas de pocillos múltiples y equipos de laboratorio especializados, lo que permite un flujo de trabajo de "inmersión" simple para los pasos de incubación y lavado. La plataforma también utiliza un sistema SpyCatcher-SpyTag, donde una quimera peroxidasa SpyCatcher2-Apex2 actúa como reactivo de detección secundaria universal 5,6. Esto se produce utilizando la expresión estándar basada en Escherichia coli, lo que elimina la dependencia de costosos conjugados de anticuerpos comerciales. Como resultado, el sistema CFDB puede realizar ensayos serológicos con un rendimiento comparable al de los ELISA a un costo significativamente menor: alrededor de $3 USD por ensayo de 96 muestras en comparación con más de $300 USD para un kit ELISA comercial5.
Para demostrar la eficacia de CFDB, probamos su capacidad para detectar anticuerpos en sueros humanos y animales precaracterizados. Nuestros resultados se correlacionaron estrechamente con ELISA en la identificación de muestras positivas y negativas de COVID-19. Además del diagnóstico en humanos, evaluamos la utilidad de CFDB en modelos animales, analizando sueros de hámsteres infectados con SARS-CoV-2 y vacunados con proteína nucleocápside recombinante. Estas pruebas confirmaron el potencial de CFDB para su uso tanto en el diagnóstico humano como en el veterinario, lo que lo convierte en una herramienta versátil para monitorear las respuestas inmunitarias en todas las especies. Una de las principales ventajas de CFDB es su flexibilidad. Con solo modificar la plantilla de ADN que codifica el antígeno de interés, la plataforma se puede adaptar rápidamente para detectar anticuerpos contra diferentes patógenos, lo que la hace valiosa para la preparación ante futuras pandemias. Su bajo costo, flujo de trabajo simple y requisitos mínimos de infraestructura lo hacen particularmente adecuado para laboratorios descentralizados y entornos de bajos recursos, donde el acceso a los diagnósticos comerciales es limitado.
En este trabajo, proporcionaremos instrucciones paso a paso para preparar y realizar un ensayo CFDB. En primer lugar, abordamos el diseño y la síntesis de plantillas lineales de ADN para la producción libre de células de antígenos, que son los principales reactivos de detección del ensayo. A continuación, describimos los pasos para la preparación del reactivo de detección secundaria del ensayo SpyCatcher2-Apex2. Después de eso, proporcionamos instrucciones para la producción libre de células y el control de calidad de los antígenos mismos. Finalmente, describimos en detalle el proceso para realizar un ensayo de CFDB en muestras de suero humano o animal.
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Protocolo
Todos los experimentos con hámsters se realizaron en el Laboratorio Nacional de Microbiología (NML) de la Agencia de Salud Pública de Canadá, aprobados por el Centro Canadiense de Ciencias para la Salud Humana y Animal, y siguiendo las directrices del Consejo Canadiense de Cuidado Animal. Todas las muestras de suero/plasma humano se obtuvieron comercialmente para pruebas internas o fueron proporcionadas por colaboradores clínicos al NML para pruebas independientes en el NML.
1. Diseño y preparación de plantillas de expresión lineal de antígenos (LETs)
- Diseñar los LETs de expresión libre de células para el antígeno diana basándose en las instrucciones de Norouzi et al.7 y que contengan un SpyTag N/C-terminal como se describe en Norouzi et al.5.
NOTA: Aquí proporcionamos detalles para la preparación de la proteína de la nucleocápside del SARS-CoV-2 (NP, aminoácidos 2-419).- Asegúrese de que el LET para el NP del SARS-CoV-2 (Figura 1 y Archivo complementario 1) contenga sitios Ter 5' y 3' con una secuencia de tampón de 50 pares de bases antes del promotor T7 y después del codón de parada.
- Marque la proteína NP en el extremo N-terminal con su 6-SpyTag-TEV.
- Obtenga la secuencia de proteínas de la base de datos UniProt (código de acceso P0DTC9) y optimícela para la expresión basada en E. coli utilizando la herramienta de optimización de codones IDT8. Solicite esta secuencia para la síntesis comercial como un fragmento de ADN monocatenario resuspendido en agua a 10 ng/μL.
NOTA: El sitio de escisión de la proteasa TEV y la etiqueta His6 no son características esenciales en el diseño LET.
- La PCR amplifica el fragmento de ADN con el Ter FW universal (GGCTCCGAATAAGTGTTGTAACTAAAGTGCGGCC
ACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCG) y Ter RV (CCGAGGCAATAAGTGTTGTAACTAAAGTGCTCAG
CTTCCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGCC) utilizando el kit de ADN polimerasa de alta fidelidad (ver la Tabla de Materiales)- Configure una reacción de 100 μL de la siguiente manera: 75 μL de agua libre de nucleasas, 20 μL de tampón de ADN polimerasa 5x, 2 μL de dNTP de 10 mM (concentración final de 200 μM), 0,5 μL de cebador Ter-FW de 100 μM, 0,5 μL de cebador Ter-RV de 100 μM, 1 μL de LET monocatenario de 10 ng/μL, 1 μL (2U) de ADN polimerasa.
- Utilice los siguientes ajustes de PCR: desnaturalización inicial a 98 °C durante 30 s; 35 ciclos: 98 °C durante 6 s, 60 °C durante 15 s, 72 °C durante 90 s; mantener a 4 °C.
- Purifique el producto de PCR utilizando un kit de purificación de PCR comercial, verifique su calidad ejecutando una muestra en un gel de agarosa al 1% y mida su concentración en un espectrofotómetro UV-Vis.
NOTA: Los productos de PCR crudos también se pueden usar directamente para la expresión sin células. Sin embargo, la purificación permite un procedimiento más estandarizado.
Figura 1: Plantilla de expresión lineal para SARS-CoV-2-NP. Un esquema que representa las características de la plantilla de ADN lineal His-SpyTag-SARS-CoV-2 NP. Los elementos clave de la plantilla de ADN están etiquetados. La secuencia codificante de la proteína de interés, en este caso la NP, se coloca bajo el control transcripcional de un promotor T7 para una expresión eficiente. En el extremo N, a la proteína NP se le añade una etiqueta SpyTag para la detección específica utilizando el reactivo de detección SpyCatcher2-Apex2. Los sitios de proteasa x6His-tag y TEV, aunque se incluyen como parte del diseño general de LET, son prescindibles para fines de CFDB. En el extremo de la plantilla lineal de ADN, se incluyen los sitios Ter "aguas arriba" y "aguas abajo", cada uno precedido por secuencias tampón de 50 pares de bases respectivas, para la protección mediada por Tus contra la degradación del ADN exonucleolítico en el lisado libre de células. Abreviaturas: NP = proteína nucleocápside; LET = plantilla de expresión lineal; TEV = virus del grabado del tabaco; CFDB = transferencia de puntos sin celdas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
2. Purificación de la proteína reportera SpyCatcher2-Apex2
- Utilice el plásmido pET24b-SpyCatcher2-Apex2, construido originalmente en Norouzi et al.5 (secuencia completa en el Archivo Suplementario 2 y mapa de plásmidos en la Figura Suplementaria S1) para preparar la proteína reportera SpyCatcher2-Apex-2.
- Prepare placas de agar y caldo de lisogénia (LB) que contenga 50 μg/mL de kanamicina. Transforme células de E. coli BL21 (DE3) con el plásmido pET24b-SpyCatcher2-Apex2. Inocular una sola colonia en un cultivo iniciador de LB de 15 mL y cultivar durante la noche a 37 °C con agitación a 250 RPM.
- Al día siguiente, agregue 10 mL del cultivo iniciador en 500 mL de medio LB fresco que contenga 50 μg/mL de kanamicina. Incubar a 37 °C con agitación a 250 RPM hasta que el cultivo alcance una densidad óptica a 600 nm de 0,6-0,8 (~3 h).
- Inducir la expresión de SpyCatcher2-Apex2 suplementando el cultivo con 0,5 mM de isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido y 1 mM de clorhidrato de ácido 5-aminolevulínico. Reduzca la temperatura de crecimiento a 30 °C y deje que el cultivo se incube durante otras 4 h.
- Recolectar las bacterias por centrifugación a 8.000 × g durante 15 min. Proceda a la lisis celular o, alternativamente, almacene el pellet a -80 °C hasta su uso.
- Vuelva a suspender el pellet en 20 mL de tampón de lisis que contenga 50 mM de Tris-HCl (pH 7,8), 300 mM de NaCl, 1 mg/mL de lisozima, comprimido inhibidor de la proteasa sin EDTA y 1 mM de ditiotreitol (DTT). Lisar las células por sonicación al 50 % de amplitud con intervalos de 5 s ON y 10 s OFF durante un tiempo total de ON de 3 min.
- Clarificar el lisado por centrifugación a 20.000 × g durante 1 h a 4 °C. Pase el sobrenadante a través de un filtro de jeringa de 0,2 μm.
- Añadir cloruro de hemina hasta una concentración final de 250 μM al lisado clarificado e incubar durante la noche a 4 °C. Proceda a la purificación de proteínas.
NOTA: La incubación con cloruro de hemina maximiza la incorporación de hemo en la peroxidasa Apex-2 para una actividad enzimática óptima. - Añadir 2,5 mL de resina de Ni al lisado clarificado e incubar a 4 °C agitando suavemente durante 45 min. Aplique la mezcla a una columna de flujo por gravedad y lave la resina con 50 mL de tampón Tris (50 mM de Tris-HCl (pH 7,8), 300 mM de NaCl y 1 mM de DTT).
- Eluir la proteína SpyCatcher2-Apex2 en 25 mL de tampón Tris que contiene 400 mM de imidazol. El concentrado y el tampón intercambian el eluido en tampón Tris utilizando una unidad de filtro centrífugo, con el objetivo de obtener un volumen final de 0,5-1,0 mL.
- Utilice el coeficiente de extinción molar de SpyCatcher2-Apex2 (27.390 M-1 cm-1) para determinar la concentración de proteínas en un espectrofotómetro UV-Vis. Añadir glicerol hasta una concentración final del 40% y almacenar las alícuotas a -20 °C.
NOTA: Se espera que este protocolo produzca aproximadamente 40 mg de SpyCatcher2-Apex2 altamente puro y activo, suficiente para 400 ejecuciones de CFDB en un tamaño de transferencia estándar de 96 muestras. - Para la detección de proteínas SpyTagged utilizando Western blot9 convencional y para experimentos con CFDB, siempre bloquee las membranas en leche en polvo descremada al 5% en solución salina tamponada con 1x Tris que contenga 0,05% de Tween-20 (TBST). Utilice la proteína SpyCatcher2-Apex2 a una concentración final de 10 μg/mL en solución bloqueante.
NOTA: El reportero SpyCatcher2-Apex2 requiere una solución de quimioluminiscencia mejorada (ECL) para el desarrollo de señales. La solución ECL puede obtenerse comercialmente o prepararse internamente de acuerdo con las instrucciones de Mruk et al.10. La solución final de ECL aquí consiste en 0,4 mM de ácido p-cumárico, 2,5 mM de luminol y 0,015% deH2O2 en 100 mM de Tris-HCl (pH 8,6).
3. Producción libre de células y control de calidad de antígenos
- Prepare y ensamble un lisado de expresión libre de células y componentes de reacción de E. coli BL21 siguiendo las instrucciones de Levine et al.11 y Norouzi et al.5. Complemente la mezcla de reacción final con 5 μM de proteína Tus y 1,2 μM de ARN polimerasa T7 de la siguiente manera para una reacción representativa de 100 μL: 14,6 μL de solución A, 14 μL de solución B, 33,3 μL de lisado BL21 de E. coli , 2,5 μL de proteína Tus 200 mM, 1,2 μL de ARN polimerasa T7 100 mM, 1 μL de molde de ADN lineal de 1,5 μM, 33,4 μL de agua libre de nucleasas.
NOTA: Consulte el Archivo Suplementario 3 para obtener instrucciones clave sobre cómo preparar un lisado libre de células de E. coli BL21 y la Tabla Suplementaria S1 para obtener una receta detallada de las Soluciones A y B. El sistema de expresión libre de células de E. coli también se puede preparar utilizando protocolos alternativos u obtener comercialmente, siempre que la reacción se complemente con Tus y ARN polimerasa T7. - Realice una prueba de expresión inicial a escala de 5 μL añadiendo un 10% (v/v) de producto de PCR crudo a la reacción libre de células en un tubo de PCR. Incubar sin agitar a 30 °C durante 15 h.
- Compruebe la calidad de expresión del antígeno NP cargando 1 μL de la reacción libre de células en un gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio al 12% (SDS-PAGE) y posteriormente transfiéralo a una membrana de nitrocelulosa para Western blot como se describe en el paso 2.12. Utilice la proteína reportera SpyCatcher2-Apex2 para el etiquetado de la transferencia a través de SpyTag y, opcionalmente, un anticuerpo comercial específico (en este caso, un anti-SARS-CoV-2-NP) contra el antígeno objetivo.
- Ensamble una reacción libre de células a escala de 1 mL con un producto LET purificado de 15 nM para utilizarlo en el ensayo CFDB. Incubar la mezcla de expresión en un tubo cónico de 15 mL agitando a 80 rpm durante 15 h a 30 °C. Compruebe la calidad de la expresión con Western blot y almacene 50 μL de alícuotas a -20 °C.
4. Muestras de suero
- Obtener muestras de suero (o plasma) humano/animal de fuentes comerciales o colaboradores clínicos o internamente utilizando procedimientos estándar y siguiendo las pautas del comité institucional de ética de investigación humana o del comité de cuidado y uso animal. Asegúrese de que se han tomado las medidas adecuadas de pretratamiento de la muestra para mitigar los riesgos de contaminación.
NOTA: Las medidas de pretratamiento pueden incluir tratamiento con solvente-detergente, inactivación por calor y pruebas de marcadores de virus transmitidos por la sangre. Se dispone de un protocolo útil para el aislamiento sérico y plasmático de sangre total12. Al igual que con otras plataformas de inmunoensayo, no se espera que las muestras de suero recolectadas temprano (<3 semanas) después de la infección inicial o el inicio de la enfermedad contengan niveles adecuados de una respuesta de anticuerpos y sus resultados deben tratarse con precaución. - Para la verificación de la calidad de los reactivos NP CFDB del SARS-CoV-2, utilice el panel de referencia internacional de la Organización Mundial de la Salud (OMS) del Instituto Nacional de Normas y Control Biológicos (NIBSC) para la inmunoglobulina anti-SARS-CoV-2, que contiene x1 muestras pre-COVID-19 y x4 muestras positivas para el SARS-CoV-2 con niveles variables de inmunoglobulinas anti-NP13. Alternativamente, use muestras de suero sanas y positivas precaracterizadas de otras fuentes.
- En el caso de los experimentos con CFDB, obtenga o prepare una muestra de control negativa agrupando varias (>3) muestras de suero sano para aumentar la precisión y facilitar el análisis y la interpretación de los resultados.
5. Procedimiento de transferencia de puntos sin células (CFDB)
- Descargue e imprima el archivo de imagen de la cuadrícula maestra (Figura complementaria S2). La rejilla maestra es un patrón de 6 x 6 cm que contiene 12 x 12 círculos de 2 mm de diámetro cada uno y proporciona una capacidad de detección similar a una placa de 96 pocillos.
- Intercala firmemente la rejilla entre dos capas de película adhesiva de sellado de placa PCR y córtela a medida a lo largo de los bordes exteriores de la rejilla. Use un punzón de biopsia de 2 mm para ahuecar cada círculo marcado.
NOTA: Esta rejilla maestra se puede reutilizar varias veces después de limpiarla con etanol al 70%. - Corte un trozo de membrana de nitrocelulosa de 6,5 x 6,5 cm y colóquelo debajo de la rejilla maestra sobre una superficie limpia, asegurando la configuración con cinta adhesiva como se muestra en la Figura 2 y la Figura complementaria S3. Utilice un rotulador para marcar las posiciones de los círculos más exteriores de la membrana de nitrocelulosa que se utilizará como guía para cortar la membrana después de la detección de la muestra.
- Diluir las muestras de suero 1/10 en solución salina tamponada con fosfato 1x (pH 7,4). Utilice una micropipeta para dispensar volúmenes triplicados de 0,4 μL de cada muestra en la membrana de nitrocelulosa en posiciones de rejilla predeterminadas. Se necesitarán aproximadamente 15 s por punto para dispensar.
NOTA: Asegúrese de incluir muestras de control negativas y positivas con cada ensayo, ya que esto será necesario para el análisis de los resultados. - Espere 10 minutos a temperatura ambiente para que las muestras manchadas se unan y sequen. Con unas pinzas, recupere con cuidado la membrana de nitrocelulosa y corte a lo largo de los círculos exteriores marcados.
- Bloquee la membrana en 10 mL de solución bloqueante (5% de leche en polvo descremada en TBST) en una placa de Petri de 10 cm durante 30 min a temperatura ambiente, agitando suavemente a 100 RPM.
- Descongele y añada una alícuota de 50 μL de la mezcla de expresión de antígeno libre de células a 5 mL de solución de bloqueo en una placa de Petri de 10 cm. Transfiera la membrana directamente a esta solución que contiene antígeno e incube a temperatura ambiente durante 1 h, agitando a 100 RPM.
NOTA: Este será el paso de detección principal en el que el antígeno SpyTagged se unirá a las posiciones puntuales que contienen anticuerpos, si están presentes. - Enjuague la membrana, lávela durante 5 minutos y vuelva a enjuagar en TBST antes de continuar con el paso de detección secundario.
- Incubar la membrana en 10 mL de tampón de bloqueo que contenga 10 μg/mL de proteína SpyCatcher2-Apex2 purificada, durante 1 h mientras se agita a 100 RPM.
- Enjuague la membrana y lave 2 x 5 min en TBST, con un enjuague final en TBS.
- Pegue y asegure un trozo de parafilm en un área de trabajo limpia cerca del instrumento de adquisición de imágenes de mancha. Retire el exceso de líquido golpeando la membrana con unas pinzas y coloque la membrana encima del parafilm.
- Añada inmediatamente 3 mL (100 μL/cm2) de solución de ECL sobre la membrana e incube a temperatura ambiente durante exactamente 90 s.
- Seque inmediatamente la membrana y transfiérala a un instrumento de imágenes compatible con la quimioluminiscencia para la visualización de los resultados.
NOTA: El tiempo óptimo de obtención de imágenes puede variar en diferentes instrumentos. Se recomienda utilizar los ajustes de tiempo de adquisición automática predeterminados del instrumento y, si están ausentes, utilizar muestras de suero precaracterizadas para optimizar el tiempo de adquisición de imágenes. - Utilice la función de análisis de imágenes del instrumento para obtener intensidades puntuales, incluso para tres posiciones en blanco (fondo) en la membrana de nitrocelulosa; Mantenga un volumen de medición constante por punto. Exporte los datos a una hoja de cálculo, recordando etiquetar correctamente cada posición de punto.
- Calcule la media y la desviación estándar (DE) de las intensidades puntuales por triplicado. A continuación, reste el fondo de la membrana de nitrocelulosa de todas las muestras.
- Utilice la siguiente ecuación para obtener un valor de corte para la interpretación de los resultados de -/+:
(Media de los controles negativos) + (3 x DE de los controles negativos). Considere las muestras positivas si su intensidad media cae por encima del valor de corte y negativas si su intensidad media cae por debajo del valor de corte.
NOTA: En la Figura 3 se proporciona un esquema del procedimiento CFDB.
Figura 2: Ensamblaje de CFDB. Un esquema de la rejilla maestra CFDB y la configuración del ensamblaje de membrana NC. La rejilla maestra se superpone a la membrana NC para proporcionar un patrón regular y direccionable para la detección e inmovilización de muestras de suero. Abreviaturas: CFDB = transferencia de puntos sin células; NC = nitrocelulosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Una representación esquemática del flujo de trabajo de CFDB. En un ensayo CFDB, una pequeña cantidad (<0,4 μL) de muestras de suero diluido 10x se dispensa manualmente en una membrana de nitrocelulosa precortada (panel izquierdo) en ubicaciones discretas y direccionables (panel central). Depositar una muestra de suero por mancha por triplicado e inmovilizar el contenido de proteína, incluido el reservorio total de anticuerpos del suero, sobre el sustrato NC sólido (manchas beige en el panel central). En este ejemplo, los anticuerpos anti-NP contenidos en las muestras de suero pueden ser unidos primero por el reactivo de detección primaria CFDB SpyTag-NP y finalmente detectados por el reactivo de detección secundaria CFDB SpyCatcher2-Apex2 (burbuja ampliada en el panel derecho). Esta figura fue tomada de Norouzi et al.5. Abreviaturas: CFDB = transferencia de puntos sin células; NP = proteína de la nucleocápside; LET = plantilla de expresión lineal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Resultados
Amplificación por PCR de la plantilla de expresión lineal para el antígeno diana
Para amplificar por PCR el LET NP del SARS-CoV-2, se utilizaron cebadores universales Ter directos e inversos como se describe en la sección 1.2 del protocolo y se comprobó 1 μL del producto en un gel de agarosa (Figura 4) antes de proceder a la purificación del producto PCR.
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Discusión
La COVID-19 ha puesto de manifiesto la importancia de contar con diagnósticos accesibles y sólidos para controlar los brotes de infección y optimizar las estrategias sanitarias mundiales. Las pruebas serológicas que detectan anticuerpos protectores resultaron esenciales para rastrear los patrones de transmisibilidad de las nuevas variantes, identificar los puntos calientes, guiar el desarrollo de vacunas, clasificar los casos sospechosos y proteger a las poblaciones vulnerables
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Divulgaciones
M.N. y K.P. son coinventores del método de transferencia de puntos sin células. Se ha presentado una solicitud provisional de patente relacionada con esta obra (PCT/CA2024/050097, presentada en enero de 2024).
Agradecimientos
S.S. y R.Z. cuentan con el apoyo financiero de la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Defensa (DARPA), Contrato No. N66001-23-2-4042. Los puntos de vista, opiniones y/o hallazgos expresados son los de los autores y no deben interpretarse como representativos de los puntos de vista o políticas oficiales del Departamento de Defensa o del Gobierno de los EE. UU. Este trabajo fue apoyado por fondos para K.P. del programa de subvenciones de la Fundación CIHR (201610FDN-375469), el Programa de Cátedras de Investigación de CIHR Canadá (950-231075 y 950-233107), la Iniciativa de Medicina por Diseño de la Universidad de Toronto, que recibe fondos del Fondo de Excelencia en Investigación de Canadá y fondos para K.P., del Programa Canadiense de Seguridad y Protección de Investigación y Desarrollo de Defensa de Canadá (contrato 39903-200137). La Figura 1 y la Figura Complementaria S1 se crearon utilizando SnapGene Viewer.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1 kb escalera de ADN | NEB | N3232 | Utilizado como marcador de tamaño para geles de agarosa |
| 20 Aminoácidos | Sigma-Aldrich | LAA21-1KT | Un componente de la reacción libre de células Solución B Punzón de |
| biopsia de 2 mm | Integra Miltex | 33-31-P/25 | Para la preparación de |
| clorhidrato de ácido 5-aminolevulínico de la rejilla maestra CFDB | Sigma-Aldrich | A3785 | Precursor de hemo para la inducción de SpyCatcher2-Apex2 |
| Polvo de agarosa | BioShop | AGA002 | Para el análisis electroforético del ADN |
| Anti-SARS-CoV2-Nucleocápside anticuerpo | Sinobiológico | 40588-T62 | Para la detección WB del antígeno NP producido libremente |
| Bio-Rad ChemiDoc XRS+ | Bio-Rad | N/A Instrumento | generador de imágenes en gel |
| Concentradores centrífugos | Cytiva | 28-9323-60 | Para la concentración y el intercambio tampón de proteínas |
| Centrífuga | Eppendorf | EP022628257 | Para la recolección de cultivos bacterianos |
| Coenzima Un hidrato de sal de sodio (CoA) | Sigma-Aldrich | C3144 | Un componente de la reacción libre de células Solución A |
| Color pre-teñido estándar (amplio rango) | NEB | P7719 | Utilizado como marcador de tamaño para geles SDS-PAGE |
| de suero Covid-19 | RayBiotech | CoV-PosSet | Sueros precaracterizados para la verificación y optimización de reactivos/condiciones |
| CFDBD-(&menos;)-3-Sal disódica del ácido fosfoglicérico (3-PGA) | Sigma-Aldrich | P8877 | Un componente de la reacción libre de células Solución B |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 10197777001 | Componente de los tampones |
| E. coli 5-alfa | NEB | C2987 | para la preparación de plásmidos |
| E. coli BL21 | NEB | C2530 | Para la preparación de lisados libres de células |
| E. coli BL21 (DE3) | NEB | C2527 | Para la expresión de SpyCatcher2-Apex2 |
| Comprimido inhibidor de la proteasa sin EDTA | Sigma-Aldrich | 11836153001 | Un componente del tampón de lisis de E. coli |
| Eppendorf Nuevo Brunswick Incubadora Innova 43/43R Agitador | Eppendorf | EPM1320 | Incubadora para el cultivo de células de E. coli para la expresión de proteínas y la preparación de lisado libre de células |
| Ácido folínico | Sigma-Aldrich | 47612 | Un componente de la solución de reacción libre de células A |
| Glicerol | Sigma-Aldrich | G9012 | Componente de SpyCatcher2-Apex2 tampón de almacenamiento |
| Cloruro de Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | Para la suplementación con hemo de SpyCatcher2-Apex2 |
| Peróxido de hidrógeno 30% | Sigma-Aldrich | H1009 | Para la fabricación de reactivos ECL |
| Software de laboratorio de imágenes | Bio-Rad | 1709690 | para el instrumento de imagen ChemiDoc gel |
| Isopropil-b-D-1-tiogalactopiranósido | Bioshop | IPT001 | Para la inducción de SpyCatcher2-Apex2 expressikon |
| Sulfato de Kanamicina | Sigma-Aldrich | 60615 | Para la preparación de SpyCatcher2-Apex2 cultivo bacteriano |
| LB agar BioShop | LBL406 | Para el crecimiento de E. coli | |
| Caldo LB | BioShop | LBL407 | Para el crecimiento de E. coli |
| luminol | Sigma-Aldrich | A4685 | Para la fabricación de reactivo ECL |
| Lisozima | Sigma-Aldrich | L6876 | Para la lisis de células bacterianas |
| Acetato de magnesio | Sigma-Aldrich | M5661 | Un componente de la reacción libre de células Solución B |
| NEBExpress Resina Ni | NEB | S1428S | Para la purificación de SpyCatcher2-Apex2 |
| Leche en polvo desnatada | Bioshop | SKI400 | Para el bloqueo de membranas WB y CFDB |
| Parafilm | Bemis | 2099-1337410 | Para la incubación ECL de transferencias CFDB |
| p-cumárico | Sigma-Aldrich | C9008 | Para la fabricación del reactivo ECL |
| pET24b-SpyCatcher2-Apex2 plásmido | Pardee Laboratorio | N/A | Utilizado para la expresión de la proteína SpyCatcher2-Apex2 |
| Placa de Petri | Fisherbrand | FB0875712 | Contenedor para incubación de membrana WB y CFDB |
| Solución salina tamponada con fosfato 10% | BioShop | PBS405 | Componente de los tampones |
| Glutamato | Sigma-Aldrich | G1501 | Un componente de la reacción libre de células Solución B |
| Oxalato de potasio monohidratado (ácido oxálico) | Sigma-Aldrich | 223425 | Un componente de la reacción libre de células Solución A |
| Gel prefabricado SDS-PAGE | BioRad | 4561036EDU | Para el análisis electroforético de la proteína |
| Q5 ADN polimerasa de alta fidelidad | NEB | M0491 | Para la amplificación por PCR de LETS |
| Kit de purificación QIAquick PCR | Qiagen | 28106 | Para la purificación de LETs |
| Juego de soluciones de ribonucleótidos | NEB | N0450S | Un componente de la reacción libre de células Solución A |
| Leche desnatada en polvo | BioShop | SKI400 | Se utiliza como agente bloqueante para Western blot y CFDB |
| Cloruro de sodio | Sigma-Aldrich | S9625 | Un componente de los tampones de purificación de proteínas |
| Sonicator | Qsonica | Q500 | Para la lisis de células bacterianas |
| Espermidina | Sigma-Aldrich | S2626 | Un componente de la reacción libre de células Solución A |
| Filtro de jeringa | Sigma-Aldrich | SLGSR33SS | Para la esterilización de tampones y soluciones |
| Termociclador | BioRad | T100 | Instrumento para la incubación de reacciones de PCR |
| ARN de transferencia (ARNt) | Sigma-Aldrich | R8759 | Un componente de la solución |
| salina tamponada | Thermo Scientific | J60764. K2 | Componente de tampón de lavado WB y CFDB |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | Para hacer tampón tris |
| Tunair SS-5012 Matraz de medio deflector para agitar, 2,5 L | Cole-Parmer | RK-01835-39 | Recipiente para el cultivo de células de E. coli para la expresión de proteínas y la preparación de lisado libre de células |
| Tween-20 | BioShop | TWN510 | Componente del tampón de lavado WB y CFDB |
| Pinza | Almedic | 7728-A10-100 | Para el manejo de la membrana CFDB NC |
| Espectrofotómetro UV-Vis | Thermo Scientific | 13400518 | Se utiliza para la medición de la concentración de ácidos nucleicos y ADN y el cultivo bacteriano OD |
| de referencia internacional de la OMS para la inmunoglubulina anti-SARS-CoV-2 | NISBC | 20/268 | Sueros precaracterizados para la verificación y optimización de reactivos/condiciones |
| CFDBβ-Nicotinamida adenina dinucleótido hidrato (NAD) | Sigma-Aldrich | 10127965001 | Un componente de la reacción libre de células Solución A |
Referencias
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- Amanat, F., et al. A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans. Nat Med. 26 (7), 1033-1036 (2020).
- Stadlbauer, D., et al. SARS-CoV-2 seroconversion in humans: A detailed protocol for a serological assay, antigen production, and test setup. Curr Protoc Microbiol. 57 (1), e100(2020).
- Pardee, K., et al. Portable, on-demand biomolecular manufacturing. Cell. 167 (1), 248-259.e12 (2016).
- Norouzi, M., et al. Cell-free dot blot: an ultra-low-cost and practical immunoassay platform for detection of anti-SARS-CoV-2 antibodies in human and animal sera. Microbiol Spectr. 11 (2), e0245722(2023).
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- Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. J Vis Exp. (144), (2019).
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