Un protocolo de código abierto para la segmentación basada en aprendizaje profundo de estructuras tubulares en imágenes de microscopía de fluorescencia 3D

Summary

Este protocolo presenta una caja de herramientas de código abierto que ofrece una línea completa para segmentar estructuras tubulares en imágenes de microscopía de fluorescencia tridimensionales (3D). Empleando el aprendizaje profundo con el aumento de datos basado en simulación, entrena los modelos U-Net y Attention U-Net, proporciona evaluaciones cualitativas y cuantitativas e incluye cuadernos fáciles de usar para el entrenamiento, la inferencia y la visualización en todo momento.

Abstract

La segmentación de estructuras tubulares en tejidos biológicos densos a partir de imágenes de microscopía de fluorescencia 3D es fundamental para estudiar tejidos complejos, pero sigue siendo un desafío debido a la complejidad, la variabilidad y los problemas de calidad de la imagen. Aquí, presentamos una caja de herramientas de código abierto y fácil de usar para la segmentación de extremo a extremo de estructuras tubulares en imágenes 3D, accesible para investigadores sin capacitación formal en programación. La caja de herramientas presenta cuadernos interactivos de Jupyter que implementan dos arquitecturas de aprendizaje profundo simples pero eficientes: 3D U-Net y 3D U-Net con mecanismos de atención, para una segmentación 3D precisa de redes tubulares. Una innovación clave es nuestra estrategia de aumento de datos basada en simulación, que mejora el rendimiento del modelo incluso con datos de entrenamiento mínimos (tan solo una imagen 3D). Empleando máscaras proporcionadas por el usuario, el protocolo genera imágenes de microscopía artificial con diferentes relaciones señal-ruido y simula artefactos de imagen realistas, incluida la tinción desigual, la convolución de la función de dispersión puntual, las variaciones de intensidad axial y el ruido de Poisson y Gaussian. El protocolo guía sistemáticamente a los usuarios a través del aumento de datos, el entrenamiento del modelo, la evaluación cualitativa y cuantitativa de los conjuntos de prueba y la inferencia de nuevas imágenes. Validamos la caja de herramientas analizando dos redes tubulares morfológicamente distintas en tejido hepático de ratón, los canalículos biliares y las redes sinusoidales, lo que demuestra que ambas arquitecturas funcionan bien, con la U-Net de atención superando ligeramente a la U-Net estándar cuando se entrena con datos aumentados. Nuestra completa caja de herramientas, ejecutable en unidades de procesamiento de gráficos (GPU) locales, clústeres de computación de alto rendimiento o plataformas en la nube, contribuye a la democratización del análisis avanzado de imágenes para un amplio espectro de investigadores.

Introduction

El análisis cuantitativo de las estructuras tubulares en los tejidos biológicos, como los vasos sanguíneos, las redes neuronales y los conductos biliares en el hígado, es fundamental para comprender los procesos fisiológicos y patológicos, incluida la angiogénesis, la metástasis tumoral y el desarrollo de órganos ^1,2,3. La microscopía de fluorescencia tridimensional (3D) se ha convertido en una herramienta fundamental para obtener imágenes de estas redes complejas, ofreciendo una alta resolución espacial y permitiendo la visualización de arquitecturas de tejidos intrincados en su contexto nativo 4,5,6,7. Sin embargo, la segmentación precisa de estructuras tubulares de tejidos biológicos densos sigue siendo un desafío formidable debido a los artefactos de imagen, la variabilidad de la señal y la morfología heterogénea inherente a los especímenes biológicos. Los métodos tradicionales de segmentación, como el umbral, el crecimiento de regiones y los algoritmos basados en modelos, a menudo requieren una amplia intervención manual y un ajuste meticuloso de los parámetros, que puede llevar mucho tiempo y ser subjetivo, especialmente para tejidos 3D complejos como el hígado 8,9,10,11,12 . Con frecuencia, estos enfoques no son robustos a la variabilidad inherente a las muestras biológicas y las condiciones de imagen, lo que limita su generalización en diferentes conjuntos de datos y configuraciones experimentales. Se han desarrollado herramientas de software como ImageJ¹³ y TiQuant⁸ para ayudar en el análisis y la cuantificación de tejidos; sin embargo, pueden carecer de la flexibilidad o escalabilidad necesarias para reconstrucciones 3D integrales de redes tubulares complejas de manera completamente automática.

El aprendizaje profundo ha revolucionado el análisis de imágenes biomédicas al automatizar las tareas de segmentación con alta precisión y eficiencia 14,15,16. Las redes neuronales convolucionales (CNN), en particular las arquitecturas codificador-decodificador como U-Net, han demostrado un rendimiento excepcional en diversas aplicaciones de imágenes biomédicas 17,18,19. Además, la extensión de U-Net a datos 3D (3D U-Net) permite un procesamiento efectivo de imágenes volumétricas, capturando el contexto espacial en las tres dimensiones y mejorando la precisión de la segmentación para estructuras complejas²⁰. La incorporación de mecanismos de atención en estas arquitecturas (Attention U-Net) mejora aún más el rendimiento al permitir que la red se centre en las características más destacadas mientras suprime el ruido de fondo irrelevante 18,21,22. A pesar de su potencial, la implementación de modelos de aprendizaje profundo para la segmentación 3D plantea desafíos importantes. El entrenamiento de estos modelos generalmente requiere una experiencia sustancial en programación, acceso a poderosos recursos computacionales y grandes conjuntos de datos anotados, que pueden no estar disponibles para todos los investigadores. La anotación de imágenes 3D es particularmente laboriosa, ya que a menudo implica el etiquetado manual de estructuras complejas en numerosos sectores, lo que puede ser prohibitivo para grandes conjuntos de datos. Si bien las técnicas de aumento de datos pueden aliviar la necesidad de datos de entrenamiento extensos al aumentar artificialmente la diversidad del conjunto de datos a través de transformaciones como rotación, escalado y volteo, es posible que los métodos de aumento tradicionales no capturen completamente la variabilidad y complejidad de las imágenes biológicas, especialmente aquellas que involucran estructuras 3D intrincadas.

Para abordar estas limitaciones, presentamos una caja de herramientas de código abierto y fácil de usar para la segmentación de extremo a extremo de estructuras tubulares en imágenes de microscopía 3D. Esta caja de herramientas emplea cuadernos interactivos de Jupyter e implementa dos sólidos métodos de aprendizaje profundo: 3D U-Net^17,20 y 3D U-Net con mecanismos de atención^18,21, para una segmentación precisa de estructuras tubulares 3D sin necesidad de amplios conocimientos de programación. Una innovación clave de nuestro protocolo es una estrategia de aumento de datos basada en simulación que mejora el rendimiento del modelo incluso con datos de entrenamiento mínimos, tan solo una imagen 3D. Al aprovechar las máscaras proporcionadas por el usuario, el protocolo genera imágenes de microscopía artificial con diferentes relaciones señal-ruido y simula artefactos de imagen realistas, incluida la tinción desigual, la convolución con la función de dispersión puntual (PSF) de los microscopios confocales, las variaciones de intensidad axial debidas a la penetración o dispersión de anticuerpos y la presencia de ruido de Poisson y Gaussian. Este aumento basado en simulación no solo aumenta la cantidad de datos de entrenamiento, sino que también enriquece el conjunto de datos con variaciones realistas, mejorando la generalización del modelo a datos invisibles. El protocolo guía sistemáticamente a los usuarios a través del aumento de datos, el entrenamiento del modelo, la evaluación cualitativa y cuantitativa de las predicciones del modelo en conjuntos de prueba y la inferencia en nuevas imágenes (Figura 1). Validamos la utilidad de nuestra caja de herramientas analizando dos redes tubulares morfológicamente distintas en tejido hepático de ratón: los canalículos biliares y las redes sinusoidales. Estas redes presentan diferentes características estructurales y desafíos de imagen, lo que proporciona un banco de pruebas sólido para nuestros métodos.

Si bien la mayoría de los estudios existentes se centran en el análisis de imágenes 2D, lo que limita la comprensión de arquitecturas 3D complejas, nuestro enfoque enfatiza la segmentación 3D para capturar toda la complejidad de las estructuras tisulares. Al integrar arquitecturas de aprendizaje profundo bien establecidas y potentes con una interfaz fácil de usar, nuestra caja de herramientas contribuye a la democratización del acceso a herramientas de análisis de imágenes de última generación. Nuestra canalización se puede ejecutar en GPU locales, clústeres de computación de alto rendimiento o plataformas en la nube como Google Colab, lo que hace que el análisis avanzado de imágenes sea accesible para una gama más amplia de investigadores, independientemente de los recursos computacionales. Este trabajo contribuye al campo al proporcionar una solución accesible e integral para la segmentación 3D de estructuras tubulares, facilitando análisis cuantitativos que son esenciales para avanzar en nuestra comprensión de la función tisular y los mecanismos de la enfermedad.

Protocol

1. Instalación y configuración de la caja de herramientas

1. Descarga de la caja de herramientas de GitHub
   1. Abra un navegador web y navegue hasta el repositorio de GitHub de la caja de herramientas: https://github.com/hernanmorales-navarrete/3DMicroscopyImageSegmentation 
   2. Descárguelo usando Git clone (opción A). Asegúrese de que Git esté instalado en el sistema; Si no es así, descárguelo de https://git-scm.com/downloads e instálelo. Abra una terminal (Unix/Linux/macOS) o el símbolo del sistema (Windows) y navegue hasta el directorio donde se almacenará la caja de herramientas. Clonar el repositorio escribiendo:
      git clone https://github.com/hernanmorales-navarrete/3DMicroscopyImageSegmentation.git
   3. Descárgalo en el archivo ZIP (opción B). En la página de GitHub, haga clic en el botón verde Código y seleccione Descargar ZIP. Guarde el archivo ZIP en el directorio preferido y extraiga el contenido del archivo ZIP.
2. Configuración del entorno de Conda
   1. Instale Anaconda o Miniconda. Si aún no está instalado, descargue Anaconda desde:
      https://www.anaconda.com/download o Miniconda de https://docs.anaconda.com/miniconda/. Siga las instrucciones de instalación del sistema operativo que se está utilizando.
   2. Abra una terminal o símbolo del sistema. Cree un nuevo entorno de Conda denominado img_seg_env con Python 3.10 escribiendo:
      conda create -n img_seg_env python=3.10
   3. Active el entorno de Conda escribiendo:
      Conda activa img_seg_env
      o activar img_seg_env para Windows
3. Instale las dependencias necesarias mediante requirements.txt. Asegúrese de estar en el directorio raíz de la caja de herramientas. Instale los paquetes de Python necesarios usando pip escribiendo:
   pip install -r requirements.txt
   NOTA: Este comando lee el archivo requirements.txt e instala todos los paquetes necesarios
   1. Confirme que los paquetes como numpy, scipy, matplotlib, tensorflow y jupyter estén instalados. Verifique la instalación correcta y enumere los paquetes instalados escribiendo:
      Lista de pips
4. Inicio de Jupyter Notebook
   1. Mientras aún está en el entorno de Conda activado, inicie Jupyter Notebook escribiendo:
      Cuaderno de Jupyter
   2. Si es preferible JupyterLab , que ofrece una interfaz mejorada, ejecute:
      Laboratorio de Jupyter
   3. Acceso a la interfaz de Jupyter : Espere a que se abra automáticamente un navegador web que muestre la interfaz de Jupyter . Si no se abre automáticamente, tome la URL proporcionada en el terminal (por ejemplo, http://localhost:8888/tree) y ábrala manualmente en el navegador web.
   4. En la interfaz de Jupyter , vaya al directorio que contiene los cuadernos de Jupyter proporcionados con la caja de herramientas (por ejemplo, /path/to/3DMicroscopyImageSegmentation-main/).

2. Preparación de datos (Figura 1A)

1. Generación de datos de imagen de estructuras tubulares
   1. Obtener las imágenes de microscopía 3D
      1. Descargue las imágenes 3D disponibles públicamente del tejido hepático de ratón desde: https://zenodo.org/records/14029574 El conjunto de datos incluye imágenes confocales 3D de canalículos biliares (BC) y redes sinusoidales recortadas de las imágenes originales de⁹. Alternativamente, use un conjunto de imágenes generadas.
   2. Obtener la PSF 3D
      1. Descargue una imagen de función de dispersión de punto real (PSF) de https://github.com/hernanmorales-navarrete/3DMicroscopyImageSegmentation/blob/main/data/raw/PSF.tif Alternativamente, genere una PSF teórica utilizando DeconvolutionLab2²³ con los parámetros del microscopio.
   3. Utilice el siguiente método de segmentación para generar máscaras binarias de las estructuras tubulares:
      1. Segmentación semiautomática usando MorpholibJ en Fiji
         1. Abre Fiji. Cargue la imagen de microscopía.
         2. Ir al menú Proceso | Binario | MakeBinary, elija Otsu como método y presione OK.
         3. Abra el complemento MorpholibJ y navegue hasta Complementos | MorpholibJ | Filtrado | Filtros morfológicos (3D).
         4. Elija la operación Cierre, establezca la forma del elemento en Bola (funciona mejor para estructuras tubulares) y elija un radio adecuado en vóxeles. Haga clic en Mostrar elemento para visualizar el elemento de estructuración. Para estructuras tubulares, pruebe con valores de 3 a 8 píxeles.
            NOTA: Un radio más grande puede introducir artefactos.
         5. Guarde el resultado como 'image_closing.tif' haciendo clic en Archivo | Guardar como... | Tiff....
            NOTA: Asegúrese de que cada máscara generada corresponda al archivo de imagen original correcto, con nombres de archivo coincidentes. Ejemplos de máscaras precalculadas se pueden descargar desde: https://doi.org/10.5281/zenodo.14029574
   4. Seleccionar manualmente las máscaras.
      1. Descargue e instale Labkit²⁴ siguiendo las instrucciones en: https://github.com/juglab/labkit-ui. Abra cada máscara preliminar y utilice las herramientas de dibujo y borrado para corregir manualmente los errores de segmentación añadiendo o eliminando regiones para delinear con precisión las estructuras tubulares. Guarde la máscara seleccionada, manteniendo el mismo nombre de archivo que la imagen original.
      2. Uso de Napari²⁵
         1. Abra un símbolo del sistema y active el entorno Napari (si aún no está activo):
            conda activar napari_env
         2. Iniciar napari:
            Napari
         3. Arrastre y suelte tanto la imagen de microscopía como su máscara binaria correspondiente en napari.
         4. Convierta la máscara binaria en una capa de etiquetas haciendo clic con el botón derecho en el nombre de la capa de máscara y seleccione Convertir en etiquetas.
         5. Establezca el ancho del contorno en 1 y comience la curación. Para rellenar agujeros, utilice la herramienta Selección para seleccionar el valor de la máscara. Active la herramienta Llenar cubo y haga clic dentro del agujero.
            NOTA: Si se llena toda la imagen, es probable que la estructura tenga un espacio. Usa el Pincel para cerrar el límite antes de volver a intentar la herramienta Llenar cubo .
         6. Una vez completada la curación, guarde la máscara corregida navegando a Archivo | Guardar capas seleccionadas | TIFF. Abra la máscara corregida en Fiji y conviértala a formato de 8 bits haciendo clic en Imagen | Tipo | 8 bits. Guarde la imagen final de 8 bits.
2. Organización del conjunto de datos
   1. Cree la estructura de directorios del conjunto de datos.
      1. Elija un directorio donde se almacenará el conjunto de datos (por ejemplo, /path/to/your/dataset). Cree la siguiente estructura de carpetas:
         conjunto de datos/
         ├── training_data/
         │ ├── imágenes/
         │ │ ├── img1.tif
         │ │ ├── img2.tif
         │   │   └── ...
         │ └── máscaras/
         │ ├── img1.tif
         │ ├── img2.tif
         │       └── ...
         └── test_data/
         ├── imágenes/
         │ ├── imgtest1.tif
         │ ├── imgtest2.tif
         │   └── ...
         └── máscaras/
         ├── imgtest1.tif
         ├── imgtest2.tif
         └── ...
   2. Organiza las imágenes y las máscaras.
      1. Datos de entrenamiento
         1. Coloque las imágenes de microscopía 3D destinadas al entrenamiento en dataset/training_data/images/. Asegúrese de que los nombres de archivo sean consistentes (por ejemplo, img1.tif, img2.tif).
         2. Coloque las máscaras binarias seleccionadas correspondientes en dataset/training_data/masks/, asegurándose de que los nombres de archivo coincidan con los de la carpeta de imágenes (por ejemplo, img1.tif, img2.tif).
      2. Datos de prueba
         1. Coloque las imágenes de microscopía 3D destinadas a la prueba en dataset/test_data/images/. Utilice nombres de archivo coherentes que no se superpongan con los datos de entrenamiento.
         2. Coloque las máscaras binarias seleccionadas correspondientes en dataset/test_data/masks/. Asegúrese de que los nombres de archivo coincidan con los de la carpeta de imágenes de prueba.

3. Ejecución de la canalización completa (Figura 1B-E)

1. Abra el cuaderno de Jupyter Notebook.
   1. Active el entorno de Conda img_seg_env escribiendo:
      Conda activa img_seg_env
   2. Vaya a la carpeta raíz del proyecto:
      cd /ruta/a/CódigoDeSegmentaciónDeImagen/
   3. Inicie la interfaz de Jupyter escribiendo jupyter lab o jupyter notebook.
   4. En el explorador web, abra el cuaderno denominado process_images.ipynb.
2. Configuración del entorno
   1. Importe bibliotecas y configure el acceso a la GPU.
      NOTA: En la primera y la segunda celda del notebook, se importan las bibliotecas y TensorFlow se configura para usar la GPU con el crecimiento de memoria habilitado. Esto garantiza que TensorFlow no asigne toda la memoria de la GPU a la vez y sea compatible con varias tareas. No cambie el contenido de la celda. Ejecute las celdas presionando el botón de reproducción .
3. Configuración de parámetros de entrada
   1. Localice la celda de configuración de entrada y modifíquela según el conjunto de datos:
      source_dir = '/ruta/a/datos/BC/'
      psf_path = '/ruta/a/PSF.tif'
      code_dir = '/ruta/a/código/'
      out_dir = '/ruta/a/salida/'
      out_name = 'BC'
   2. Ejecute la celda 3 presionando el botón de reproducción .
   3. No cambie el contenido de la celda. Ejecute la celda presionando el botón de reproducción en la celda 4.
4. Generación de parches
   1. Ejecute la celda Crear conjuntos de datos para generar parches de entrenamiento y prueba. No cambie el contenido de las celdas. Ejecute las celdas presionando el botón de reproducción .
5. Entrenamiento de modelos
   1. Ejecute la celda Entrenar modelos para entrenar UNet3D con tres configuraciones de aumento: NONE, STANDARD y Simulation-based.
   2. Reemplace 'UNet3D' por 'UNet3D', 'AttentionUNet3D' para entrenar a UNet3D con atención. Modifique la configuración de entrenamiento en config.py si es necesario (consulte el paso 3.9).
6. Generación de predicciones
   1. Ejecute la celda Generar predicciones para producir máscaras de segmentación en los datos de prueba. No cambie el contenido de las celdas. Ejecute las celdas presionando el botón de reproducción .
7. Evaluación y generación de parcelas
   1. Ejecute la celda Generar gráficos para generar diagramas de caja de métricas de evaluación.
8. Revisión e interpretación de los resultados
   1. Compruebe las salidas en las rutas definidas por out_images_path y out_plots_path.
   2. Examine diagramas de caja que comparan modelos y estrategias de aumento en métricas a nivel de parche e imagen completa.
9. Personalización a través de config.py
   1. Modifique los siguientes parámetros clave en config.py para personalizar la canalización:
      PATCH_SIZE = (64, 64, 64)
      PATCH_STEP = 64
      LEARNING_RATE = 1e-4
      BATCH_SIZE = 1
      NUM_EPOCHS = 50
      VALIDATION_SPLIT = 0,2
      EARLY_STOPPING_PATIENCE = 10
      AVAILABLE_MODELS = ["UNet3D", "AttentionUNet3D"]
      INTENSITY_PARAMS = { "background_level": 0.1, "local_variation_scale": 5, "z_decay_rate": 0.999, "noise_std": 0.1, "poisson_scale": 1.0, "intensity_scale": 1000.0, "snr_targets": [15, 10, 5, 4, 3, 2, 1]}
10. Solución de problemas
    1. En caso de errores de memoria insuficiente, reduzca BATCH_SIZE o PATCH_SIZE en config.py.
    2. Para problemas de GPU, asegúrese de que haya suficiente memoria disponible o reduzca el tamaño del lote.
11. Confirmación final
    1. Cuando se complete la canalización, busque el siguiente mensaje impreso:
       Todos los cálculos han finalizado con éxito
    2. Recomendamos encarecidamente ejecutar TensorFlow en un sistema Linux o Windows equipado con una GPU NVIDIA compatible con CUDA. Si tiene problemas para instalar tensorflow con CUDA, siga el proceso de instalación oficial: https://www.tensorflow.org/install/pip

Results

Adquisición de datos
Para validar nuestra caja de herramientas, analizamos dos redes tubulares distintas en tejido hepático de ratones adultos: canalículos biliares (BC) y redes sinusoidales. Para cada estructura, se utilizó una imagen de microscopía 3D de un solo animal para el entrenamiento, mientras que dos imágenes independientes de diferentes animales se utilizaron exclusivamente para las pruebas. Todas las imágenes del hígado se adquirieron con una resolución de vóxel isotrópico de 0,3 μm/vóxel, lo que garantiza un muestreo consistente en las tres dimensiones espaciales. El conjunto de datos, publicado originalmente en Morales-Navarrete et ^al.9, fue curado utilizando Labkit²⁵, proporcionando máscaras binarias de alta calidad de las estructuras tubulares utilizadas como verdad fundamental para el aprendizaje supervisado. Para la red sinusoidal, generamos dos tipos de máscaras binarias: una que delinea los bordes del tubo (representación hueca) y otra que captura el volumen tubular lleno, lo que permite diferentes estrategias de entrenamiento según la aplicación.

Además, evaluamos nuestra caja de herramientas en un conjunto de datos externo de vasos sanguíneos de todo el cerebro de Mus musculus adulto, proporcionado como parte del desafío SELMA3D 2024. Este conjunto de datos consta de imágenes de microscopía de hoja de luz 3D adquiridas en condiciones de vivienda estándar (ciclo de luz de 12 h / 12 h de oscuridad durante 3 meses) y está disponible a través de imágenes de BioStudies (S-BIAD1197)²⁶. Se utilizaron cinco imágenes cerebrales para el entrenamiento y diecinueve para las pruebas. Las pilas anisotrópicas originales se volvieron a muestrear a dimensiones de vóxeles isotrópicos utilizando interpolación lineal en Fiji para garantizar la compatibilidad con nuestra canalización de análisis.

Preprocesamiento
Para abordar el número limitado de imágenes 3D originales, aplicamos técnicas de aumento de datos que introdujeron artefactos de imagen realistas y simularon diferentes relaciones señal-ruido que van de 15 a 1. Este enfoque fue fundamental para mejorar la generalización y la solidez de los modelos.

La imagen de prueba se subdividió en parches no superpuestos de vóxeles de 64 x 64 x 64 para evaluar el rendimiento del modelo a nivel regional y evaluar la robustez en diferentes contextos espaciales dentro del mismo volumen 3D.

Arquitectura del modelo
Implementamos y comparamos dos arquitecturas de redes neuronales convolucionales adaptadas para la segmentación 3D:

Un U-Net¹⁷ 3D estándar, compuesto por bloques codificadores-decodificadores simétricos con una agrupación máxima de 2×2×2, capas convolucionales con activaciones ReLU y una convolución final de 1 x 1 x 1 seguida de una función sigmoide para la clasificación binaria.

Un Attention U-Net²⁷, que incorpora un mecanismo de atención que resalta dinámicamente las características sobresalientes y suprime el fondo irrelevante, mejorando la segmentación de estructuras complejas y variables como las redes tubulares hepáticas.

Protocolo de entrenamiento
Ambas arquitecturas se entrenaron utilizando las bibliotecas TensorFlow y Keras en un clúster de computación de alto rendimiento equipado con 32 núcleos de CPU, 128 GB de RAM y dos GPU NVIDIA A100 SXM4 de 40 GB. La Attention U-Net requirió más tiempo de capacitación debido a su complejidad arquitectónica, especialmente cuando se utilizan los conjuntos de datos aumentados (ver Tabla 1).

Métricas de evaluación
El rendimiento del modelo se evaluó cuantitativamente en las imágenes de prueba retenidas utilizando métricas de segmentación estándar: coeficiente de dados, intersección sobre unión (IoU), puntuación F1, similitud de volumen y sensibilidad y especificidad.

Los resultados de la CB, las estructuras sinusoidales y los vasos se resumen en la Figura 2, Figura 3, Figura 4 y Figura 5. Además, la Tabla 2 presenta una comparación de rendimiento con los métodos clásicos establecidos para la segmentación tubular, incluidos Otsu y umbrales adaptativos. Nuestros modelos, en particular el Attention U-Net entrenado con datos aumentados, superaron constantemente a estos métodos tradicionales en todas las métricas.

Análisis estadístico y robustez
El análisis de imágenes completas, así como los parches de vóxeles de 64 x 64 x 64 (Tabla 3) en el conjunto de prueba, también nos permitió cuantificar la variabilidad espacial en las predicciones del modelo entre regiones. Todos los modelos demostraron una alta precisión, y el Attention U-Net mostró un rendimiento consistentemente más alto, particularmente en la puntuación F1 y el coeficiente Dice. Los resultados cualitativos, que se muestran en la Figura 2A, B, Figura 3A, B, Figura 4A, B, Figura 5A, B, así como en el Video 1, Video 2, Video 3 y Video 4, respaldan estos hallazgos, ilustrando la delineación precisa de las estructuras tubulares en la mayoría de las regiones de los datos de prueba.

Explicación de anomalías en las métricas de rendimiento
Los valores más bajos de los diagramas de caja para el análisis de parches (Figura complementaria S1, Figura complementaria S2, Figura complementaria S3, Figura complementaria S4 y Figura complementaria S5) indican la presencia de valores atípicos de rendimiento en un subconjunto de parches de prueba. Asimismo, la segmentación subóptima en los fotogramas finales de los vídeos se puede atribuir a dos factores clave:

Efectos de límite: el rendimiento de la segmentación a menudo se degrada en los bordes de la imagen, donde las estructuras parciales están subrepresentadas o capturadas de forma incompleta, lo que genera una mayor incertidumbre y una posible clasificación errónea.

Degradación de la calidad de imagen en planos z más profundos: A pesar del tamaño del vóxel isotrópico, los factores biológicos y técnicos como la atenuación de la señal, la dispersión de la luz y la reducción del contraste en la dirección z conducen a una reducción de la calidad de la imagen hacia la parte inferior del volumen. Esta degradación complica la delineación precisa de los límites y contribuye a las inconsistencias de segmentación.

Estos factores son desafíos inherentes a las imágenes biológicas 3D y son particularmente impactantes en regiones distantes del plano de imágenes o que contienen límites de estructura ambiguos.

En resumen, nuestros resultados demuestran que los modelos de segmentación basados en el aprendizaje profundo, en particular el Attention U-Net entrenado con datos aumentados, ofrecen una delineación robusta y precisa de estructuras tubulares complejas en imágenes de microscopía hepática 3D. Al aprovechar conjuntos de datos seleccionados, estrategias de aumento realistas y mecanismos de atención, los modelos lograron un rendimiento superior en comparación con los métodos clásicos como el umbral. La evaluación regional utilizando parches de vóxeles de 64³ confirmó la consistencia y generalización del enfoque en diferentes regiones de la imagen y complejidades estructurales. Si bien persisten algunas limitaciones, principalmente debido a los efectos de contorno y la degradación de la imagen del plano z, nuestro estudio destaca la efectividad de las arquitecturas basadas en la atención y proporciona una solución validada de código abierto para la segmentación tubular 3D de alta precisión en imágenes biomédicas.

Figura 1: Flujo de trabajo para la segmentación 3D de estructuras tubulares en imágenes de microscopía de fluorescencia utilizando modelos U-Net y Attention U-Net. (A) Preparación de datos: Secciones esquemáticas en 2D de imágenes de microscopía de fluorescencia 3D de tejido hepático de ratón, que muestran las imágenes originales y las máscaras binarias correspondientes. (B) Aumento de datos: Aumento basado en simulación de los datos preparados, generando imágenes con diferentes relaciones señal/ruido (por ejemplo, SNR = 15 y SNR = 1). (C) Entrenamiento de modelos: Entrenamiento basado en parches de modelos U-Net y Attention U-Net utilizando datos originales y aumentados. Se generan parches de imagen y máscara de tamaño 64 x 64 x 64 para el entrenamiento. (D) Evaluación del modelo: Las métricas de rendimiento cuantitativas, incluida la recuperación y la puntuación F1, se calculan para cada modelo para evaluar la precisión de la segmentación en los conjuntos de datos de prueba. (E) Inferencia del modelo: Aplicación del modelo entrenado en imágenes no vistas para generar máscaras de segmentación predichas. Abreviatura: SNR = relación señal/ruido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Evaluación de los modelos U-Net y Attention U-Net para la segmentación de la red de Canalicul biliar a partir de imágenes de microscopía de fluorescencia 3D de tejido hepático de ratón. (A) Secciones 2D representativas (sección central) de imágenes de microscopía de fluorescencia 3D, que muestran la imagen original y la máscara de verdad fundamental correspondiente para BC en tejido hepático de ratón. Las imágenes de la parte superior derecha proporcionan una vista ampliada de los recuadros resaltados en cada sección. (B) Máscaras de segmentación predichas generadas por U-Net, Attention U-Net y sus versiones aumentadas. La fila superior resalta los verdaderos positivos (estructuras segmentadas correctamente), la inferior muestra los falsos positivos (estructuras identificadas incorrectamente) y los falsos negativos (estructuras perdidas) para cada modelo. (C) Métricas de evaluación cuantitativa para cada modelo, incluida la precisión, la puntuación F1, la precisión, el recuerdo, la similitud de volumen y el coeficiente de dados. La evaluación se realizó en los parches extruidos de la imagen 3D. Las barras de error denotan desviaciones estándar en las imágenes de prueba. Barra de escala: 60 μm; Barra de escala insertada: 30 μm. Abreviatura: BC = canalículos biliares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Evaluación de los modelos U-Net y Attention U-Net para la segmentación de la red sinusoidal a partir de imágenes de microscopía de fluorescencia 3D del tejido hepático de ratón. (A) Secciones 2D representativas (sección central) de imágenes de microscopía de fluorescencia 3D, que muestran la imagen original y la máscara de verdad fundamental correspondiente para sinusoides en tejido hepático de ratón. Las imágenes de la parte superior derecha proporcionan una vista ampliada de los recuadros resaltados en cada sección. (B) Máscaras de segmentación predichas generadas por U-Net, Attention U-Net y sus versiones aumentadas. La fila superior resalta los verdaderos positivos (estructuras segmentadas correctamente), la inferior muestra los falsos positivos (estructuras identificadas incorrectamente) y los falsos negativos (estructuras perdidas) para cada modelo. (C) Métricas de evaluación cuantitativa para cada modelo, incluida la precisión, la puntuación F1, la precisión, el recuerdo, la similitud de volumen y el coeficiente de dados. La evaluación se realizó en los parches extruidos de la imagen 3D. Las barras de error denotan desviaciones estándar en las imágenes de prueba. Barra de escala: 60 μm; Barra de escala insertada: 30 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Evaluación de los modelos U-Net y Attention U-Net para la segmentación de la red sinusoidal a partir de imágenes de microscopía de fluorescencia 3D de tejido hepático de ratón, considerando la máscara como tubos llenos. (A) Secciones medias 2D representativas de imágenes de microscopía de fluorescencia 3D, que muestran la imagen original y la máscara de verdad fundamental correspondiente para sinusoides en tejido hepático de ratón. Las imágenes de la parte superior derecha proporcionan una vista ampliada de los recuadros resaltados en cada sección. (B) Máscaras de segmentación predichas generadas por U-Net, Attention U-Net y sus versiones aumentadas. Mientras que la fila superior resalta los verdaderos positivos (estructuras correctamente segmentadas), la inferior muestra los falsos positivos (estructuras identificadas incorrectamente) y los falsos negativos (estructuras perdidas) para cada modelo. (C) Métricas de evaluación cuantitativa para cada modelo, incluida la precisión, la puntuación F1, la precisión, el recuerdo, la similitud de volumen y el coeficiente de dados. La evaluación se realizó en los parches extruidos de la imagen 3D. Las barras de error denotan desviaciones estándar en las imágenes de prueba. Barra de escala: 60 μm; Barra de escala insertada: 30 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Evaluación de los modelos U-Net y Attention U-Net para la segmentación de la red vascular en el cerebro del ratón a partir de imágenes de microscopía de hoja de luz 3D utilizando máscaras de tubo lleno. (A) Secciones medias 2D representativas extraídas de imágenes de microscopía de hoja de luz 3D del cerebro del ratón, que muestran la imagen original y la máscara de verdad fundamental correspondiente para los vasos sanguíneos. Las vistas ampliadas de los recuadros seleccionados se muestran en la esquina superior derecha de cada panel. Máscaras de segmentación previstas generadas por U-Net, Attention U-Net y sus versiones aumentadas. La fila superior resalta los verdaderos positivos (estructuras de vasos correctamente segmentadas), mientras que la fila inferior ilustra los falsos positivos (regiones segmentadas incorrectamente) y los falsos negativos (estructuras de vasos perdidos) para cada modelo. (C) Evaluación cuantitativa del rendimiento del modelo utilizando métricas que incluyen precisión, puntuación F1, precisión, recuperación, similitud de volumen y coeficiente de dados. Las evaluaciones se realizaron en parches 3D extraídos de los volúmenes de prueba. Las barras de error representan desviaciones estándar en las 19 imágenes de prueba. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Video 1: Animación Z-Stack de máscaras predichas para la red BC. El video muestra una secuencia animada a través de la pila z de máscaras de segmentación predichas para canalículos biliares en tejido hepático de ratón, generadas por U-Net, Attention U-Net y sus versiones aumentadas. Cada sección 2D resalta los verdaderos positivos (blanco), los falsos positivos (verde) y los falsos negativos (magenta) para cada modelo, moviéndose por toda la pila. Abreviatura: BC = canalículos biliares. Haga clic aquí para descargar este video.

Video 2: Animación Z-Stack de máscaras predichas para la red sinusoidal. El video muestra una secuencia animada a través de la pila z de máscaras de segmentación predichas para sinusoides en tejido hepático de ratón, generadas por U-Net, Attention U-Net y sus versiones aumentadas. Cada sección 2D resalta los verdaderos positivos (blanco), los falsos positivos (verde) y los falsos negativos (magenta) para cada modelo, moviéndose por toda la pila. Haga clic aquí para descargar este video.

Video 3: Animación Z-Stack de máscaras predichas para la red sinusoidal como tubos llenos. El video muestra una secuencia animada a través de la pila z de máscaras de segmentación predichas para la red sinusoidal como tubos llenos en tejido hepático de ratón, generados por U-Net, Attention U-Net y sus versiones aumentadas. Cada sección 2D resalta los verdaderos positivos (blanco), los falsos positivos (verde) y los falsos negativos (magenta) para cada modelo, moviéndose por toda la pila. Haga clic aquí para descargar este video.

Video 4: Animación Z-Stack de máscaras predichas para los vasos cerebrales. El video muestra una secuencia animada a través de la pila z de máscaras de segmentación predichas para los buques, generadas por U-Net, Attention U-Net y sus versiones aumentadas. Cada sección 2D resalta los verdaderos positivos (blanco), los falsos positivos (verde) y los falsos negativos (magenta) para cada modelo, moviéndose por toda la pila. Haga clic aquí para descargar este video.

Tabla 1: Tiempo de entrenamiento para modelos U-Net 3D y atención U-Net 3D en conjuntos de datos de bilis canalículos y sinusoides con y sin aumento de datos. Tiempo de entrenamiento para modelos U-Net 3D y Attention U-Net 3D en conjuntos de datos de canalículos biliares y sinusoides con y sin aumento de datos. La tabla enumera el número de parches para cada conjunto de datos y el tiempo de entrenamiento correspondiente en minutos. El aumento de datos aumenta el número de parches de 1353 a 10824, lo que lleva a un aumento significativo en el tiempo de entrenamiento. El modelo Attention U-Net requiere constantemente más tiempo de entrenamiento que el modelo U-Net, especialmente con conjuntos de datos aumentados, debido a su complejidad adicional al centrarse en las características relevantes dentro de los datos. Abreviatura: BC = canalículos biliares. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Evaluación cuantitativa de los modelos U-Net 3D y Attention U-Net 3D en cuatro conjuntos de datos utilizando la segmentación de imágenes completas. Esta tabla informa el rendimiento de cada modelo, así como de los métodos clásicos como Otsu y el umbral adaptativo, en cuatro conjuntos de datos diferentes: canalículos biliares, redes sinusoidales (representaciones huecas y rellenas) y vasculatura de todo el cerebro, utilizando imágenes 3D completas para la evaluación. Para cada combinación de modelo y conjunto de datos, se muestra el número de imágenes de prueba, junto con las métricas de rendimiento: Exactitud, Precisión, Recuperación (sensibilidad), Especificidad, Puntuación F1, Coeficiente de dados, IoU y Similitud de volumen. Estas métricas proporcionan una evaluación integral de la calidad de la segmentación en términos de corrección de vóxeles y acuerdo volumétrico entre las predicciones y la verdad del terreno. Abreviaturas: BC = canalículos biliares; IoU = Intersección sobre Unión. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3: Evaluación cuantitativa de los modelos U-Net 3D y Attention U-Net 3D en cuatro conjuntos de datos utilizando parches de 64 x 64 x 64. Esta tabla resume el rendimiento de los modelos U-Net 3D y Attention U-Net 3D en cuatro conjuntos de datos: canalículos biliares, redes sinusoidales (máscaras huecas y rellenas) y vasculatura de todo el cerebro, según la evaluación en parches de imágenes 3D de tamaño 64×64×64 vóxeles. Para cada combinación de modelo y conjunto de datos, el número de parches de prueba se enumera junto con las métricas clave de rendimiento: Exactitud, Precisión, Recuperación (sensibilidad), Especificidad, Puntuación F1, Coeficiente de dados, Intersección sobre unión y Similitud de volumen. Estas métricas a nivel de parche ofrecen información localizada sobre el rendimiento del modelo y son especialmente útiles para identificar la precisión de la segmentación espacialmente heterogénea en todos los volúmenes. Abreviaturas: BC = canalículos biliares; IoU = Intersección sobre Unión. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Figura complementaria S1: Rendimiento de segmentación a nivel de parche de los modelos 3D U-Net y Attention U-Net para la segmentación de canalículos biliares. Los gráficos ilustran el rendimiento cuantitativo de los modelos 3D U-Net y Attention U-Net en conjuntos de datos de canalículos biliares, evaluados utilizando parches de imágenes 3D de tamaño 64 x 64 x 64 vóxeles. Las métricas que se muestran incluyen exactitud, precisión, recuperación (sensibilidad), especificidad, puntuación F1, coeficiente de dados, intersección sobre unión y similitud de volumen. Los resultados reflejan la variabilidad entre los parches, ofreciendo información localizada sobre el rendimiento del modelo y destacando la heterogeneidad espacial dentro de los volúmenes de tejido hepático 3D. Abreviaturas: BC = canalículos biliares; IoU = Intersección sobre Unión. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria S2: Rendimiento de segmentación a nivel de parche de los modelos 3D U-Net y Attention U-Net para la segmentación sinusoide. Los gráficos ilustran el rendimiento cuantitativo de los modelos 3D U-Net y Attention U-Net en conjuntos de datos sinusoides, evaluados utilizando parches de imágenes 3D de tamaño 64 x 64 x 64 vóxeles. Las métricas que se muestran incluyen exactitud, precisión, recuperación (sensibilidad), especificidad, puntuación F1, coeficiente de dados, intersección sobre unión y similitud de volumen. Los resultados reflejan la variabilidad entre los parches, ofreciendo información localizada sobre el rendimiento del modelo y destacando la heterogeneidad espacial dentro de los volúmenes de tejido hepático 3D. Abreviatura: IoU = Intersección sobre Unión. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria S3: Rendimiento de segmentación a nivel de parche de los modelos 3D U-Net y Attention U-Net para sinusoides como segmentación de tubos llenos. Los gráficos ilustran el rendimiento cuantitativo de los modelos 3D U-Net y Attention U-Net en sinusoides como conjuntos de datos de tubos llenos, evaluados utilizando parches de imágenes 3D de tamaño 64 x 64 x 64 vóxeles. Las métricas que se muestran incluyen exactitud, precisión, recuperación (sensibilidad), especificidad, puntuación F1, coeficiente de dados, intersección sobre unión y similitud de volumen. Los resultados reflejan la variabilidad entre los parches, ofreciendo información localizada sobre el rendimiento del modelo y destacando la heterogeneidad espacial dentro de los volúmenes de tejido hepático 3D. Abreviatura: IoU = Intersección sobre Unión. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria S4: Rendimiento de segmentación a nivel de parche de los modelos 3D U-Net y Attention U-Net para la vasculatura cerebral a partir de imágenes de microscopía de hoja de luz. Los gráficos ilustran el rendimiento cuantitativo de los modelos 3D U-Net y Attention U-Net en conjuntos de datos de vasculatura de todo el cerebro, evaluados utilizando parches de imágenes 3D de tamaño 64 x 64 x 64 vóxeles. Las métricas que se muestran incluyen exactitud, precisión, recuperación (sensibilidad), especificidad, puntuación F1, coeficiente de dados, intersección sobre unión y similitud de volumen. Los resultados reflejan la variabilidad entre los parches, ofreciendo información localizada sobre el rendimiento del modelo y destacando la heterogeneidad espacial dentro de los volúmenes de tejido hepático 3D. Abreviatura: IoU = Intersección sobre Unión. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria S5: Superposición de resultados de segmentación en imágenes originales de microscopía de fluorescencia 3D de canalículos biliares. Se muestran cortes de imágenes representativas de conjuntos de datos de microscopía de fluorescencia 3D de canalículos biliares en hígado de ratón con máscaras de segmentación superpuestas en rojo. Las máscaras predichas de los modelos 3D U-Net y Attention U-Net se superponen a las imágenes originales de microscopía en escala de grises para evaluar visualmente la precisión de la segmentación. Se presentan diez imágenes de ejemplo para ilustrar la capacidad de los modelos para capturar diversas características morfológicas y manejar la variabilidad de la señal en diferentes regiones de tejido. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

Este protocolo ofrece un enfoque simple pero potente y accesible para la segmentación basada en el aprendizaje profundo de estructuras tubulares en imágenes de microscopía de fluorescencia 3D, cerrando la brecha entre la complejidad técnica y la facilidad de uso en el análisis de bioimágenes. Al integrar el aumento de datos basado en simulación, cuadernos interactivos de Jupyter y arquitecturas U-Net eficientes, proporcionamos una herramienta de código abierto capaz de realizar una segmentación de alta precisión en estructuras tisulares complejas, como los canalículos biliares y las redes sinusoidales. Esta toolbox aborda los desafíos clave en las tareas de segmentación 3D, especialmente en el manejo de la escasez y variabilidad de datos en las condiciones de imagen, lo que la convierte en una adición versátil al panorama del análisis de bioimágenes.

Un componente crucial de nuestro protocolo es el aumento de datos basado en simulación, que mejora el rendimiento del modelo incluso con un número limitado de imágenes anotadas, una limitación común en los estudios biológicos. Al generar datos aumentados que imitan artefactos de imágenes realistas, como la convolución de la función de dispersión de puntos, el decaimiento de la intensidad axial y el ruido de Poisson y Gaussiano, la toolbox produce modelos que son robustos en una variedad de condiciones de imagen. Este enfoque aumenta efectivamente la diversidad de datos, mejorando la generalización de los modelos y proporcionando una ventaja clave sobre las técnicas tradicionales de aumento de datos, que pueden no capturar completamente la heterogeneidad presente en los especímenes biológicos. Sin embargo, esto está limitado por las características morfológicas intrínsecamente codificadas en la máscara proporcionada inicialmente. La dependencia de máscaras presegmentadas para la generación de datos de entrenamiento inicial introduce posibles sesgos si las máscaras no son completamente representativas de las estructuras biológicas en cuestión. Por lo tanto, todavía hay una pregunta abierta sobre cómo generar un aumento realista de los datos en el espacio morfológico, lo que puede ser potencialmente importante para estudiar tejidos con alteraciones como la progresión de la enfermedad.

Nuestro método utiliza dos modelos de codificador-decodificador, 3D U-Net y Attention U-Net, seleccionados por su alto rendimiento en tareas de imagen biomédica. Mientras que el 3D U-Net proporciona una arquitectura de segmentación sencilla pero potente, el Attention U-Net mejora la precisión al centrarse selectivamente en las características relevantes y suprimir el ruido. Ambos modelos se incluyen en la caja de herramientas, lo que permite a los usuarios elegir en función de sus requisitos específicos de conjuntos de datos. Nuestros resultados muestran que el modelo Attention U-Net logra métricas de rendimiento más altas en todos los conjuntos de datos, particularmente para estructuras desafiantes como la red sinusoidal, donde la complejidad adicional de los mecanismos de atención ayuda a mitigar los efectos de las bajas relaciones señal-ruido y la variabilidad estructural. Sin embargo, es importante tener en cuenta que las demandas computacionales de Attention U-Net son mayores, lo que puede afectar su accesibilidad para usuarios con recursos limitados de GPU. Además, dada la naturaleza de código abierto de la tubería, se pueden agregar fácilmente otras arquitecturas más complejas para estudios futuros si es necesario.

Nuestro protocolo ofrece una canalización todo en uno y fácil de usar que integra pasos esenciales para la segmentación 3D en una sola configuración. Este diseño optimizado es una ventaja clave, ya que simplifica el acceso a herramientas de segmentación avanzadas sin exigir experiencia en programación o ajustes de parámetros. Además, nuestra estrategia de aumento de datos basada en simulación mejora la solidez del modelo, reduciendo la dependencia de extensas anotaciones manuales y mejorando la generalización del modelo en diversas condiciones de imágenes. A diferencia de los métodos de segmentación clásicos, que a menudo se basan en algoritmos de umbral o crecimiento de regiones que requieren un ajuste cuidadoso^28,29 nuestro enfoque de aprendizaje profundo requiere una intervención manual mínima. Esto contribuye a democratizar la segmentación reproducible y de alta calidad de estructuras 3D complejas, haciéndola accesible a una gama más amplia de investigadores, incluidos aquellos sin amplia experiencia computacional.

Más allá de las redes tubulares, la flexibilidad del protocolo permite una fácil adaptación para segmentar otras estructuras biológicas. Las mejoras futuras podrían incluir la integración del aprendizaje autosupervisado³⁰ o el aprendizaje de transferencia³¹, lo que reduce aún más la necesidad de datos anotados al tiempo que mantiene una alta precisión de segmentación. Estas estrategias también podrían ampliar la aplicabilidad a diversas modalidades de imágenes, como la microscopía multifotónica o de hoja de luz.

A pesar de sus fortalezas, el protocolo tiene varias limitaciones que deben reconocerse. En primer lugar, el tamaño del conjunto de datos sigue siendo relativamente pequeño, comprendiendo solo unos pocos volúmenes anotados por estructura. Si bien el aumento de datos mitiga parcialmente este problema, el riesgo de sobreajuste aún está presente, particularmente cuando se aplican modelos ajustados a conjuntos de datos con variaciones no vistas en la preparación de muestras o las condiciones de imagen. En segundo lugar, aunque nuestros resultados indican una buena generalización en diferentes parches y animales, aún no hemos probado la caja de herramientas en conjuntos de datos de otros órganos o modalidades de microscopía, que pueden exhibir características estructurales y de ruido distintas. Esto limita la generalización inmediata de nuestro enfoque. Finalmente, nuestra estrategia de evaluación, aunque robusta a nivel de parche, podría beneficiarse de métricas adicionales para la consistencia topológica, que son relevantes para estructuras similares a las de la red. El trabajo futuro abordará estas limitaciones ampliando el conjunto de datos, incorporando técnicas de adaptación de dominio³² y evaluando la cartera en contextos biológicos más amplios.

En resumen, este protocolo representa una solución accesible y completa para la segmentación 3D de alta calidad de estructuras tubulares en bioimagen. Al combinar arquitecturas de modelos efectivas, estrategias de aumento de datos y una interfaz interactiva y fácil de usar, nuestra caja de herramientas tiene el potencial de expandir el alcance y el impacto del aprendizaje profundo en el análisis de bioimágenes, lo que permite a los investigadores de todo el mundo aprovechar estas técnicas en busca de una comprensión más profunda de la estructura y función biológicas.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fiji			https://imagej.net/software/fiji/downloads
Repositorio de GitHub			https://github.com/hernanmorales-navarrete/3DMicroscopyImage Segmentación/árbol/principal
Labkit			https://imagej.net/plugins/labkit/
Repositorio Zenodo			10.5281/zenodo.14029574