Un flujo de trabajo computacional bilingüe para identificar posibles inhibidores de PLK1 en la lengua de signos americana y en inglés

Summary

Este protocolo bilingüe proporciona un flujo de trabajo computacional de descubrimiento de fármacos que evalúa las interacciones proteína-ligando de quinasas tipo polo 1 a 3 (PLK1–3) y de las propiedades de absorción, distribución, metabolismo, excreción, toxicidad y estabilidad (ADMET-S) de moléculas naturales procedentes de bases de datos.

Abstract

La quinasa tipo polo 1 (PLK1) desempeña funciones esenciales en las fases S, G2 y M del ciclo celular, y su sobreexpresión se observa frecuentemente en múltiples tipos de cáncer, incluido el cáncer de mama, donde contribuye a la inestabilidad genómica y a la apoptosis desregulada. A diferencia de los inhibidores ATP-competitivos convencionales que actúan sobre el dominio quinasa, la inhibición selectiva del dominio polo-box (PBD) de PLK1 ofrece una estrategia prometedora para interrumpir las interacciones proteína-ligando, críticas para la progresión mitótica, desencadenando así la apoptosis en células cancerosas. Sin embargo, la alta similitud estructural entre PLK1 y sus homólogos (PLK2 y PLK3), que son vitales para la función neurológica y la respuesta al estrés, respectivamente, requiere una selectividad excepcional para evitar efectos fuera del objetivo. Para abordar este desafío, el protocolo implica un flujo de trabajo computacional bilingüe (Lengua de Signos Americana e inglés) que integra cribado virtual, agrupamiento estructural, acoplamiento proteína-ligando, predicción de afinidad de unión, perfilado ADMET-S y análisis de estabilidad cuántica (QM). A partir de la base de datos de productos naturales SuperNatural 3.0, los compuestos se filtraron utilizando criterios de relevancia y semejanza del cáncer de mama, agrupados para asegurar la diversidad química y evaluaron sus interacciones con las estructuras PLK1-, PLK2- y PLK3-PBD. Aunque el acoplamiento virtual y las evaluaciones in silico ADMET-S no pueden confirmar de forma definitiva la selectividad o el mecanismo de acción, este estudio genera hipótesis comprobables y prioriza un conjunto enfocado de candidatos derivados de productos naturales para futuras simulaciones de dinámica molecular, validación bioquímica o cribado experimental.

Introduction

Las quinasas tipo polo (PLKs) son una familia de quinasas proteicas estructuralmente compuesta por un dominio N-terminal y un C-terminal que consiste en uno o dos dominios polo-box (PBD)^1,2.  El número y la diversidad funcional de estos dominios de polobox varían entre los distintos miembros de la familia PLK. PLK1 está involucrado en las fases S, G2 y M de la división celular. En el ciclo celular, PLK1 funciona como un punto de control de daño del ADN en la fase S y como regulador de la condensación cromosómica y la maduración del centrosoma en la fase G2. PLK1 también promueve la entrada mitótica en la fase M, seguida del ensamblaje del husillo, la entrada en anafase y la^{citocinesis 3,4}. La sobreexpresión de PLK1 conduce a inestabilidad genética debido a la formación anormal de los centrosomas, lo que provoca ciclos celulares defectuosos que impiden a las células regular la apoptosis.  Esta sobreexpresión se observa en cánceres de pulmón, cabeza y cuello, esófago, gástrico, colorrectal y mama⁴. Por lo tanto, la inhibición de PLK1 a través de agentes que actúan contra la PBD podría desencadenar la apoptosis ^5,6. Este flujo de trabajo busca lograr una alta selectividad para evitar inhibir PLK2 y PLK3, que son cruciales para la función neurológica y el manejo del estrés^{genotóxico 3}.

PLK2 actúa como supresor tumoral en ciertos contextos, regulando la transición G1/S y promoviendo la degradación de la ciclina E para prevenir la proliferación celular descontrolada. PLK3 desempeña un papel complejo tanto en la regulación del ciclo celular como en la respuesta al estrés genotóxico, contribuyendo al mantenimiento de la integridad genómica mediante su implicación en la activación de daños en el ADN y en la inducción de la^{apoptosis 7}. Es importante destacar que, aunque la inhibición de PLK1 ha surgido como una estrategia terapéutica prometedora para el tratamiento del cáncer, los roles esenciales de PLK2 y PLK3 en el funcionamiento neurológico y la respuesta al estrés requieren el desarrollo de inhibidores altamente selectivos para minimizar los efectos fuera del objetivo sobre estas quinasas^{cruciales 3}. Este contexto biológico y las similitudes estructurales superiores al 38%³ subrayan la importancia de identificar compuestos que se dirijan específicamente al dominio de la caja de polo (PBD) de PLK1 sin interferir con las funciones protectoras de PLK2 y PLK3 en la fisiología celular normal.

Los inhibidores conocidos de la quinasa tipo polo (PLK), especialmente aquellos dirigidos a PLK1, han sido ampliamente estudiados debido a sus posibles aplicaciones terapéuticas en el tratamiento del cáncer. Varios compuestos, incluyendo BI 2536, volasertib (BI 6727), onvansertib (NMS-1286937) y GSK461364, han sido desarrollados y desarrollados en ensayos clínicos, a menudo como inhibidores ATP-competitivos ^8,9,10. Otros tipos de inhibidores actúan contra la DBP, incluyendo la timoquinona (TQ)^11,12, la^{poloxina 13,14} y el alopól-A¹⁵. Aunque se informa que es prometedor, actualmente no existen inhibidores específicos para PBD aprobados ni ensayos clínicos en fase avanzada debido a desafíos, incluyendo propiedades subóptimas de ADMET-S y efectos fuera del objetivo⁶. Por ejemplo, varios inhibidores de PLK1-PBD son, según se informa, alquiladores de proteínas^{inespecíficos 16}, lo que limita su aplicabilidad clínica. Por lo tanto, mejorar la selectividad y los perfiles ADMET-S de los posibles inhibidores de PLK1-PBD sigue siendo un objetivo crucial en el descubrimiento de fármacos.

El objetivo de este estudio es explorar posibles inhibidores PLK1-PBD con propiedades ADMET-S utilizando cribado virtual, filtrado por similitud estructural, acoplamiento, cálculos de energía de unión y evaluación de ADMET-S. PLK2 y PLK3 fueron sometidos a los mismos protocolos para evaluar la selectividad potencial. Aunque existen numerosas canaletas computacionales para el descubrimiento de inhibidores de quinasas, pocas integran cribado selectivo concurrente entre PBDs PLK1–3 con análisis exhaustivos de estabilidad ADMET-S y mecánica cuántica, especialmente utilizando bibliotecas de productos naturales. El flujo de trabajo se basa en paradigmas de cribado virtual establecidos, pero está adaptado para la accesibilidad educativa y la generación de hipótesis en etapas tempranas. El protocolo requiere únicamente un portátil estándar (8 GB de RAM), software académico gratuito y ninguna experiencia previa en programación, lo que lo hace adecuado para entornos de secundaria, grado y posgrado, incluyendo experiencias de investigación de grado basadas en cursos (CUREs).

La cadena computacional para este trabajo comienza con la preparación de proteínas, donde las estructuras de PLK1-PBD, PLK2-PBD y PLK3-PBD se extraen del Banco de Datos de Proteínas (PDB) o se modelan y procesan para resolver discrepancias estructurales. A continuación, se realizó un cribado en una base de datos de productos naturales, filtrando compuestos según su potencial como anticáncer de mama y el cumplimiento de la Regla de Cinco de Lipinski. Los pasos posteriores se agrupan en 50 estructuras representativas basadas en la identificación molecular y la similitud. Estos representantes se sometieron a cálculos de acoplamiento proteína-ligando y afinidad de unión, generando datos de interacción para los tres PLK. Posteriormente, las propiedades de ADMET-S se evalúan utilizando tres servidores web diferentes para predecir farmacocinética, similitud con fármacos, toxicidad y estabilidad metabólica. Se utilizaron cálculos de MQ para evaluar la estabilidad molecular mediante análisis de Orbital Molecular Ocupado Más Alto (HOMO) y Orbital Molecular No Ocupado Más Bajo (LUMO) de la brecha HOMO–LUMO. Finalmente, se analizaron los datos de ADMET-S para filtrar y clasificar compuestos según criterios físico-químicos, de absorción, distribución, metabolismo, excreción, toxicidad y estabilidad como inhibidores potenciales y selectivos de PLK1-PBD.

Protocol

Los Identificadores de Recursos de Investigación (RRIDs) y los números de versión de todas las herramientas de software utilizadas se proporcionan en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de proteínas objetivo

1. Crea un directorio funcional para este proyecto donde se puedan almacenar archivos estructurales y resultados computacionales.
2. Visita el Banco de Datos de Proteínas para recuperar el identificador de la proteína objetivo PLK1-PBD (4HCO¹¹) y haz un seguimiento con Química en HARvard Molecular Mechanics - Interfaz Gráfica de Usuario (^{CHARMM-GUI 17,18}) para resolver cualquier discrepancia estructural.
   1. Visita CHARMM-GUI y registra una cuenta académica. Al registrar una cuenta académica, haz clic en el generador de entrada, luego en el lector PDB, introduce el ID PDB 4HCO y haz clic en siguiente paso.
   2. En la página siguiente, asegúrese de que solo esté seleccionada PROA – cadena proteica A y haga clic en el siguiente paso para las dos siguientes páginas.
   3. Descarga step1_pdbreader.pdb en un directorio, renombra el archivo a 4hco o prefered, y utiliza un editor de texto o código para renombrar las ocurrencias de histidina (HSD) como (HIS).
3. Repite el procedimiento para el PLK2-PBD (identificador PDB: 4XB0¹⁹) usando CHARMM-GUI.
   NOTA: Para estructuras sin identificadores PDB, como el PLK3-PBD, utiliza estructuras modeladas por homología o Alphafold²⁰. Asegura la precisión de la secuencia desde Uniprot²¹.

2. Cribado de bases de datos de productos naturales

1. Visita la base de datos de productos naturales de la SuperNatural 3.0 Library y selecciona la subpágina²² de enfermedades.
   1. Selecciona cáncer de mama con límites de confianza o nulos, ya que todos los resultados deberán ser filtrados programáticamente, y haz clic en Buscar. Haz clic en Descargar el archivo completo de resultados para guardar los resultados en un directorio preferido como .csv. Después, utiliza código para filtrar a quienes tienen límites de confianza de 0,900–1,000 (n = 1.193 de 73.406).
      NOTA: Alternativamente, el identificador KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) para el cáncer de mama puede introducirse en la subpágina²³ de vías.
   2. Ve a la subpágina de preguntas frecuentes , al final, y encuentra el conjunto de datos completo disponible para descargar como un archivo .csv. Descárgalo y utiliza un script para comparar cadenas del Sistema Simplificado de Entrada Molecular de Entrada de Línea (SMILES) del conjunto de datos con los identificadores SuperNatural de las 1.193 moléculas y prepara una lista de sus cadenas SMILES (smiles.csv).

3. Muestreo por conglomerados

1. Descarga una distribución Anaconda (https://www.anaconda.com/download) que contenga casi todos los paquetes de código abierto, o descarga individualmente un entorno de desarrollo integrado (IDE) como RStudio (RStudio Desktop - Posit) o Jupyter (Jupyter Notebook). Instala^{RDKit 24}, un paquete de quimioinformática y aprendizaje automático de código abierto usando Conda.
   NOTA: Las instrucciones para instalar Conda y crear un entorno Conda se pueden encontrar en la documentación de conda 25.9.2.dev31. Para la instalación y configuración de módulos de RDKit en el entorno, consulte Instalación — La documentación de RDKit 2025.03.6.
2. Coloca el script "Lipinski.py" en el Archivo Suplementario 1 en la misma carpeta que "smiles.csv" y ejecutalo. El script abre el entorno Conda, carga módulos, lee el archivo de cadenas SMILES, aplica un filtro basado en la Regla de 5 de Lipinski para estimar la biodisponibilidad y absorción (n = 999 de 1.193), y guarda una lista de cadenas SMILES como "all.csv".
   NOTA: Confirme que se ha generado "all.csv" y contiene ~999 compuestos (subconjunto filtrado). Abre el archivo para verificar que cada entrada contiene una cadena SMILES válida. Python se ejecuta en RStudio tras ejecutar lo siguiente en la consola: library(reticulate); Reticulate::use_condaenv(nombre de condaenv)
3. Coloca el script "Clustering.py" (Archivo Suplementario 1) en la misma carpeta que "all.csv" y ejecutarlo en el IDE preferido. Los scripts cargan módulos de agrupamiento, leen el archivo de cadenas SMILES y agrupan compuestos en 50 clústeres basados en la huella molecular y la similitud de Tanivoto.
   NOTA: 50 estructuras representativas (rep_struct.csv, en el Archivo Suplementario 1) se guardan en el directorio como una lista de cadenas MILES. La similitud de Tanimoto (también conocida como índice de Jaccard en quimioinformática)²⁵ es una métrica utilizada para cuantificar la similitud estructural entre dos moléculas basándose en sus huellas moleculares, con el coeficiente de Tanimoto que va de 0 (sin similitud) a 1 (huellas idénticas). Asegúrate de que "rep_struct.csv" tenga exactamente 50 entradas SMILES únicas que representen cada clúster.

4. Cálculo de afinidad y acoplamiento proteína-ligando

1. Visita el servidor web de detección de cavidades guiado por AutoDock Vina (CB-Dock2)²⁶.
   1. Ve a la pestaña de acoplamiento y sube la proteína 4HCO.
   2. Para subir el ligando, haz clic en dibujar ligando y pega un ligando de la lista de cadenas SMILES (rep_struct.csv, Archivo Suplementario 1). Introduce una dirección de correo electrónico en el siguiente campo para facilitar la recogida de datos comprimidos, y luego haz clic en Acoplamiento Automático a ciegas. Repite para los 49 representantes restantes de pequeños cúmulos de moléculas, marcándolos como lig1, lig2, ..., lig50.
2. Ve al resultado enviado por correo electrónico y descarga las carpetas zip en un subdirectorio titulado 4HCO, titulándolas de forma normal (4hco_lig1, 4hco_lig2, ..., 4hco_lig50).
   1. Descomprime las carpetas y elimina todos los archivos excepto los archivos complejos proteína-ligando que terminan en ".complex.pdb".
      NOTA: Verifique que cada directorio de ligandos (4hco_lig1 a 4hco_lig50) contiene el archivo correspondiente ".complex.pdb".
   2. Abre un archivo de ejemplo .complex.pdb con un editor de texto para anotar cuidadosamente el ID de la cadena proteica: P y el ID del ligando: A:UNL, y vuelve a comprimir las carpetas usando una utilidad de compresión de archivos.
   3. Visita el servidor web PROtein binDing enerGY prediction (PRODIGY) para evaluar la selectividad y la afinidad de unión^{proteína-ligando 27}.
      1. Haz clic en la pestaña PRODIGY-lig (proteína-molécula pequeña) para subir una carpeta comprimida con múltiples complejos proteína-ligando a la vez (como 4hco_lig1). Introduce los IDs de cadena proteica y ligando, completa la verificación del captcha y procede a hacer clic en Enviar Prodigy-Ligand.
      2. Una vez procesados los datos, haz clic en el archivo de archivo de todas las salidas (.zip) para descargar los resultados. Repite el paso anterior y la recopilación de resultados para todos los subdirectorios hasta 4hco_lig50.
   4. Repite todos los pasos para las proteínas 4XB0 y PLK3 con mucha atención a la nomenclatura de los archivos (como 4xb0_lig1 o plk2_lig1).
      NOTA: Confirme que los CSVs de salida para todos los complejos proteína-ligando están descargados y contienen tanto columnas de datos ΔG como de residuos de interfaz.

5. Evaluación de ADMET-S

1. Visita la plataforma²⁸ de ADMETlab3 3.0.
   1. Haz clic en EMPEZAR en "ADMET Screening" e introduce una lista de SONRISAS.
      1. Abre rep_struct.csv en un directorio para pegar toda la lista de cadenas SMILES en el campo de texto y enviar.
      2. Evalúa la farmacocinética y las propiedades de similitud con fármacos utilizando el sistema de puntuación codificado por colores de la plataforma y descarga los resultados de la evaluación como un archivo .csv para análisis posteriores.
      3. Navega hasta la herramienta^{SwissADME 29}.
2. Pega la lista de cadenas SMILES de las 50 moléculas en el campo de entrada.
   1. Haz clic en Ejecutar para calcular las propiedades de biodisponibilidad y permeabilidad, incluyendo la penetración en BBB.
   2. Descarga la salida como un archivo .csv para integrarla con otros resultados de ADMET.
3. Descargue e instale ToxTree³⁰ (Toxic Hazard Estimation by a decision tree approach) compatible con el sistema operativo del usuario.
   1. Abre el software a través del terminal usando el comando: sh Toxtree.sh
   2. Introduce las cadenas SMILES individualmente en ToxTree para clasificar la toxicidad según las reglas de Cramer.
   3. Exporta los resultados como un archivo .csv para su integración con otros datos de ADMET.
      NOTA: Comprueba que los CSVs de salida de ADMETLab3 y SwissADME coincidan con el número de ligandos (n = 50) y que los resultados de Toxtree clasifiquen cada compuesto bajo las reglas de Cramer (I–III).
4. Después de instalar ORCA³¹, crea una carpeta llamada stability en el directorio de trabajo y subcarpetas para cada molécula (por ejemplo, plk1_lig1, plk1_lig2, ..., plk1_lig50).
   1. Usa Avogadro (Avogadro) para construir cada molécula a partir de su cadena SMILES: Ve a la pestaña Extensiones y haz clic en Optimizar Geometría para optimizar la molécula. Genera archivos de entrada ORCA mediante extensiones > ORCA > genera entrada ORCA y aplica las siguientes configuraciones:
      ! B3LYP OPT FREQ def2-TZVP
      %maxcore 4000
      %pal
      NCOCS 1
      fin
   2. Modifica el archivo de trabajo de .sh descargado para cada ligando para incluir nombres únicos de puestos y una dirección de correo electrónico. Después, transfiere el directorio "stability" a un sistema de computación de alto rendimiento (HPC) usando los siguientes comandos:
      SSH xsedeu0000@darwin.hpc.udel.edu
      MKDIR ~/4HCO
      SCP -r /local/path/to/stability xsedeu0000@darwin.hpc.udel.edu:~/4hco
   3. Ejecuta los trabajos a través de Simple Linux Utility for Resource Management (gestor de carga de trabajo SLURM para clústeres HPC) con un script de bucle:
      para i en {1..50}; do
      cd ~/4hco/stability/plk1_lig${i}
      chmod +x job_lig${i}.sh
      sbatch job_lig${i}.sh
      hecho
   4. Después de recibir correos de finalización de trabajo, navega a las carpetas de ligandos y abre los archivos de salida para revisar datos y anotar los valores HOMO y LUMO:
      CD ~/4hco/estabilidad/plk1_lig1
      nano lig1.out

6. Análisis de datos de ADMET-S

1. Combina los datos de propiedades fisicoquímicas derivados de los gráficos de biodisponibilidad y permeabilidad de radar de SwissADME en un archivo .csv.
   1. Guarda el archivo .csv de SwissADME y nómbrale "Physiochemical.csv".
   2. Coloca el script "Physiochemical.py" (Archivo Suplementario 1) en la misma carpeta que "Physiochemical.csv" y ejecutalo.
   3. Aplica los siguientes criterios: nHD: 0–7, nHA: 0–12, nEstéreo: <2, LogP: 0–3, LogD: 1–3, LogS: –4 a 0,5, Fsp3: >0,41 y nHet: 1–15.
2. Derive los datos de absorción y distribución de SwissADME.
   1. Haz una instantánea y guarda la gráfica BOILED-Egg³² en SwissADME.
   2. Aplica el siguiente criterio: las moléculas deben situarse en la región del "huevo" y actuar como inhibidores de la p-glicoproteína, ya que se prefieren los puntos rojos.
3. Derivar los datos metabólicos de ADMETlab3.0 para sustratos e inhibidores de citocromo (CYP).
   1. Guarda .csv archivo de ADMETlab3.0 y ponle el nombre "Metabolism.csv".
   2. Edita el archivo .csv y solo conserva las columnas de CYP-inh y CYP-sub.
   3. Coloca el script "Metabolism.R" (Archivo Suplementario 1) en la misma carpeta que "Metabolism.csv" y ejecutalo.
   4. Aplica los siguientes criterios: se prefieren inhibidores de CYP p450 y no sustrato como categoría 0.
4. Derivar los datos de excreción de ADMETlab3.0 para la eliminación del plasma y la vida media.
   1. Guarda .csv archivo de ADMETlab3.0 y ponle "Excretion.csv".
   2. Edita el archivo .csv y solo conserva las columnas de cl-plasma y t0.5.
   3. Coloca el script "Excretion.py" (Archivo Suplementario 1) en la misma carpeta que "Excretion.csv" y ejecutalo.
   4. Aplicar los siguientes criterios: clearance del plasma: 0,01–5 ml/min/kg.
   5. nDatos de toxicidad de Toxtree para la clase de toxicidad y ADMETlab3.0 para el número de toxicóforos.
      1. Guarda .csv de ADMETlab3.0 y ponle "Toxicity.csv".
      2. Edita el archivo .csv, manteniendo solo la columna Toxicóforo, y añade una nueva columna que registre la clase de toxicidad de cada ligando desde Toxtree.
      3. Coloca el script "Toxicity.py" (Archivo Suplementario 1) en la misma carpeta que "Toxicity.csv" y ejecutalo.
      4. Aplicar el siguiente criterio: número de toxicóforos a 0–2.
   6. Derivar los datos de estabilidad a partir de archivos de salida ORCA. Las ("ENERGÍAS ORBITALES", específicamente los valores energéticos HUMO y LUMO).
      1. Crea un gráfico de Excel registrando las energías HUMO y LUMO de cada ligando en columnas separadas.
      2. Añadir una nueva columna que calcule la banda prohibida (HUMO–LUMO = Banda prohibida).
      3. Guarda el gráfico de Excel como "Stability.csv".
      4. Coloca el script "Stability.py" (Archivo Suplementario 1) en la misma carpeta que "Stability.csv" y ejecutalo.
      5. Aplica los siguientes criterios: la diferencia de banda prohibida entre 3,6–5 eV.

Results

El protocolo de archivo de estructura de proteínas objetivo garantiza que el archivo de proteínas objetivo esté optimizado para análisis y acoplamiento basado en estructura. El archivo de estructura resultante, en formato PDB, está libre de residuos y hidrógenos ausentes, tipos de átomos ausentes y componentes innecesarios como moléculas de agua y ligandos cocristalizados. Las figuras 1A,B muestran diferencias visuales (visualizadas por el Visor Mol^{* 33}) en las estructuras antes y después de la preparación. Si quedan problemas residuales de formato (como nombres de átomos no reconocidos o residuos incompletos), CB-Dock2 suele emitir un error al subirlo. En ese momento, se pueden aplicar correcciones manuales menores, como renombrar HSD a HIS o eliminar residuos no estándar, antes de intentar de nuevo el paso de acoplamiento.

La Figura 2 muestra los resultados del agrupamiento mediante análisis de componentes principales (PCA) basados en la huella molecular y la similitud de Tanomo. En la figura, cada grupo está agrupado por un óvalo de tonos grises que contiene puntos de color similar, que representan las moléculas de esos grupos.  Los componentes PCA 1 y 2 en los ejes proporcionan una representación lineal bidimensional de la reducción desde elementos de alta dimensión en matrices de Tanito. En este estudio, la similitud con Tanimoto se utiliza durante el paso de muestreo en racimos para reducir la redundancia y mejorar la diversidad química entre los 999 productos naturales compatibles con Lipinski. Al calcular las similitudes de Tanimoto por pares utilizando huellas moleculares, el conjunto de datos se divide en 50 grupos de compuestos estructuralmente relacionados. A continuación, se selecciona una única molécula representativa de cada clúster, asegurando que el conjunto final de 50 ligandos capture un amplio espacio químico mientras minimiza la redundancia computacional en los análisis de acoplamiento aguas abajo y ADMET-S. Esta estrategia mejora la eficiencia y la representatividad del cribado virtual, especialmente al trabajar con grandes bibliotecas de productos naturales como SuperNatural 3.0. (véase la Figura 2).

Se simulan posturas óptimas para cada complejo proteína-ligando, acompañadas de afinidades predichas en forma de puntuaciones de Vina entre las cinco posturas CurPocket de la proteína PLK1 en CB-Dock2, considerando las fuerzas de van der Waals y los enlaces de hidrógeno.  Una simulación de ejemplo del ligando 1 en la Figura 3 muestra la mejor unión a la segunda pose CurPocket (C2), con la puntuación más baja de Vina de –7,5 kcal/mol, en comparación con las otras cuatro posturas superiores. El acoplamiento molecular con CB-Dock2 se realiza mediante una función de puntuación basada en parámetros empíricos y un algoritmo de optimización global estocástica. CB-Dock2 ha sido rigurosamente validado y ha demostrado un rendimiento superior en comparación con otras herramientas de acoplamiento ciego de última generación, lo que lo convierte en una excelente opción para estudios de^{acoplamiento 26,34}. El servidor alcanza una tasa de éxito de aproximadamente el 85% en la predicción de postura de enlace (RMSD <2 Å), superando a herramientas populares, incluyendo la primera versión CB-Dock, SwissDock, COACH-D y MTiAutoDock³⁴. Esta alta precisión se debe a la innovadora integración de dos esquemas de acoplamiento complementarios en CB-Dock2: enfoques basados en estructuras y basados en plantillas.

La Figura 4 ilustra un mapa de calor de afinidades proas predichas para cada combinación proteína-ligando utilizando afinidades predichas por el servidor web PRODIGY.  Las afinidades más altas, señaladas por energías molares más bajas (kcal/mol) y tintes de mapa de calor más verdes, son afinidades favorables para la unión. En cambio, las afinidades más bajas, señaladas por energías molares más altas y tonos de mapa de calor más rojos, son menos favorables. Desde el punto de vista de la selectividad, es ideal tener compuestos con afinidades favorables para la proteína objetivo (PLK1) en relación con los homólogos (PLK2–3). Por ejemplo, el ligando 27 es un ligando selectivo PLK1-PBD en relación con el ligando 45, que muestra afinidades similares entre las tres proteínas. Aunque los resultados 3, 5, 6, 7, 27, 28, 34, 35 y 49 muestran mayor afinidad por PLK1-PBD que PLK2/3, son químicamente diversos en espacio de huellas dactilares 2D (media ECFP4 Tanimoto ≈ 0,135, sin par ≥ 0,50), lo que sugiere que cualquier especificidad más amplia probablemente esté impulsada por la geometría conservada de los bolsillos PBD y patrones compartidos de farmacóforo/interacción 3D más que por la identidad del andamiaje. Las recomendaciones incluyen la comparación interacción-huellas dactilares y el mapeo farmacofórico para identificar los determinantes estructurales del reconocimiento PLK1-PBD.

Los resultados de la evaluación de propiedades fisicoquímicas se muestran en un gráfico de radar (Figura 5). Las propiedades evaluadas incluyen interacciones atómicas, solubilidad y biodisponibilidad. Algunos compuestos destacan por sus propiedades fisicoquímicas más deseables con rangos aceptables: nHD = 0–7, nHA = 0–12, nStereo < 2, LogP = 0–3, LogD = 1–3, LogS = –4 a 0,5, Fsp3 > 0,41 y nHet = 1–15. Este gráfico de radar proporciona una visualización completa y multidimensional de las propiedades fisicoquímicas de los 50 ligandos representativos identificados en el flujo de trabajo de cribado computacional. Está diseñado para evaluar qué tan bien cada compuesto cumple con los criterios predefinidos de "similar a un fármaco", representando sus propiedades frente a los límites inferior y superior establecidos. El gráfico muestra diez descriptores moleculares clave dispuestos alrededor del eje polar, incluyendo pKa ácido y pKa básico. El área sombreada entre el polígono verde (Límite Inferior) y el polígono azul (Límite Superior) marcaba el rango ideal o aceptable para cada propiedad, según los umbrales proporcionados en el protocolo. Los límites superior e inferior del ácido pKa (2–12 y pKa base (3–10)) se asignaron basándose en revisiones^{bibliográficas} 35,36,37, ya que no existe un límite superior e inferior único para el pKa en el descubrimiento de fármacos. Cada línea de color representa uno de los 50 ligandos. La forma formada al conectar los puntos de datos de un solo ligando muestra su perfil a lo largo de las diez propiedades seleccionadas simultáneamente. La gran mayoría de los 50 ligandos se encuentran dentro o muy cerca de la región aceptable definida por los polígonos verde y azul. Esto indica que los pasos iniciales de filtrado, en particular la aplicación de la Regla de Cinco de Lipinski y el agrupamiento basado en la similitud de Tanivoto, fueron muy efectivos para enriquecer el conjunto de datos con moléculas que poseen propiedades favorables similares a las de fármacos. Se recomienda la representación de todo el rango de valores documentados para todos los parámetros.

La Figura 6A–C muestra componentes de los datos de ADME de ADMETlab3.0 y SwissADME. Comenzando por la absorción y distribución, el modelo³⁸ de huevo COCIDO en la Figura 6A de SwissADME representa la absorción y distribución de los fármacos mediante lipofilicidad y permeabilidad, como indican las elipses amarillas y blancas en el gráfico. Incluye sustratos e inhibidores de P-gp, representados por puntos azul y rojo, respectivamente, donde inhibir la P-gp es crucial para mayores tasas de absorción. En la Figura 6B, el mapa de calor metabólico visualiza la inhibición y el sustrato de aproximadamente 7 variedades de enzimas citocromo CYP p450. El resultado deseado para los ligandos es que actúen como no inhibidores y no sustratos del CYP (verde), con resultados preferidos que confirmen un perfil de seguridad seguro del fármaco con o sin interacciones fármaco-fármaco bajas. La Figura 6C representa los datos de excreción de la eliminación y vida media del fármaco. La excreción puede distinguirse por la eliminación óptima del plasma (<5 mL/min/kg). La vida media de todos los fármacos anticancerígenos depende del mecanismo de acción, la toxicidad y el objetivo del fármaco. La vida media ideal equilibra mantener las concentraciones del fármaco dentro de una ventana terapéutica, minimizando la toxicidad y permitiendo calendarios de dosificación^{convenientes 39,40}.

Se representa la combinación de dos tipos de evaluaciones de toxicidad. En la Figura 7A, se muestra el número de toxicóforos identificados por ADMETlab3.0 para cada ligando.  No existe un umbral o información definida sobre los rangos aceptables de los toxicóforos.  En la Figura 7B, la aplicación de Toxtree proporciona información relacionada con la clase de toxicidad (I-III), así como con las violaciones y la adherencia a la Regla de Cramer. El resultado de muestra para el ligando 1 muestra los resultados de toxicidad y su código SMILES en la barra superior, con la estructura en la ventana inferior izquierda. La identificación de toxicidad de clase en la ventana superior derecha indica alta toxicidad (Clase III) basada en las Reglas de Cramer para ligando 1, en lugar de otras posibilidades como Clase II (toxicidad media) o Clase I (baja toxicidad).  La ventana inferior derecha muestra el razonamiento escrito de la identificación de clases basado en el árbol de decisiones de la Regla de Cramer.

Los cálculos ORCA QM de frecuencia vibracional para estructuras optimizadas calculan valores de energía orbital para determinar la brecha de banda. La Figura 8 muestra la banda prohibida (eV) de cada ligando, derivada de la diferencia entre el HOMO y el LUMO. El rango umbral se representa en la región sombreada entre 3,6 eV y 5,0 eV, donde cada punto en la región sombreada satisface los niveles de energía asociados a una estabilidad y reactividad más deseables. Una visión general de todo el flujo de trabajo computacional se resume en la Figura 9, que ilustra las etapas secuenciales desde la preparación de proteínas objetivo y el cribado en bases de datos de productos naturales hasta la evaluación ADMET-S, diseñada para identificar inhibidores selectivos de PLK1-PBD asegurando propiedades similares a fármacos y estabilidad química. Esta hoja de ruta visual subraya la modularidad, accesibilidad y idoneidad del protocolo para la implementación educativa.

La Tabla 1 operacionaliza el protocolo transformándolo de una secuencia lineal de instrucciones en una cadena robusta y consciente de errores, adecuada para uso en aula e investigación independiente. Aborda explícitamente la reproducibilidad, un desafío conocido en el descubrimiento computacional de fármacos, al integrar criterios de validación en puntos clave de transición. Por ejemplo, confirmar que los residuos de histidina están uniformemente etiquetados como "HIS" tras el procesamiento CHARMM-GUI previene fallos silenciosos en el acoplamiento posterior, mientras que validar la integridad de SMILES antes del agrupamiento evita errores en cascada en la predicción de ADMET. La tabla también destaca el diseño pedagógico, con cada consejo de resolución de problemas accionable con un mínimo de conocimientos computacionales (por ejemplo, "abrir .complex.pdb en un editor de texto para identificar la cadena de comprobación"), alineándose con el objetivo del manuscrito de accesibilidad para sordos, estudiantes de grado/posgrado y estudiantes de secundaria. Además, al señalar pasos en los que los resultados afectan de forma desproporcionada, como la evaluación de selectividad mediante la puntuación comparativa PRODIGY, la tabla ayuda a los usuarios a priorizar la atención y los recursos.

Una fortaleza clave de este flujo de trabajo integrado es su capacidad para exponer discrepancias entre predicciones computacionales complementarias, revelando casos límite que subrayan las limitaciones de cualquier método individual. Por ejemplo, el ligando 5 para PLK1-PBD mostró una fuerte puntuación de Vina CB-Dock2 (−7,9 kcal/mol) y una afinidad PRODIGY favorable (ΔG = −9 kcal/mol, Figura 4), pero falló varios filtros ADMET. No se ajustaba al modelo de absorción-distribución del huevo COCIDO, mostraba un valor de eliminación plasmático menos deseable (9,3 mL/min/kg, Figura 6), lo que sugería una eliminación rápida, y fue clasificado como Clase III de Cramer (alta toxicidad) por Toxtree que contenía cinco toxicóforos (Figura 7A). Por el contrario, el ligando 33 mostró una afinidad moderada de PLK1 predicha por PRODIGY (−5,4 kcal/mol), pero cumplió todos los criterios de ADMET, mostrando baja toxicidad (Clase I), LogP óptimo (0,7) y una distribución favorable de absorción y limpieza plasmática. A pesar de su afinidad más débil, el ligando 33 es un candidato más parecido a un fármaco. Este contraste ilustra un principio fundamental en el descubrimiento de fármacos en etapas tempranas: una alta afinidad de unión por sí sola es insuficiente sin una farmacocinética y seguridad favorables. Al mismo tiempo, compuestos como el ligando 5, aunque con un bajo rendimiento en ADMET, pueden seguir aportando valiosas ideas para andamios para futuras optimizaciones que mejoren la seguridad o la estabilidad metabólica sin comprometer su potencia.

Aunque los filtros iniciales en este flujo de trabajo están destinados a la triagem y priorización, no a la exclusión permanente, una mayor simplificación de los 50 candidatos designa a algunos como "top hits" aplicando límites deseables disponibles en las herramientas ADMET y la literatura. De los 50 ligandos evaluados en 114 descriptores relacionados y electrónicos con ADMET, 13 cumplieron al menos 95 de los criterios de propiedad deseables. Entre ellos, seis compuestos (10, 13, 14, 32, 43 y 47) demostraron tanto perfiles ADMET-S favorables como mayores afinidades de unión para PLK1-PBD que PLK2/3, por lo que están designados como los principales candidatos a inhibidores (Figura 10). Los análisis comparativos de similitud estructural-funcional y cuantitativa revelaron que los hitos identificados comparten características farmacofóricas clave con inhibidores conocidos de PLK1-PBD, lo que sugiere una posible convergencia en el comportamiento de unión. Todos los hits contenían andamios aromáticos o heteroaromáticos que reflejan los sistemas hidrofóbicos de anillos TQ, Poloxin y Allopole-A, permitiendo interacciones π–π e hidrofóbicas dentro del bolsillo PBD. La superposición funcional fue evidente a través de motivos conservados de enlace de hidrógeno (carboxilo, amida y grupos carbonilo) análogos a los que median los contactos polares clave en los inhibidores de referencia. Los enlaces alifáticos y cíclicos flexibles presentes en varios impactos son paralelos a la adaptabilidad conformacional de los análogos de la Poloxina, facilitando la orientación hacia residuos esenciales de unión. Cuantitativamente, las puntuaciones de similitud de Tanimoto (0,36–0,54) confirmaron un parecido estructural moderado entre los hits y los inhibidores conocidos, siendo los Hits 10, 13 y 14 los más similares a Poloxin, Hit 32 a TQ, y Hits 43 y 47 a Allopole-A. En conjunto, estos resultados ponen de manifiesto una clara superposición estructural y funcional, indicando que los resultados probablemente imitan la topología de unión y los patrones de interacción de los inhibidores validados de PLK1-PBD, manteniendo la novedad suficiente para una optimización posterior (Figura 10).

Para evaluar la robustez del flujo de trabajo computacional, se analizaron como controles positivos los inhibidores conocidos de PLK1-PBD (Poloxinpan¹⁴ y Allopole-A¹⁵), siendo Metformina e Imeglimina (dos agentes antidiabéticos estructuralmente no relacionados sin actividad reportada de PLK1-PBD) como controles negativos en los análisis de ADMET-S, acoplamiento y afinidad de unión. Los controles positivos mostraron afinidades de unión de –5,8 y –5,6 kcal/mol, respectivamente, mientras que los controles negativos mostraron afinidades más débiles de –5,1 kcal/mol (Metformina) y –4,8 kcal/mol (Imeglimin), consistentes con su ausencia de actividad de unión a PBD. Curiosamente, la evaluación de ADMET-S reveló que los controles negativos cumplían descriptores más deseables (88 de 114 propiedades) que los controles positivos (80 de 114), validando así la capacidad del flujo de trabajo para distinguir la favorabilidad farmacocinética del potencial de unión específico del objetivo. Estas vinculaciones refuerzan la importancia de mantener una perspectiva equilibrada: los compuestos no deben descartarse prematuramente únicamente por predicciones ADMET subóptimas si presentan una fuerte afinidad objetivo, ya que tales andamios pueden seguir ofreciendo valiosos puntos de partida para la optimización. Por el contrario, moléculas con excelentes propiedades farmacocinéticas pero unión débil pueden servir como plantillas de bajo riesgo para el desarrollo de análogos. Se requiere una validación bioquímica y celular adicional para confirmar estas observaciones computacionales y refinar los criterios de priorización.

Figura 1: Comparaciones estructurales entre una estructura 4HCO no preparada y una preparada por CHARMM-GUI. (A) Estructura 4HCO subida directamente desde el PDB, destacando los residuos faltantes. (B) Estructura 4HCO tras el protocolo de preparación CHARMM-GUI. Se seleccionó 4HCO (PLK1-PBD unido a TQ) porque es uno de los pocos cristales PLK1-PBD con un ligando orgánico unido, lo que lo hace directamente aplicable a este descubrimiento de inhibidores de pequeñas moléculas basados en estructuras. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Análisis de componentes principales (PCA) de 999 productos naturales compatibles con Lipinski tras agrupamiento K-means basado en la identificación molecular y la similitud de Tanimoto. Cada punto representa un compuesto, coloreado por su grupo asignado (1–50), agrupados por elipses grises para enfatizar la similitud química. El fuerte agrupamiento dentro de los conglomerados y la separación entre ellos indican que el agrupamiento basado en Tamimoto redujo con éxito la redundancia estructural mientras preservaba la diversidad química en todo el conjunto de datos. Esta diversidad garantiza que los 50 ligandos representativos seleccionados para el acoplamiento aguas abajo abarquen una amplia región del espacio químico, mejorando la robustez y generalización de los resultados de cribado virtual. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: El acoplamiento ciego CB-Dock2 identifica una pose de unión de alta afinidad del ligando 1 dentro del dominio polo-box (PBD) PLK1. La conformación C2 de CurPocket mostrada (puntuación Vina = −7,5 kcal/mol) representa la pose óptima entre cinco sitios de unión predichos, caracterizada por contactos de van der Waals favorables y enlaces de hidrógeno con residuos clave de PBD (Trp414, His538 y Lys540). Este resultado valida el uso del acoplamiento ciego basado en estructuras para localizar bolsas de unión biológicamente relevantes en ausencia de un ligando cocristalizado, demostrando cómo el flujo de trabajo prioriza poses con la energía de unión predicha más fuerte para el análisis de selectividad posterior. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4: El mapa de calor del servidor web PRODIGY predijo afinidades mediante combinaciones proteína-ligando. El mapa de calor aborda directamente la superposición entre ligandos cuando están unidos a PLK1, PLK2 y PLK3. Mientras que algunos ligandos (incluido el ligando 45) muestran afinidades de unión comparables en las tres isoformas PLK, lo que sugiere baja selectividad, otros (notablemente los ligandos 3, 5, 6, 7, 27, 28, 34, 35 y 49) presentan una fuerte preferencia por PLK1 (ΔΔG ≥ 3,0 kcal/mol frente a PLK2/PLK3), lo que se alinea con el objetivo de inhibición selectiva por PBD. Cuantitativamente, 20 de los 50 ligandos muestran una selectividad casi doble para PLK1 tanto sobre PLK2 como PLK3 basándose en valores de ΔG predichos por PRODIGY. Esta unión diferencial se atribuye a sutiles variaciones en los bolsillos de unión PBD, que el protocolo de acoplamiento ciego captura. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 5: Representación de propiedades fisicoquímicas combinadas de ADMETlab3.0 y SwissADME. Los parámetros son nHD = número de donantes de hidrógeno, nHA = número de aceptores de hidrógeno, pKa básico, pka ácido, nStereo = número de estereocentros, LogP = n-octanol/coeficiente de distribución de agua, LogD = n-octanol/coeficiente de distribución de agua a pH=7,4, LogS = valor de solubilidad acuosa, Fsp3 = número de carbonos híbridos sp3/recuento total de carbono, y nHet = número de heteroátomos. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 6: Una combinación de resultados de ADME de ADMETlab3.0 y SwissADME. (A) Gráfico de huevos COCIDOS de Wildman-Crippin LogP (WLOGP) vs. Área de Superficie Polar Topológica (TPSA) de SwissADME que representa la permeabilidad de la barrera hematoencefálica (BBB) de absorción y distribución en la región amarilla (yema), la absorción a través del tracto gastrointestinal (HIA) en la elipse blanca, sustratos de P-glicoproteína y no sustratos en puntos azul y rojo respectivamente. Las moléculas que se encuentran fuera del "óvulo" se consideran de mala absorción y distribución. (B) Mapa térmico del metabolismo con varios identificadores de citocromo P450 (CYPs) que involucran la estabilidad del Metabolismo del Hígado Humano (HLM), donde el rojo sirve como inhibidores/sustratos y el verde como no inhibidores/no sustratos, dejando el verde como deseable. (C) La excreción implica los parámetros, la liberación del plasma y la vida media. La línea roja discontinua indica una clearance plasmática deseable (<5 mL/min/kg), mientras que 5-15 mL/min/kg y >15 mL/min/kg indican una clearance moderada y alta, respectivamente.  Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 7: El perfil integrado de toxicidad revela responsabilidades críticas de seguridad entre ligandos examinados. (A) Distribución de los conteos de toxicóforos entre los 50 productos naturales representativos, según lo predijo ADMETlab3.0. (B) Resultados de toxicidad de muestra para ligando 1, indicando toxicidad de Clase III resaltada en rojo, con una explicación detallada de las Reglas de Cramer relacionadas en el cuadro de texto siguiente. Este enfoque de doble evaluación (toxicóforos + clase de Cramer) permite una triaje temprana de compuestos de alto riesgo. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 8: Energías de banda prohibida HOMO–LUMO (en eV) para los 50 ligandos representativos derivados del producto natural, calculados usando ORCA en el nivel teórico B3LYP/def2-TZVP. La región sombreada (3,6 a 5,0 eV) denota la ventana óptima de estabilidad: las brechas de banda por debajo de 3,6 eV sugieren una alta reactividad química o posible fotodegradación, mientras que valores superiores a 5,0 eV pueden indicar pobre polarizabilidad electrónica y reducción de la adaptabilidad de la unión. Los ligandos que se encuentran dentro de este rango muestran un equilibrio favorable entre estabilidad cinética y respuesta molecular, lo que apoya su prioridad como posibles candidatos a inhibidor PLK1-PBD. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 9: Diagrama de flujo del flujo de trabajo bilingüe de descubrimiento computacional de fármacos. La línea comienza con la preparación de estructuras PBD PLK1-PLK3, seguida de un cribado centrado en enfermedades de la base de datos SuperNatural 3.0 y el filtrado mediante la Regla de Cinco de Lipinski (peso molecular ≤ 500 Da, donantes de enlaces de hidrógeno ≤ 5, aceptores ≤ 10, LogP ≤ 5). Los compuestos representativos se seleccionan tras el agrupamiento y luego se evalúan mediante acoplamiento proteína-ligando, predicción de afinidad de unión y perfilado exhaustivo ADMET-S, incluyendo absorción, distribución, metabolismo, excreción, toxicidad y evaluación de la estabilidad de la MQ. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 10: Solapamiento estructural y funcional comparativo entre ligandos candidatos principales e inhibidores conocidos de PLK1-PBD. La figura destaca los seis compuestos candidatos principales (10, 13, 14, 32, 43 y 47) identificados a partir de los análisis combinados de cribado virtual, agrupamiento, afinidad de unión y perfilado ADMET-S. Estos ligandos satisfacían al menos 95 de 114 descriptores físico-químicos y farmacocinéticos deseables y mostraban mayores afinidades de unión para PLK1-PBD en comparación con PLK2/3. Para evaluar la posible convergencia estructural y funcional, cada ligando se comparó con los inhibidores conocidos de PLK1-PBD TQ, Poloxin y Allopole-A, basándose en motivos farmacofóricos centrales compartidos y en coeficientes de similitud de Tanimoto par a par (huellas dactilares ECFP4). Puntuaciones de similitud moderadas (0,36–0,54) y grupos funcionales comunes como anillos aromáticos o heteroaromáticos, pares donante/aceptor de enlaces de hidrógeno y enlaces hidrofóbicos indican solapamiento parcial en las características de unión. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Etapa de flujo de trabajo	Punto de control intermedio (cómo confirmar el éxito)	Paso crítico (por qué determina el éxito/fracaso)	Problemas comunes y orientación para la resolución de problemas
1. Preparación de proteínas objetivo	• El archivo PDB se carga sin errores en la vista de Mol*. • No faltan residuos en el bolsillo de la encuadernación (inspección visual). • Residuos de histidina etiquetados como "HIS" (no HSD/HSE)	Estructura proteica inexacta → falsas bolsas de unión → posturas de acoplamiento engañosas. CHARMM-GUI garantiza la correcta protonación, colocación del hidrógeno y eliminación de aguas/ligandos.	Problema: CB-Dock2 rechaza el archivo PDB. Solución: Eliminar residuos no estándar, asegurarse de que solo esté presente la cadena proteica y estandarizar los nombres de átomos/residuos usando un editor de texto.
2. Filtrado de productos naturales (regla de 5 de Lipinski)	• "all.csv" contiene solo SMILES válidos (no en blanco, químicamente analizables). • Contar partidos esperados (por ejemplo, 999/1.193).	SMILES inválido hace que RDKit, los servidores de acoplamiento y las herramientas ADMET se bloqueen. El filtrado debe preservar la validez química.	Problema: El script falla durante el agrupamiento. Corrección: Añadir validación SMILES usando Chem.MolFromSmiles (smiles, sanitize=True) en Python; Registra y elimina las entradas inválidas antes de continuar.
3. Muestreo en racimos	• 50 sonrisas únicas en "rep_struct.txt". • El gráfico PCA (Fig. 2) muestra una clara separación de conglomerados.	Un agrupamiento deficiente → representantes redundantes o poco diversos → un cribado ineficiente.	Problema: Todas las moléculas se agrupan en un solo grupo. Corrección: Verificar el tipo de huella dactilar (por ejemplo, Morgan/ECFP4), el umbral de Tanimoto y la estandarización de SMILES. Considera aumentar el recuento de grupos si la diversidad es baja.
4. Acoplamiento proteína-ligando (CB-Dock2)	• Cada ligando devuelve ≥1 archivo ".complex.pdb". • Las puntuaciones de Vina son negativas (por ejemplo, ≤ −5 kcal/mol). • El ligando está posicionado en CurPocket (no en superficie).	El acoplamiento define la postura de unión y la afinidad. Postura incorrecta → predicciones falsas de PRODIGY.	Problema: El trabajo falla o el ligando no está acoplado. Corrección: Redibujar el ligando en CB-Dock2 usando SMILES; asegurarse de que no haya caracteres especiales en el nombre del archivo; Verifica el correo electrónico para saber el estado del puesto. Si persistes, prueba SwissDock como respaldo.
5. Afinidad de Vinculación (PRODIGY)	• PRODIGY devuelve valores ΔG para todos los complejos. • Las afinidades se correlacionan con las puntuaciones CB-Dock (Vina) (consistencia de tendencia).	La evaluación de selectividad depende de la precisión de ΔG para PLK1 frente a PLK2/PLK3. IDs de cadena/ligandos asignados incorrectamente → predicciones erróneas.	Problema: error "Cadena no encontrada". Corrección: Abrir .complex.pdb en un editor de texto; confirmar la identificación de la cadena proteica (por ejemplo, "P") y el nombre del residuo de ligando (por ejemplo, "UNL"); Entrada correcta en PRODIGY.
6. Evaluación ADMET-S	• Los 50 SMILES devolven resultados en SwissADME, ADMETlab3.0 y ToxTree. • No hay filas "N/A" ni "Error" en los CSV de salida.	Datos inconsistentes de ADMET → un posicionamiento defectuoso de los candidatos. Las plataformas pueden fallar en andamios de productos exóticos naturales.	Problema: ADMETlab3.0 rechaza SONRISAS. Corrección: Canónica SMILES usando RDKit (MolToSmiles(MolFromSmiles(...))). Para ToxTree, introduce una molécula a la vez y verifica la representación estructural.
7. Estabilidad Cuántica (ORCA)	• Cada trabajo ORCA se completa sin "SCF no convergido" ni "error de geometría". • Valores HOMO/LUMO presentes en el archivo de salida (.out).	La banda prohibida determina la estabilidad/reactividad química. Trabajos fallidos = datos faltantes para el filtro de claves.	Problema: El trabajo de ORCA se bloquea. Corrección: Reoptimizar la geometría en Avogadro; asegurarse de que no haya átomos duplicados; aumentar el %maxcore o cambiar a base def2-SVP para moléculas grandes.
8. Filtrado ADMET-S integrado	• Lista final de ligandos cumple todos los criterios (por ejemplo, LogP 0–3, banda prohibida 3,6–5 eV, Clase I/II de Cramer). • El ligando ≥1 muestra selectividad de PLK1 (ΔΔG ≥ 2 kcal/mol frente a PLK2/3).	Umbrales excesivamente estrictos o inconsistentes eliminan las ventajas viables; Umbrales demasiado flexibles favorecen compuestos tóxicos o inestables.	Problema: Ningún ligando pasa por todos los filtros. Solución: Relajar un criterio a la vez (por ejemplo, permitir LogP ≤ 4 o 3 toxicóforos) y documentar los compromisos. Compáralo con fármacos conocidos para comparación.

Tabla 1: Puntos críticos de control de calidad, puntos de decisión de alto impacto y estrategias de resolución de problemas a lo largo del flujo de trabajo computacional bilingüe de ocho etapas para identificar inhibidores selectivos de PLK1-PBD. Cada fila corresponde a una fase principal del protocolo, desde la preparación de proteínas hasta el filtrado ADMET-S integrado, y especifica (i) cómo verificar la finalización exitosa (punto de control intermedio), (ii) por qué el paso es fundamental para el éxito o fracaso global (justificación del paso crítico), y (iii) soluciones prácticas a fallos técnicos comunes (guía de solución de problemas). Esta tabla sirve tanto como hoja de ruta de validación como como ayuda didáctica para estudiantes e investigadores que implementan el protocolo en entornos académicos o con recursos limitados.

Archivo suplementario 1: scripts en Python. Contiene el script en Python para la aplicación de reglas Lipinski; el script en Python utilizado para el análisis de clústeres; el script Python para cálculos de propiedades fisicoquímicas; el script R para análisis metabólico; el script Python para el análisis de excreciones; el script en Python para la predicción de toxicidad; el script en Python para la evaluación de estabilidad; y las cadenas SMILES de los 50 compuestos analizados. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

Este estudio se centra en un flujo de trabajo computacional exploratorio para identificar y evaluar posibles inhibidores PLK1-PBD mediante cribado virtual, acoplamiento y análisis ADMET-S. La tubería prioriza eficazmente los compuestos basándose en las tendencias de unión previstas y las propiedades farmacocinéticas. En este protocolo, se identifica un conjunto de posibles inhibidores de PLK1, y se evalúan sus propiedades ADMET y afinidades de unión para las proteínas PLK1–3. El protocolo utiliza un enfoque centrado en la enfermedad para identificar 50 moléculas de una base de datos de aproximadamente 73.400 (Figura 9). Después, estas 50 moléculas fueron sometidas a una evaluación ADMET-S, durante la cual se calcularon sus propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas, similitud con fármacos y estabilidad. Además, se calculó su afinidad de unión a las proteínas PLK1–3 para evaluar su potencia inhibitoria frente a PLK1 y su selectividad. Según los resultados, varias moléculas mostraron propiedades más deseables. Los estudios posteriores de descubrimiento de fármacos pueden optar por eliminar algunas moléculas y centrarse en algunas de esta exploración, o pueden abstenerse de la eliminación temprana y utilizar estos resultados más adelante en el proceso de diseño del fármaco para optimizar las propiedades de ADMET.

La razón biológica para centrarse en PLK1, PLK2 y PLK3 excluyéndose PLK4 y PLK5 se basa tanto en consideraciones estructurales como funcionales. PLK4 y PLK5 quedan excluidos de este trabajo debido a sus diferencias estructurales y funcionales marcadas respecto a PLK1 y a su limitada relevancia para la terapia del cáncer. PLK1, caracterizado por su dominio quinasa y dominio polo-box (PBD), desempeña un papel fundamental en la regulación de eventos mitóticos, convirtiéndose en un objetivo clave para el tratamiento^{del cáncer 41}. En cambio, PLK4 y PLK5 son estructuralmente divergentes: PLK4 contiene una polobox críptica (CPB) en lugar de una PBD canónica y funciona principalmente en duplicación de centríolos. Al mismo tiempo, PLK5 carece de un dominio quinasa funcional y se expresa casi exclusivamente en el cerebro³. Dada su mínima superposición estructural con PLK1-PBD y su relevancia limitada para la desregulación mitótica en el cáncer, su inclusión no informaría de manera significativa la selectividad de los inhibidores de PLK1-PBD. Así, la estrategia de cribado ofrece un marco biológicamente relevante y computacionalmente manejable para evaluar la selectividad. Es importante destacar que los seis ligandos candidatos principales (10, 13, 14, 32, 43 y 47) mostraron energías de unión y perfiles ADMET-S aún más favorables que los inhibidores conocidos TQ y Allopole-A, destacándolos como posibles moduladores PLK1-PBD.

Para apoyar una implementación robusta, especialmente por parte de estudiantes o investigadores nuevos en herramientas computacionales de descubrimiento de fármacos, se proporciona un resumen de los puntos clave de control (también en la sección de Protocolos), pasos críticos y directrices para la resolución de problemas del flujo de trabajo en la Tabla 1. The Table apoya la adaptabilidad; por ejemplo, si un usuario no tiene acceso a HPC, puede notar que el análisis de estabilidad ORCA es diferido, y si un servidor web está caído, se sugieren alternativas como SwissDock. Esta flexibilidad garantiza que el flujo de trabajo siga siendo viable en diversos contextos institucionales, manteniendo al mismo tiempo el rigor científico y reforzando la novedad del estudio como una contribución inclusiva, bilingüe y orientada a la educación para el descubrimiento de fármacos en etapas tempranas. Aunque todo el flujo de trabajo está diseñado como una tubería integrada, varios pasos cruciales determinan fundamentalmente su éxito o fracaso (véase la Tabla 1). Además, el vídeo que lo acompaña incluye leyendas sincronizadas en inglés y un signo en Lengua de Signos Americana (ASL), diseñado para proporcionar acceso equitativo sin distracciones. Las instrucciones del firmante están alineadas temporalmente con acciones en pantalla, por ejemplo, firmar "siguiente" y luego pausar cuando el cursor hace clic en el botón "Siguiente". Durante el paso de preparación 4HCO, el firmante utiliza el etiquetado con los dedos ("A" y "B") para guiar la selección de cadenas, reflejada con precisión en la grabación de pantalla. En el segmento de pantalla de SuperNatural 3.0, la ventana del signante se redimensiona y se desplaza hacia la esquina superior derecha mientras dirige la atención al icono de "camino", deteniéndose mientras el cursor sigue. Estas decisiones de diseño aseguran que los espectadores sordos y con dificultades auditivas reciban la misma guía integrada y en tiempo real que los oyentes, replicando eficazmente una experiencia de laboratorio presencial dirigida por un instructor.

Además de los beneficios, hay numerosas formas de mejorar el flujo de trabajo. Primero, el filtrado inicial puede modificarse; En lugar de métodos centrados en enfermedades y muestreo por conglomerados, se podría empezar con simulaciones de acoplamiento de todas las moléculas en la base de datos de productos naturales para identificar qué compuestos son más adecuados para la unión a proteínas objetivo de ligando. Además, se necesitan estimaciones más detalladas para una predicción precisa de la afinidad de unión.  Los cálculos "no electrostáticos" de PRODIGY sobre la afinidad proteína-ligando implican ajustar los conteos de tipos categorizados de contactos atómicos implicados en la interacción (Carbono-Carbono, Nitrógeno-Nitrógeno, Oxígeno-Oxígeno y otros átomos) en un modelo de regresión lineal múltiple entrenado con validación cruzada de 4 veces, y este método se correlacionó significativamente con afinidades experimentales en varias^{ocasiones 42,43}.  Se pueden emplear enfoques alternativos, como FoldX⁴⁴, fastDRH⁴⁵, modelos de aprendizaje^{profundo 46} y MD con muestreo avanzado, y se esperan distintos grados de concordancia en las predicciones dependiendo de la precisión de cada^{método 47}.

Otro aspecto es que las diversas herramientas de software utilizadas en la evaluación ADMET-S generan numerosas métricas, y comprender cada métrica utilizada para evaluar la candidatura de medicamentos es fundamental. Una forma de garantizar la precisión podría ser someter varios medicamentos del mercado al protocolo para determinar cómo cumplen los umbrales.  En ese contexto, la toxicidad requiere más investigación, ya que las moléculas no se descartan únicamente en función de perfiles de toxicidad de árboles de decisión matizados como las Reglas de Cramer, ya que muchos medicamentos disponibles para su uso llevan clasificaciones similares.  El número de toxicóforos tampoco es completamente informativo sobre toxicidad, incluso en relación con los perfiles de toxicidad.  En este contexto, una extensión de este flujo de trabajo sería realizar revisiones comparativas de muestras de pequeñas moléculas con medicamentos disponibles para informar las interpretaciones.  Por ejemplo, los investigadores consultaron literatura previa que documentaba la aplicación y observaciones de cálculos de DFT en medicamentos actuales contra el cáncer de mama como Tamoxifeno⁴⁸, Letrozol⁴⁹ y^{Cisplatino 50}al interpretar la estabilidad determinada por cálculos de MQ de valores de banda prohibida HOMO–LUMO. Anteriormente, se han adoptado flujos de trabajo similares para identificar posibles inhibidores de varios objetivos de enfermedad/^{trastorno, el 51}. Recientemente, Stafford et ^al.6 revisaron estrategias de diseño de inhibidores de PLK1-PBD y oportunidades terapéuticas en el cáncer. La mayoría de los estudios recientes han identificado inhibidores de doble dirección contra PLK1-PBD y PLK4-PB3 mediante modelado de farmacóforos guiados por estructura, cribado virtual, acoplamiento molecular, simulación de dinámica molecular (MD) y evaluación^{biológica 52}. Zhou et al. también identificaron inhibidores de PLK1-PBD de la biblioteca de productos naturales marinos utilizando farmacóforo QSAR 3D, ADMET, saltos en andamios, acoplamiento molecular y MD⁵³.

En general, la novedad de este estudio es cuádruple. En primer lugar, es un protocolo computacional bilingüe, impartido tanto en Lengua de Señas Americana como en inglés, lo que fomenta la accesibilidad e inclusión en STEM, especialmente para estudiantes e investigadores sordos y con discapacidad auditiva. Esta entrega bilingüe es rara en el descubrimiento computacional de fármacos y está alineada con la misión de la Universidad Gallaudet de ser pionera en una educación científica equitativa. En segundo lugar, aunque PLK1 sigue siendo un objetivo anticancerígeno convincente, los estudios computacionales rigurosos que evalúen la selectividad entre PLK1, PLK2 y PLK3 utilizando criterios estructurales, energéticos y ADMET-S integrados son escasos. La mayoría de los esfuerzos previos se centran únicamente en la inhibición del dominio quinasa o carecen de perfiles de selectividad comparativa. Este trabajo aborda esta brecha proporcionando un protocolo inicial y exploratorio de cribado concurrente contra tres PLK-PBDs, con filtros que priorizan compuestos basándose en una alta afinidad PLK1 y una mínima unión fuera de objetivo. En tercer lugar, el flujo de trabajo se diseñó pensando en la eficiencia y la usabilidad, especialmente para entornos educativos y con recursos limitados. Todo el proceso desde el filtrado de bases de datos hasta la evaluación de ADMET-S puede completarse en dos semanas en hardware académico estándar (un portátil con 8 GB de RAM), aprovechando software gratuito basado en la web (CB-Dock2, PRODIGY, SwissADME, ADMETlab). Los cálculos de afinidad de acoplamiento y unión no requieren mucho tiempo (~30 segundos por ligando). El paso que más tiempo requiere es el análisis de estabilidad de la mecánica cuántica con ORCA, que puede posponerse a etapas posteriores o ejecutarse en recursos de computación de alto rendimiento, como se ha demostrado. Los scripts son modulares y requieren solo ediciones básicas en línea de comandos o en Jupyter Notebook, lo que permite una integración fluida en los planes de estudio existentes. El tiempo de ejecución es modesto, con filtrado de bases de datos y cumplimiento de Lipinski que tardan minutos; El agrupamiento de ~1.000 moléculas se completa en menos de 30 minutos en un escritorio típico. Todas las herramientas de software están disponibles gratuitamente para uso académico, multiplataforma (Windows, macOS, Linux) y no requieren licencias comerciales, lo que reduce drásticamente las barreras de entrada. Cuarto, los ligandos identificados muestran afinidades de unión prometedoras compatibles con interacciones en el rango nanomolar, junto con una semejanza favorable con fármacos, estabilidad metabólica y perfiles de baja toxicidad. Varios candidatos emergen como ligantes fuertes y selectivos de PLK1-PBD con propiedades ADMET-S deseables, lo que justifica una validación adicional mediante simulaciones de dinámica molecular o ensayos in vitro .

Por tanto, más allá de su utilidad metodológica, este estudio ejemplifica cómo se pueden aprovechar herramientas computacionales accesibles, de código abierto y eficientes como punto de partida para abordar un desafío biomédico de alto valor mientras fomenta una formación científica inclusiva. A medida que los inhibidores de PLK1-PBD continúan ganando terreno en oncología, este flujo de trabajo proporciona un plan reproducible y educativo para el descubrimiento de fármacos en etapas tempranas. Su versatilidad lo hace adecuado para entornos de secundaria, grado y posgrado, y proporciona una excelente base para los CURE que ofrecen a los estudiantes oportunidades de investigación auténticas y prácticas. A diferencia de las tuberías que dependen únicamente del acoplamiento de dominios quinasas o del cribado de una sola proteína, el enfoque evalúa simultáneamente la selectividad de PBD en PLK1–3, una necesidad dada su homología estructural del >38% y sus roles biológicos divergentes. Además, al combinar clustering, ADMET-S y estabilidad de QM en un marco de acceso abierto, se redujeron los riesgos de redundancia y desgaste en relación con el cribado virtual de fuerza bruta.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ADMETLab3	Simulations Plus. Inc	V3.0	Propiedades de ADMET
Alphafold	Busca DeepMind y Busca en Google Isomorphic Labs (filiales de Alphabet)	V3.0.1	Modelado de proteínas 3D
Anaconda/Conda	Anaconda, Inc.	V24.9.2	Sistema de gestión de paquetes de código abierto
CB-Dock2	Laboratorio Yang Cao	V2.0	Acoplamiento ciego proteína-ligando
CHARMM-GUI	Universidad de Lehigh	V3.8	Manipulación y simulación biomolecular
DARWIN sobre ACCESS	Universidad de Delaware	N/A	Computación de alto rendimiento
ORCA	FAccTs GmbH	V6.1.0	Paquete de química cuántica
Banco de Datos de Proteínas	Banco Mundial de Datos de Proteínas	RRID:SCR_006555	Base de datos de proteínas
RDKit	Código abierto	RRID:SCR_014274	Programación quimioinformática
SuperNatural 3.0	Instituto de Fisiología y Ciencia-IT (Berlín)	V3.0	Biblioteca de moléculas naturales
SwissADME	Instituto Suizo de Bioinformática	RRID:SCR_017865	Propiedades de ADME
Toxtree	Ideaconsult Ltd	V3.1.0	Clasificación de toxicidad