Artículo de método

Estimación del ARN que contiene repeticiones teloméricas a partir de complejos híbridos ADN/ARN

DOI:

10.3791/67984

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5 de diciembre de 2025

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1Betul-Ziya Eren Genome and Stem Cell Center, Erciyes University, 2Department of Medical Biology, Faculty of Medicine, Erciyes University, 3INSERM-CNRS, Université de Nice

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Este protocolo permite el aislamiento de híbridos ADN:ARN y su ARN asociado (incluido TERRA) a través de múltiples tejidos. Aunque nuestro enfoque captura un subconjunto de interacciones híbridas, sería necesario un mapeo genómico adicional para una caracterización genómica completa a nivel genómico.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El ARN que contiene repeticiones teloméricas (TERRA) es un ARN largo y no codificante transcrito de todos los telómeros en eucariotas superiores, y solo un subconjunto de estas moléculas forma híbridos estables de ADN/ARN en los telómeros. Hemos esbozado un protocolo molecular detallado para identificar y purificar estas estimaciones híbridas. Este método simplificado permite la extracción directa de interacciones híbridas ADN/ARN formadas de forma natural in vivo y puede aplicarse para detectar todas estas regiones. Al minimizar los pasos procedimentales, esta técnica es altamente eficiente para aislar el ARN unido al ADN, estimando la fiabilidad y reproducibilidad de la secuenciación posterior. El reactivo de isotiocianato de guanidina se utiliza para la lisis y homogeneización total de células, preservando la integridad de los ácidos nucleicos (ADN y ARN), especialmente los híbridos ADN/ARN. La adición de cloroformo inicia la separación de fases mediante centrifugación (tres capas distintas): una fase inferior de fenol-cloroformo, una interfase y una fase acuosa superior. El ARN, liberado tanto del núcleo como del citoplasma, se retiene en la fase acuosa, mientras que el ADN de alto peso molecular, incluidas las regiones híbridas ADN/ARN, está confinado a la interfase. Con alcohol isopropílico, seguido de centrifugación, se recuperan la fase acuosa (ARN libre), la interfase y el ADN, especialmente los híbridos ADN/ARN. Para eliminar los restos restantes de proteínas, la muestra se incuba con Proteinasa K. Se utiliza tratamiento con DNasa, extracción de fenol/cloroformo, alcohol isopropílico y centrifugación para liberar ARN hibridado en ADN.

Introducción

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La transcripción del genoma da lugar a la formación de moléculas híbridas temporales, conocidas como R-loops, que consisten en estructuras de tres cadenas. Estas estructuras incluyen las cadenas no codificantes y codificantes del ADN, siendo la cadena no codificante desplazada por la formación de híbridos con el ARNcomplementario 1. Durante la transcripción del genoma, se producen a diferentes ritmos un gran número de ARN no codificantes a partir de ambas cadenas de ADN. La mayoría de estos ARN actúan como intermediarios de vida corta, pero algunos desempeñan papeles críticos en las redes reguladoras que rigen la biología del genoma, especialmente aquellos que se originan en regiones no codificantes como los telómeros y loscentrómeros 1. La distribución de híbridos ADN/ARN en el genoma también puede reflejar la actividad transcripcional de las células en cualquier momento.

A medida que crece el interés por las funciones reguladoras de los ARN no codificantes, existe un interés creciente por rastrear su transcripción y distribución a lo largo del genoma, especialmente en forma de híbridos temporales de ADN/ARN. Para abordar esto, desarrollamos un ensayo independiente para la detección de híbridos estables de ADN/ARN, aplicable a cualquier célula o tejido biológico. Este método permite aislar ARN complementarios que co-purifican con el ADN, seguido de un análisis mediante precipitación o secuenciación por PCR.

La investigación de modelos de cultivos celulares estableció que durante la replicación y transcripción del ADN pueden producirse tensiones de replicación, daños en el ADN, colisiones de horquillas de replicación y pausas de la ARN polimerasa II debido a eventos topológicos, estructurales e hibridados. Estos procesos, en particular el desenrollamiento de la doble hélice del ADN, introducen estrés torsional, que puede conducir a la formación de estructuras anormales, como los lazos R, durante latranscripción 1.

La mayoría de los datos de bucle R se han generado utilizando células cancerosas de levadura o cultivadas, basándose en el anticuerpo monoclonal específico de híbrido ADN-ARN S9.6. Estudios estructurales han demostrado que el fragmento de unión al antígeno (Fab) de S9.6 se une específicamente a un híbrido ARN-ADNdúplex 1 de 13 pb. La detección basada en anticuerpos de los R-loops ha identificado principalmente híbridos que se forman en regiones ricas en guanina durante la transcripción, donde es probable que se produzca una hibridación mejorada ARN-ADN. Los estudios in vitro que utilizan el anticuerpo S9.6 sugieren que los ARN que contienen cuatro o más guaninas consecutivas cerca de su extremo 5′ son más fácilmente detectables, correlacionándose con un aumento en la formación de lazoR 1. Diversas enzimas, como helicasas, topoisomerasas, RNasa H1 y RNasa H2, ayudan a mantener el equilibrio del lazo R durante la transcripción. La alteración de la homeostasis del bucle R está relacionada con un aumento de la inestabilidad genómica, contribuyendo a enfermedades como el cáncer y trastornosneurodegenerativos 2.

Se ha encontrado que los telómeros, que antes se creía que eran transcripcionalmente silenciosos, transcriben ARN largos y no codificantes conocidos como ARN Que Contienen Repeticiones Teloméricas (TERRA)3. Estos transcritos se originan en regiones subtelómeras y contienen repeticiones teloméricas, desempeñando un papel esencial en el mantenimiento de la homeostasis de lostelómeros 4. En este manuscrito, nos referimos a 'ARN TERRA-híbrido' como las moléculas de ARN liberadas de complejos híbridos ADN/ARN mediante tratamiento con DNasa I, presumiblemente que incluyen secuencias TERRA basadas en las propiedades de extracción y la especificidad del cebador.

La transcripción de TERRA ocurre en la dirección de centrómero a telómero y es variable en longitud, oscilando entre 100 bp y 9 kb, siendo la mayor parte de TERRA recuperada en fase acuosa como molécula de ARN libre. Una pequeña fracción permanece unida al ADN y está asociada con procesos biológicos clave, como el cáncer y el envejecimiento 4,5. Los niveles de TERRA varían según los loci subtelómeros y están regulados por el estado heterocromático de lostelómeros 6. Los estudios de cultivo celular también indican que los transcritos TERRA de diversas regiones subtelómeras presentan heterogeneidad en longitud. En algunos estudios de cultivo celular derivado de tumores, los investigadores han encontrado que la región subtelómera 20q es la fuente principal de transcritos TERRA, y esta región suele estar metilada en sus islas CpG 7,8,9. En ratones, la región subtelómera del cromosoma 18 es un importante lugar de producción deTERRA 10,11. Además, se ha demostrado que los PAR-TERRAs, que son transcritos de TERRA originados en regiones subtelóricas pseudoautosómicas en células embrionarias, tienen hasta 200 veces más TERRA en comparación con los cromosomas 18,11,12.

La transcripción de TERRA está controlada por la metilación del ADN y modificaciones de histonas como la trimetilación de H3K9 y H4K20, que suprimen TERRA, mientras que la acetilación de histonas se correlaciona positivamente con la transcripciónde TERRA 6,13,14. TERRA también se une a regiones extratelóricas, incluyendo sitios intergénicos e intrones, lo que indica un papel más amplio en la regulacióngenómica 2.

Además, el agotamiento de TERRA provoca desregulación de numerosos genes, especialmente aquellos cercanos a sus sitios de unión, lo que sugiere su papel en la regulación epigenética de la cromatina y la expresióngénica 2. La acumulación de TERRA en telómeros acortados favorece la extensión basada en recombinación homóloga (HR), contribuyendo a la homeostasis de la longitudde los telómeros 15,16.

Para abordar el papel de TERRA y otros híbridos ADN/ARN, empleamos un ensayo diseñado específicamente para aislar moléculas de ARN hibridadas de forma estable con ADN. Brevemente, se aislaron núcleos y se trataron con RNasa libre de DNasa para eliminar ARN no protegido. Los híbridos ADN/ARN se extrajeron entonces mediante digestión selectiva de DNasa, que libera ARN originalmente hibridado con ADN. Esta fracción, denominada "ARN híbrido asociado ADN/ARN", fue posteriormente analizada por RNA-seq y comparada con ARN soluble total obtenido mediante extracción estándar defenol-cloroformo 17. Este enfoque nos permitió identificar tanto sitios teloméricos como no teloméricos de formación de híbridos ARN-ADN, y comparar los perfiles transcriptómicos de grupos de ARN unidos al ADN frente a los solubles. Antes considerado simplemente un subproducto de la transcripción de telómeros, TERRA es ahora reconocida por su doble papel en el mantenimiento de los telómeros, influyendo en la actividad de la telomerasa y la recombinación homóloga, que son cruciales para la homeostasis de la longitud de los telómeros. Además, los avances en los ensayos de detección han permitido una comprensión más detallada de las interacciones dinámicas entre ARN y ADN a lo largo del genoma. Este conocimiento allana el camino para una exploración más profunda de las implicaciones de los híbridos ADN/ARN, como TERRA, en los procesos celulares y sus posibles vínculos con enfermedades como el cáncer y los trastornos neurodegenerativos. La investigación en curso en este campo sin duda profundizará nuestra comprensión de la regulación genómica y su relevancia para la salud y la enfermedad.

El método utilizado para identificar moléculas TERRA e híbridos ADN/ARN en este estudio es el mismo protocolo optimizado de extracción de guanidinio-tiocianato-fenol-cloroformo detallado aquí. Este protocolo fue desarrollado para permitir el aislamiento simultáneo de híbridos ARN-ADN/ARN, ARN total y ADN genómico dentro de un flujo de trabajo unificado. Al modificar estratégicamente el método clásico de separación trifásica, este protocolo facilita la retención selectiva de híbridos ADN/ARN en la interfase del fenol, minimizando así su pérdida, una limitación inherente a las técnicas convencionales de extracción.

Tradicionalmente, la detección y aislamiento de híbridos ADN/ARN se ha basado en la inmunoprecipitación con el anticuerpo monoclonal S9.6, que reconoce específicamente estructuras híbridas ADN/ARN 18,19. Este enfoque basado en S9.6, aunque ampliamente utilizado, puede estar limitado por la accesibilidad de los anticuerpos, el coste y la posible reactividad cruzada. En cambio, nuestro protocolo ofrece una alternativa rentable e independiente de los anticuerpos, que es fácilmente aplicable tanto a muestras celulares como de tejido extraídas.

Para mejorar aún más la pureza e integridad estructural de la fracción híbrida de ADN/ARN aislada, incorporamos desproteinización mediada por K de la proteinasa, seguida de tratamiento con DNasa I. El paso I de la DNasa digiere selectivamente la cadena de ADN de los híbridos ADN/ARN, liberando así el ARN hibridado para su posterior aislamiento y análisis molecularposterior 20. Este enfoque garantiza que las especies de ARN recuperadas sean específicamente aquellas que fueron hibridadas de forma estable con ADN in vivo. Gracias a su configuración modular y escalabilidad, nuestro protocolo es ampliamente adaptable a diversos contextos biológicos, proporcionando a los investigadores una herramienta robusta para interrogar la biología híbrida ADN/ARN en una amplia variedad de sistemas experimentales.

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Protocolo

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Todos los protocolos experimentales que involucran animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Erciyes (número de licencia 19-07-2019, decisión nº 19/127). En este estudio se utilizaron ratones Balb/c : cinco hembras sanas, de 6 semanas (25 g) y cinco machos, de 8 semanas (30 g). Los ratones eran cuidados y tratados según los Principios de Cuidado de Animales de Laboratorio (normas europeas). El estudio presentado aquí utilizó muestras de sangre de 13 sujetos controlados sanos, derivadas de un proyecto de investigación previo que recibió la aprobación ética del Comité de Ética Humana de la Universidad de Erciyes (Decisión nº: 17/002). Un resumen gráfico de este protocolo se proporciona en la Figura 1. Utiliza materiales libres de RNasa y técnicas asépticas en todos los pasos para minimizar la degradación del ARN.

1. Cuidado de ratones

  1. Para determinar la dosis anestésica adecuada necesaria para la eutanasia, pesa a cada ratón y administra ketamina a una dosis de 60 mg/kg y xilazina a 10 mg/kg mediante inyección intraperitoneal.
  2. Tras administrar anestesia, confirmar la anestesia total por la ausencia del reflejo de retirada del pedal (pellizco en el dedo) y la ausencia de respuesta a la estimulación táctil. Una vez confirmada la anestesia, realizar la eutanasia mediante luxación cervical.

2. Muestras humanas

  1. Selecciona a los participantes como controles sanos tras examinarlos para excluir cualquier historial de enfermedades crónicas (como diabetes, enfermedades cardiovasculares, hipertensión o cáncer), infecciones agudas, trastornos autoinmunes o inflamatorios, condiciones neurológicas o psiquiátricas, y el uso reciente de medicamentos conreceta 17.
  2. Recoge muestras de biopsia cutánea de la zona detrás de la rodilla (fosa poplítea) de cada voluntario usando una herramienta perforadora de 2 mm. Administrar anestesia local por vía subcutánea antes del procedimiento y realizar todas las biopsias en condiciones estériles.

3. Extracción de híbridos ADN/ARN de todos los tipos celulares

  1. Recogida y lisis de tejidos
    1. Para cada extracción, utiliza 500 μL de sangre cardíaca, complejo hipotalámico-hipófisis completo, glándula suprarrenal completa o muestra de esperma recogida de un solo ratón.
    2. Transfiere todas las muestras recogidas a tubos estériles de 1,5 mL. Añade 500 μL de fenol a cada tubo. Toma muestras de sangre en vórtice para mezclarlas a fondo.
      1. Para las muestras de tejido, homogeneizar completamente usando una jeringuilla de 2 mm hasta que no queden fragmentos visibles.
    3. Coloca los tubos sobre un bloque de refrigeración para mantener la integridad de la muestra.
      NOTA: Sigue siempre las directrices de seguridad del laboratorio al manipular reactivos peligrosos como fenol, cloroformo y acetato de amonio.
  2. Separación de fases
    1. Añade 180 μL de cloroformo a cada tubo y haz un vórtice breve para mezclar. Incuba tubos sobre hielo durante 15 minutos para permitir la separación de fases.
    2. Inspecciona las muestras: asegúrate de que la fase acuosa parezca clara. Si la fase está turbia, vuelve a hacer vórtice y vuelve al hielo durante 5 minutos adicionales.
    3. Centrifugar muestras a 12.000 × g, 4 °C durante 15 minutos.
  3. Precipitación de ARN
    1. Transfiere cuidadosamente la fase acuosa transparente a un nuevo tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 mL colocado sobre un bloque de refrigeración.
    2. Añade un volumen igual (1:1) de isopropanol a la fase acuosa, mezcla brevemente en vórtice e incuba sobre hielo durante 15 minutos.
    3. Centrifugar a 12.000 × g, 4 °C durante 15 minutos.
      NOTA: El pellet de ARN debe ser visible en la parte inferior del tubo.
  4. Lavado del pellet de ARN
    1. Invierte cuidadosamente el tubo para descartar el sobrenadante sin alterar la bola.
    2. Añade 1,5 mL de etanol al 70% al pellet. Golpea suavemente el tubo durante 5 segundos para lavarlo.
    3. Centrifugar a 7.500 × g, 4 °C durante 5 minutos.
    4. Invierte el tubo para descartar el sobrenadante. Repite el lavado con etanol dos veces (para un total de tres lavados).
  5. Purificación de ARN
    1. Después del lavado final con etanol, invierte el tubo y deja que el etanol residual se seque al aire o retira cuidadosamente con una pipeta.
    2. Añade 100 μL de agua libre de RNasa al pellet de ARN y pipetea suavemente arriba y abajo o haz un movimiento de movimiento en el tubo para resuspender completamente el ARN.
      NOTA: Siempre guarda muestras de ARN en hielo o en una rejilla o bloque de refrigeración refrigerado para evitar la degradación.
  6. Cuantificación y almacenamiento de ARN
    1. Coloca el tubo que contiene ARN resuspendido sobre hielo.
    2. Mide la concentración y pureza del ARN usando un espectrofotómetro. Registrar la absorbancia en 260 nm (A260) para determinar la concentración de ARN. Evalúa la pureza calculando las proporciones A260/A280 y A260/A230.
    3. Utiliza solo muestras de ARN con relaciones A260/A280 entre 1,9 y 2,1 para aplicaciones posteriores.
      NOTA: En este estudio, las concentraciones típicas de ARN oscilaron entre 100 y 180 ng/μL.
    4. Almacenar muestras de ARN a −80 °C hasta su uso adicional.
  7. Eliminación de proteínas y aislamiento del ADN
    1. Tras el aislamiento de ARN, se conserva la interfase del paso de extracción del fenol.
      NOTA: Este paso es necesario porque la interfase contiene ADN, que puede procesarse posteriormente para el aislamiento del ADN tras la adición de fenol y la centrifugación.
    2. Procede con la extracción de ADN siguiendo los pasos 3.2.1-3.4.1, comenzando con la interfase como material de partida. Transfiere cuidadosamente toda la interfase (que contiene ADN) desde la extracción de fenol a un tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 mL que se mantiene en una rejilla de refrigeración.
    3. Digestión de proteínas: Añadir 0,5 mL de tampón de lisis (20 mM Tris-HCl, pH 8,0; 100 mM EDTA; 0,1% SDS; 400 μg/mL de Proteinasa K) al tubo. Incuba durante la noche a 56 °C para digerir las proteínas.
    4. Precipitación de sal del ADN
      1. Al día siguiente, añade 100 μL de acetato de amonio 5 M a cada muestra y mezcla brevemente. Centrifugar a 1.788 × g durante 20 minutos a temperatura ambiente.
      2. Transfiere cuidadosamente la fase acuosa clara a un nuevo tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 mL. Añadir un volumen igual de isopropanol de grado biológico molecular (proporción 1:1) a la fase acuosa, mezclar por inversión suave y centrifugar a 1.788 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Descarta el sobrenadante sin alterar la cápsula de ADN.
      3. Lava el pellet de ADN con 1 mL de etanol al 70%, luego centrifuga a 1.788 × g durante 10 minutos.
      4. Retira y desecha el lavado de etanol. Deja que la cápsula de ADN se seque brevemente al aire.
      5. Resuspende la pelota de ADN seca en 50 μL de agua libre de nucleasa.
  8. Eliminar el ácido nucleico libre para limpiar el ADN:
    1. Carga el ADN disuelto en una columna de spin de ADN. Centrifugar a 15.000 × g durante 15 s y descartar el flujo directo.
    2. Lava la columna dos veces con etanol al 70%, centrifugando cada vez durante 1 minuto a 15.000 × g. Descarta el flujo de corriente tras cada lavado.
    3. Transfiere la columna de centrifugación a un tubo de recogida limpio de 1,5 mL. Añadir 30 μL de agua libre de nucleasas a la matriz columna, incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos y luego centrifugar durante 1 minuto a 15.000 × g para eluir ADN.
    4. Coloca el ADN eluído sobre hielo. Divide la muestra en dos tubos: uno para almacenamiento de ADN a 4 °C y el segundo para la posterior extracción híbrida de ADN/ARN.
  9. Extracción de ARN unido al ADN (híbridos ADN/ARN)
    1. Tratamiento con DNasa
      1. Prepara una mezcla de digestión de DNasa combinando 5 μL (15 U) de DNasa I y 75 μL de 10x buffer de digestión de DNasa.
      2. Añade 80 μL de la mezcla de DNasa al pellet de ADN seco. Incuba la muestra a temperatura ambiente durante 15 minutos.
    2. Extracción de fenol-cloroformo
      1. Añade 300 μL de fenol a la muestra e incuba a temperatura ambiente durante 5 minutos.
      2. Añade 180 μL de cloroformo a la mezcla e incuba durante 5 minutos adicionales a temperatura ambiente.
      3. Centrifugar a máxima velocidad (por ejemplo, 15.000 × g) durante 10 minutos a 4 °C para separar las fases. Transfiere cuidadosamente la fase acuosa superior (que contiene híbridos ARN:ADN) a un nuevo tubo.
  10. Aislamiento híbrido ADN/ARN
    1. Completar el aislamiento de híbridos ADN/ARN desde los pasos 3.3 hasta 3.5.2.
    2. Añade un volumen igual (1:1) de isopropanol a la fase acuosa, mezcla brevemente en vórtice e incuba sobre hielo durante 15 minutos.
    3. Centrifugar a 12.000 × g, 4 °C durante 15 minutos. Busca el pellet de ARN en la parte inferior del tubo. Invierte cuidadosamente el tubo para descartar el sobrenadante sin alterar la bola.
    4. Añade 1,5 mL de etanol al 70% al pellet. Golpea suavemente el tubo durante 5 segundos para lavarlo. Centrifugar a 7.500 × g, 4 °C durante 5 minutos. Invierte el tubo para descartar el sobrenadante. Repite el lavado con etanol dos veces (para un total de tres lavados).
  11. Purificación de ARN:
    1. Después del lavado final con etanol, invierte el tubo y deja que el etanol residual se seque al aire o retira cuidadosamente con una pipeta.
    2. Añade 30 μL de agua libre de RNasa al pellet híbrido ADN/ARN y pipetea suavemente arriba y abajo o haz girar el tubo para resuspender completamente el ARN.
    3. Almacenar muestras híbridas de ADN/ARN a −80 °C hasta su uso adicional.

4. Síntesis de ADNc

NOTA: Asegure la integridad del ARN, cDNA y ADN utilizando materiales libres de RNasa/DNasa y manteniendo las muestras en hielo durante todo el procedimiento.

  1. Para cada muestra, utilice 6 μL (20 ng de ARN; aislado en el Paso 3.6.5 para ARN libre o en el Paso 3.13.3 para ARN híbrido ADN/ARN). Transfiere el volumen requerido de ARN a tubos PCR marcados.
  2. Prepara la mezcla maestra de síntesis de ADNc según las instrucciones del fabricante del kit. Para cada reacción, asegúrese de que la mezcla maestra contiene transcriptasa inversa, dNTPs, cebadores, tampón e inhibidores de RNasa. Para cada reacción, combina 14 μL de mezcla maestra con 6 μL de la muestra de ARN en un tubo de PCR (volumen total: 20 μL por reacción). Incluir al menos un control sin transcriptasa inversa (-RT) preparando una reacción paralela sin añadir enzima transcriptasa inversa, utilizando la misma cantidad de ARN.
  3. Realizar la síntesis de ADNc en un ciclador térmico utilizando el programa de temperatura especificado en la Tabla 1.
  4. Diluir el ADNc resultante 1:5 con agua libre de nucleasas y almacenarlo a −80 °C hasta el análisis qPCR.

5. Determinación de los niveles de expresión de TERRA mediante Q-PCR

  1. Prepara la mezcla de reacción qPCR usando un kit de qPCR basado en SYBR Green, siguiendo las instrucciones del fabricante. Para cada reacción, combinar 1 μL de SYBR Green Master Mix, 0 μL de cebador directo para TERRA (véase Tabla 2), 0 μL de cebador inverso para TERRA (véase b) y μL de agua libre de nucleasa.
  2. Dispensar 16 μL de la mezcla de reacción en cada pozo de una placa qPCR de 96 pozos.
  3. Añadir 4 μL de ADNc diluido (del paso 4.6) a cada pozo, para un volumen final de reacción de 20 μL.
    NOTA: Para cada muestra, incluye al menos dos réplicas técnicas y dos réplicas biológicas. Incluir controles sin plantilla (NTC) para comprobar la contaminación y controles sin transcriptasa inversa para garantizar la especificidad de señales derivadas del ARN.
  4. Realiza qPCR usando el programa de temperatura especificado en la Tabla 3.
  5. Normaliza la expresión de TERRA a β-actina (gen de mantenimiento) usando el método 2-ΔΔCt .

6. Determinación de la longitud de los telómeros

  1. Prepara la mezcla qPCR para la medición de la longitud de los telómeros 21. Para cada reacción, combina 1 μL de SYBR Green Master Mix, 0 μL de cebador frontal de telómeros (véase Tabla 2]), 0 μL de cebador inverso de telómeros (véase Tabla 2) y μL de agua libre de nucleasa.
  2. Dispensar 16 μL de la mezcla de reacción telómera en cada pozo de una placa qPCR de 96 pozos.
  3. Añadir 4 μL de ADN genómico (del paso 3.10.5) a cada pozo, para un volumen de reacción final de 20 μL.
  4. Realizar qPCR según los parámetros del programa correspondientes especificados por el fabricante (véase la Tabla 3).
  5. En paralelo, establece reacciones para un gen de referencia de copia única (36B4) usando las mismas concentraciones y volumen final.
  6. Se generaron curvas estándar utilizando diluciones en serie de un oligonucleótido telomérico sintético (Tabla 2) para estimar la abundancia relativa y la eficiencia de amplificación. No se realizó cuantificación absoluta. La longitud relativa de los telómeros se calcula como la relación T/S (número de copia repetida de telómeros a número de gen de copia única) usando el métodoΔCt 21.

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Resultados

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En este estudio, cuantificamos y comparamos los niveles de TERRA libre, el híbrido ADN/ARN TERRA y la longitud de los telómeros en múltiples tejidos de ratón (sangre, esperma, piel, hipotálamo, hipófisis, suprarrenales), así como en sangre humana y muestras de piel, para investigar la dinámica específica de los tejidos y la relación con la biología de los telómeros. TERRA libre fue aislado de la fase acuosa tras la extracción de fenol-clo...

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Discusión

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Una fortaleza central del protocolo presentado aquí radica en su extracción y discriminación progresiva de TERRA libre y híbrido ADN/ARN TERRA de muestras de tejido complejo. Los pasos críticos incluyen la cuidadosa separación de las fracciones acuosa e interfase durante la extracción de fenol-cloroformo, ya que la contaminación cruzada puede complicar la distinción entre TERRA libre e híbrido. El tratamiento posterior con DNasa I de la fracción interfase también es fundamental: una dige...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen conflictos de interés que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Estamos agradecidos a la Unidad de Investigación Científica de la Universidad de Erciyes por apoyar este trabajo con los números de subvención TYL-2019-9224 y TSA-2022-11929.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubos PCR de 0,2 mL  Greiner671201
Tubos Falcon de 15 mLIsolab078.02.001
Jeringuilla de 2 mLHayatN/A
96- Placa multipozoGreiner50-720-3203
Etanol absolutoMerck1070172511
Acetato de AmonnioSigma238074-500G
Kit de Sinhesis de ADNcDNARoche07 912 439 001
CloroformoMerck1024451000
DNAse I Kit ZymoE1010
EDTASigmaE9884-1KG
Botella de cristalIsolabLB. IS.061.01.901
Cilindro graduadoIsolab  015.01.901
Guanidina isotiocianato  SigmaG9277-100G
IsopropuestaMerck1096342511
Light Cycler 480 IIRoche5015278001
Tubos microcentrífugas (1,5 mL)Greiner616201
Micropipetas (10 & micro; L)GilsonFD10001
Micropipetas (100 y micro; L)GilsonFD10004
Micropipetas (1000 y micro; L)GilsonFD10003
Micropipetas (2 & micro; L)GilsonGFAM00064
NanodropShimadzuC101-E112
Tableta PBSSigmaP4417-50TAB
Dispositivo PCRSensoquestT3-0140
PGL3 Vector BásicoPromega #212936
Puntas de pipeta (10 y micro; L, 200 & micro; L, 1000 y micro; L)Greiner772352
Placas de Petri de plásticoGreiner627102
Proteinasa KSigmaP6556-10MG
SDSSigma8170342500
Pipeta serológicaGreiner760107
GiroGilsonPMC880
Sybr Maestro VerdeRoche4707516001
TermomezcladorEppendorf#5355
Base de TrizmaSigma1503-1KG         
TrizolBiorad7326890
Unimax 1010 DT ShakerHeidolph543-12310-00-6
VórticeHeidolph541-10000-00-1
Columnas Zymo-Spin IZymoC1003-50

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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