Aplicación de I TASSER, trRosetta, UCSF Chimera, servidor HADDOCK y HEX loria para el diseño de proteínas De Novo e In Silico

Resumen

El diseño de proteínas implica la construcción de secuencias de aminoácidos y la incorporación de motivos específicos para crear variantes funcionales. Este enfoque es fundamental para el desarrollo de péptidos antimicrobianos (AMP) para combatir los patógenos resistentes a los antibióticos. En este artículo se presenta un procedimiento para la construcción de proteínas utilizando diversas herramientas bioinformáticas.

Resumen

Las fronteras del diseño de proteínas se encuentran en la construcción de secuencias de aminoácidos y la incorporación de motivos específicos, como sitios de unión, en receptores, canales iónicos u otras proteínas. Este enfoque permite la producción de variantes de proteínas con funciones y propósitos específicos. Una aplicación ejemplar de estos recursos bioinformáticos es la mejora de péptidos antimicrobianos (AMPs) o el diseño de AMPs sintéticos. Este desarrollo es significativo debido al reciente aumento de enfermedades emergentes, a menudo causadas por patógenos que son difíciles de erradicar y exhiben resistencia a los antibióticos. Las consecuencias de esta tendencia incluyen la extinción global de especies animales y la muerte de seres humanos. Por lo tanto, la síntesis rápida de AMP nuevos y efectivos es esencial. Estos servidores y programas pueden facilitar el rápido desarrollo de vacunas, AMP o tratamientos eficaces contra estos patógenos. El objetivo de este trabajo fue presentar y proponer un procedimiento para la construcción de proteínas a partir de secuencias y dilucidar el proceso de uso de diferentes herramientas para construir estas moléculas paso a paso.

Introducción

La incidencia de enfermedades animales está aumentando, y este fenómeno está influenciado por el cambio climático. El aumento de la temperatura global ha provocado la proliferación de microorganismos y la aparición de patógenos oportunistas, contribuyendo al desarrollo de enfermedades virulentas y resistentes a los medicamentos¹. El cambio climático afecta al suelo, el agua, la piel y el microbioma intestinal, lo que provoca un estrés persistente en la fisiología animal y la adaptación ambiental. Se ha demostrado que este fenómeno compromete las respuestas inmunitarias, haciendo que los animales sean más susceptibles a los patógenos emergentes, lo que puede tener consecuencias letales y potencialmente conducir a la extinción de ciertas especies 2,3,4,5. Un ejemplo destacado es el síndrome de la nariz blanca (WNS), una enfermedad causada por el hongo Pseudogymnoascus destructans, que afecta a los murciélagos en hibernación. Esta enfermedad y otras no fueron identificadas hasta que en 2006 ocurrió un evento de mortalidad sustancial en el continente americano⁶. Para mitigar los daños causados por estos patógenos, los investigadores han recurrido a la administración de antimicóticos, como el itraconazol y el ketoconazol, y probióticos, incluida la inoculación con la microbiota beneficiosa Pseudomonas fluorescens⁷. Otro ejemplo de enfermedad causada por un hongo es el de Ophidiomyces ophiodiicola, un hongo que causa dermatitis y enfermedades multisistémicas tanto en serpientes cautivas como silvestres ^4,8.

Estos estudios subrayan la necesidad de aumentar la conciencia y la comprensión de las enfermedades fúngicas en los animales silvestres para implementar soluciones prácticas de manera expedita. Se han reportado infecciones fúngicas en anfibios, y un patógeno prevalente que afecta a estos animales es el hongo acuático Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), que causa quitridiomicosis. Esta enfermedad causa lesiones cutáneas graves y altera la función normal de la piel en animales susceptibles, lo que puede provocar la mortalidad⁹. Este patógeno se ha diseminado ampliamente desde el siglo XX, contribuyendo a la extinción de 90 especies de anfibios. La prevalencia de estas infecciones plantea un desafío sustancial para prevenirlas e identificar tratamientos efectivos, ya que requieren considerar varios factores ecológicos, fisiológicos, del microbioma y otros factores¹⁰.

Es un fenómeno bien documentado que los microorganismos patógenos poseen la capacidad de desarrollar rápidamente mecanismos de resistencia a través de la codificación genética, un proceso que puede ser ejemplificado por la producción de bombas de eflujo externas para medicamentos y antibióticos¹¹. Además, se ha observado que estos microorganismos modifican la composición lipídica de la membrana con el objetivo de contrarrestar los efectos de moléculas específicas¹². El campo de las secuencias de proteínas ha suscitado un gran interés, especialmente en el contexto de su integración en los enfoques de tratamiento y la construcción de modelos de estructura de proteínas. Estos modelos están diseñados para optimizar el tiempo y los recursos del laboratorio antes del inicio de la síntesis de proteínas¹³. La prevención de infecciones en estos casos es una tarea compleja que involucra múltiples factores ecológicos, fisiológicos y del microbioma¹⁴. Este enfoque facilita una gestión más eficaz del tiempo y los recursos en el laboratorio y enfatiza la complejidad de la tarea.

Con el fin de mejorar el potencial de aplicaciones prácticas de los compuestos existentes, así como de crear nuevos compuestos con un potencial más significativo para dichas aplicaciones, es imperativo emplear la experiencia de diversas disciplinas, incluidas la química, la biología molecular, la física y la programación. Para ello, se dispone de varias herramientas, entre las que se encuentran I-TASSER (Iterative Threading ASSembly Refinement)^15,16 y trRosetta ^17,18 (Protein structure prediction by TRansform-restrained Rosetta). predicción de proteínas estructurales y UCSF Chimera (un sistema de visualización para investigación y análisis exploratorio de la Universidad de California, San Francisco)¹⁹ y HEX loria (un programa interactivo de acoplamiento de proteínas y superposición molecular)²⁰ para el acoplamiento molecular y la edición de archivos PDB.

I-TASSER es un servidor en línea automatizado que predice la estructura y la función. Se puede acceder a este programa a través de un navegador web o como descarga. En la página de envío, los usuarios pueden ingresar la secuencia en formato FASTA o descargar un archivo en formato .txt. El proceso del servidor implica la identificación de plantillas estructurales con un grado de homología, como se describe en Local Meta-Threading Server LOMETS 20,21,22,23,24,25. Tras el procesamiento de un millón de resultados potenciales por parte del servidor, se inicia un proceso de filtración y los fragmentos se seleccionan en función de la desviación cuadrática de la mediana de la raíz (RMSD), TM (una métrica utilizada para evaluar la similitud estructural entre dos modelos) y la puntuación C (una métrica utilizada para evaluar la confianza de los modelos estructurales de proteínas generados por herramientas). Los usuarios pueden personalizar los resultados en función de los parámetros predeterminados proporcionados en el programa o introducir sus propios valores en función de su secuencia específica o de sus expectativas estructurales 20,21,22,23,24,25.

trRosetta es un programa altamente efectivo para la predicción de la estructura de proteínas. En este servidor, los usuarios pueden enviar secuencias en formato de archivo, TXT, FASTA, secuencia de entrada o secuencias de alineación múltiple (MSA). Este programa permite a los usuarios seleccionar entre plantillas o ejecutar trRosetta-single para el plegado de secuencias. Estos servidores utilizan una red de aprendizaje profundo para generar predicciones estructurales. El proceso de predicción de secuencia implica un paso inicial de predicción de mapa de contacto y distancia, seguido de la selección de las cinco plantillas principales para el modelo final y un paso para minimizar la energía para el plegado y el refinamiento¹⁷.

El servidor HADDOCK (High Ambiguity Protein-Protein Docking) es una herramienta computacional que facilita el acoplamiento flexible de dos o más archivos PDB, que abarcan estructuras de proteínas, péptidos, ligandos y receptores. Este servidor emplea un enfoque que incorpora AIRs (Restricciones de Interacción Ambigua), que codifican información de proteínas predichas o identificadas durante el proceso de acoplamiento. Los AIR abarcan restricciones de aminoácidos, clasificándolos como aminoácidos pasivos o activos. La incorporación de aminoácidos activos es de particular importancia, ya que son indicativos de posibles sitios de unión o interacción entre receptores de proteínas. El diseño del programa incorpora la exposición a disolventes en el modelo²⁶.

HEX Loria es un servidor interactivo en línea que facilita el análisis de complejos proteicos y acoplamientos moleculares. Este servidor puede leer archivos de coordenadas en el formato de banco de datos de proteínas (PDB) y generar rápidamente cálculos de acoplamiento utilizando objetivos gráficos NVIDIA o CUDA. El programa puede producir hasta 1.000 predicciones de acoplamiento y utiliza la correlación de Fourier para las orientaciones generales de dos moléculas²⁷. La interfaz de HEX Loria está diseñada para ser fácil de usar, lo que permite a los investigadores cargar sin problemas sus estructuras de proteínas y configurar los parámetros para las simulaciones de acoplamiento. Se ha demostrado que la capacidad del servidor para utilizar unidades de procesamiento de gráficos NVIDIA o CUDA da como resultado una aceleración sustancial del tiempo de cálculo, lo que permite a los investigadores obtener resultados con mayor rapidez. Además, HEX Loria ofrece una gama de opciones de visualización para acoplar los resultados, lo que permite a los usuarios realizar análisis detallados de las interacciones proteína-proteína predichas.

La utilización de UCSF Chimera es imprescindible para garantizar la precisión de los resultados de la investigación. Este software requiere instalación para la ejecución del presente protocolo, y se emplearán las funcionalidades subsiguientes: medición de distancias interatómicas y varias otras tareas analíticas. El software cuenta con funciones como etiquetado, coloración, renderizado de superficies y exportación de figuras en formatos JPG o PNG. La incorporación de etiquetas y colores facilita la identificación de aminoácidos con una alta probabilidad de contacto entre el receptor y la proteína antimicrobiana diseñada. Además, permite la medición precisa de la distancia entre estos aminoácidos.

Este protocolo tiene como objetivo identificar opciones de tratamiento alternativas para el problema de salud emergente que afecta a los anfibios. La quitridiomicosis, una infección fúngica de la piel, se ha observado en varias etapas del desarrollo de los anfibios. La principal fuente de infección entre estos animales son los cuerpos de agua donde normalmente residen y participan en diversas actividades. El desarrollo de un agente antifúngico eficaz requiere la identificación de al menos tres objetivos moleculares: la interacción con la pared celular mediante cargas, la unión a la membrana plasmática y, por último, la unión y la interacción con una proteína receptora a nivel de membrana, que desempeña un papel vital en el hongo Bd.

Protocolo

1. Identificar secuencias diana moleculares en Bd

NOTA: La selección de aminoácidos en la secuencia se basa en las recomendaciones de la literatura. Los aminoácidos clave incluyen K, W, G, A, V, I y L. Para saber qué programas utilizar, consulte la Tabla de Materiales.

1. Recupere secuencias objetivo de la base de datos NCBI.
   1. Acceda a la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) en https://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
   2. Seleccione Todas las bases de datos y elija Nucleótido como categoría de búsqueda.
   3. Introduce Batrachochytrium dendrobatidis en la barra de búsqueda y filtra los resultados por cepa y especie.
   4. Descargue y guarde la secuencia en un editor de texto o en formato FASTA para su posterior análisis.

2. Analice la secuencia por BLAST o SMART BLAST

1. Realice una búsqueda BLAST.
   1. Abra un navegador web y vaya a BLAST (Herramienta básica de búsqueda de alineación local).
   2. Seleccione Protein BLAST para comparar la secuencia de consulta con las bases de datos de proteínas https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.
2. Verificar la especificidad del objetivo.
   1. Asegúrese de que el objetivo molecular seleccionado no esté presente en otras especies. Si el objetivo aparece en varias especies, repita la selección de la secuencia hasta que se confirme la especificidad (ver Figura 1).
      NOTA: Este paso garantiza que ningún objetivo molecular secundario indeseable interfiera con la función de AMP o proteínas antifúngicas
3. Comprobar la homología en las secuencias de proteínas.
   1. Verificar que la secuencia de aminoácidos diseñada no coincida con las proteínas homólogas de otras especies.
      NOTA: Este paso confirma que la función antifúngica es específica de los objetivos previstos

3. Diseñar la secuencia de proteínas antimicrobianas

NOTA: El contenido y la secuencia de aminoácidos deben adaptarse a la función proteica deseada, específicamente a la actividad antifúngica. La secuencia diseñada debe codificar una proteína con efectos antimicóticos contra Bd. Compruébalo en el servidor de predicción^{Antifp 28}.

1. Revisión de la literatura y diseño de secuencias
   1. Llevar a cabo una revisión exhaustiva de la literatura reciente para identificar las características clave del Bd y los posibles mecanismos antimicrobianos.
      NOTA: Estudios previos describen péptidos antimicrobianos (AMPs) contra Bd, sintetizados por diversos animales y microorganismos. La fórmula²⁹de Shai proporciona un marco para el diseño de péptidos antifúngicos sintéticos. Este método debe utilizarse para optimizar las secuencias de proteínas para obtener la máxima actividad antifúngica.

4. Predecir la estructura 3D con I-TASSER

NOTA: Este protocolo se aplica al objetivo molecular y a la secuencia antimicrobiana diseñada.

1. Para acceder y enviar secuencias, visite el servidor I-TASSER para https://zhanggroup.org/I-TASSER/ de predicción de la estructura y función de las proteínas.
2. Regístrese utilizando un correo electrónico institucional para recibir un nombre de usuario y una contraseña para acceder a la herramienta.
3. Envíe el objetivo molecular o la secuencia diseñada en formato FASTA, .txt archivo o copie y pegue directamente en el campo de entrada.
4. Asigne un nombre único a la secuencia.
5. Haga clic en Enviar y deje que el programa analice la secuencia, proporcionando un tiempo de procesamiento estimado.
   NOTA: Detenga el protocolo hasta que se reciban los resultados. El tiempo de procesamiento suele oscilar entre 24 y 72 horas para las proteínas pequeñas (≤50 aminoácidos) y puede llevar más tiempo para las proteínas más grandes (hasta 3.000 aminoácidos).
   Orientación sobre la selección de herramientas: Utilice I-TASSER para proteínas pequeñas, como péptidos antimicrobianos diseñados. En el caso de las proteínas grandes, utilice trRosetta, que está optimizado para el modelado estructural complejo.

5. Predecir la estructura 3D usando trRosetta

1. Visite el servidor web de trRosetta: https://yanglab.qd.sdu.edu.cn/trRosetta/.
2. Introduzca la secuencia del receptor objetivo en formato FASTA, .txt o MSA, o péguela directamente en el servidor.
3. Asigne un nombre a la proteína predicha estructuralmente.
4. Haga clic en Enviar, asegurándose de que la opción para excluir plantillas esté seleccionada. Elija homólogos únicos de trRosettaX para iniciar el proceso de predicción.
   NOTA: Detenga el protocolo hasta que se reciban los resultados.
5. Espere un correo electrónico de confirmación después de un envío exitoso.
6. Analice los resultados de la predicción.
   1. Compruebe que la puntuación TM es una medida de la calidad del modelo.
   2. Examine los mapas de contacto, los mapas de distancia por aminoácido y los mapas de rotación de los carbonos alfa y beta en los ángulos ω (omega), θ (theta) y φ (phi).
7. Descargue los resultados en formato ZIP para su posterior análisis.

6. Acoplamiento molecular y análisis de interacción (utilizando HADDOCK)

1. Acceda al servidor de acoplamiento HADDOCK: https://wenmr.science.uu.nl/haddock2.4/.
2. Registre una cuenta utilizando un correo electrónico institucional, confirme la cuenta e inicie sesión.
3. Vuelva a la página de inicio, seleccione Nuevo trabajo e inicie un envío.
4. En la página de envío de HADDOCK, complete la información requerida: nombre del trabajo, número de molécula (en este caso, 2). Seleccionar todo.
5. Subir Moléculas para acoplamiento. Cargue las estructuras de PDB para el receptor y el ligando. Seleccione el acoplamiento proteína-ligando para ambos.
6. Repita los pasos para la presentación de ligandos, seleccione todas las cadenas y deje la configuración restante como predeterminada.
7. Haga clic en Siguiente para el siguiente paso de envío.
   NOTA: En las secciones 1 y 2, agregue la lista de aminoácidos involucrados en las interacciones receptor-ligando y márquelos como residuos activos. Los residuos pasivos permanecen predefinidos. Los sitios activos son los sitios de interacción y deben elegirse de acuerdo con las características de la proteína diseñada y los aminoácidos expuestos de la proteína receptora.
8. Finalice y ejecute el proceso de acoplamiento.
   1. Haga clic en Siguiente para mantener los parámetros de acoplamiento predeterminados sin cambios.
   2. Haga clic en Enviar para comenzar el procesamiento.
      NOTA: El tiempo de procesamiento esperado oscila entre 24 y 72 h.
9. Revise los resultados del acoplamiento.
   1. El servidor selecciona y clasifica automáticamente los mejores resultados de acoplamiento. Analice las interacciones de los aminoácidos utilizando software de visualización estructural (por ejemplo, PyMOL o UCSF Chimera).
10. Descargue las estructuras acopladas finales en formato PDB para su posterior estudio.
    NOTA: Consulte el Archivo Suplementario 1: Figura Suplementaria S1, Figura Suplementaria S2, Figura Suplementaria S3, Figura Suplementaria S4 y Figura Suplementaria S5.

7. Medir distancias (OPCIONAL) [ver Archivo Suplementario 1: Figura Suplementaria S6, Figura Suplementaria S7 y Figura Suplementaria S8.]

1. Analice los resultados de acoplamiento mediante un programa de visualización de estructuras (PDB). Abra el archivo PDB de acoplamiento molecular en UCSF Chimera y evalúe la proximidad estructural y los posibles sitios de unión (distancias medidas).
2. Haga doble clic en el icono de Quimera para abrir PDB. Seleccione Archivo, Abrir y elija un archivo en la ventana del directorio de documentos .
3. Identificar átomos. Vaya a acciones, átomos/enlaces y seleccione mostrar.
4. Seleccione los átomos más cercanos al ligando y al receptor. Seleccione el átomo 1 con Ctrl+clic y el átomo 2 con Ctrl+Mayús+Clic.
5. Vaya a herramientas, análisis de estructura y seleccione distancias.
6. Haga clic en Crear (verificar la selección de átomos). La ventana muestra los aminoácidos y la ubicación de los átomos 1 y 2.
   NOTA: La columna de distancia muestra los ángulos entre los átomos.
7. Descargue la tabla y guárdela en el equipo local.
   NOTA: Consulte el Archivo Suplementario 1 para obtener información adicional.

Resultados

La secuencia en desarrollo utiliza la siguiente fórmula: K(X)³KW(X)²K(X)²K, donde (X) puede ser G, A, V, I o L²⁸. Los resultados de la búsqueda obtenidos incluyeron secuencias proteicas de más de 300 aminoácidos, las cuales fueron seleccionadas debido a su condición de secuencias proteicas completas, en contraposición a secuencias parciales. Hay que tener en cuenta que las secuencias completas son esenciales para el estudio. Las funciones de cada receptor/canal de ...

Discusión

El enfoque bioinformático empleado en la predicción estructural de proteínas tiene limitaciones inherentes debido a su dependencia de programas computacionales. Estos programas intentan aproximarse a las estructuras reales de las proteínas, pero están limitados por factores como la temperatura, la solubilidad y la presencia de disolventes, que pueden no replicarse completamente en condiciones vivos. Además, el método depende de la identificación precisa de las proteínas clave conservadas...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
BLAST	N/A	N/A	Servidor en línea
Ordenador	AMD	N/A	SO: XP, W7, W8, W10, ubuntu, linux
Servidor HADDOCK	BONVINLAB	N/A	Servidor en línea
HEX 5.2	BBSRC-INRIA	N/A	Servidor de descarga en línea
I-TASSER	ZHANG LAB	N/A	Servidor de descarga en línea
MUSCLE	N/A	N/A	Servidor en línea
NCBI	N/A	N/A	Servidor en línea
PYMOL	SCHRÖ DINGER	N/D	Download-XP, W7, W8, W10, W11, LINUX
SWISS-MODEL	BIOZENTRUM	N/A	Servidor en línea
trRosetta server	YANG LAB	N/A	Servidor en línea
USCF CHIMERA	RBVI	N/A	Download-XP, W7, W8, W10, W11, LINUX