Artículo de método

Un protocolo de citometría de electroporación para microscopía de fluorescencia de células vivas utilizando el cultivo celular U2 OS

DOI:

10.3791/68005

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13 de junio de 2025

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1Department of Chemistry and Biology, Toronto Metropolitan University, 2Institute for Biomedical Engineering, Science and Technology (iBEST), a partnership between St. Michael's Hospital, a site of Unity Health Toronto, and Toronto Metropolitan University, 3Keenan Research Centre for Biomedical Science at St. Michael's Hospital

En este artículo

Resumen

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La electroporación es el uso de campos eléctricos pulsados (PEF) para crear poros transitorios en cultivos celulares para introducir carga molecular. Esta técnica se ha utilizado recientemente en entornos clínicos y de investigación. Aquí, describimos las técnicas de electroporación utilizando el recientemente desarrollado "Sistema de citometría de electroporación" para realizar microscopía de fluorescencia de células vivas.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los campos eléctricos pulsados (PEF) tienen una amplia gama de aplicaciones en la investigación médica y las aplicaciones clínicas. Un área clave de investigación se centra en la electroporación (reversible o irreversible). La electroporación reversible se ha utilizado durante varias décadas para transferir moléculas a través de las membranas celulares, como el ADN plasmídico, generalmente conocido como electrotransferencia de genes (GET). Por el contrario, la electroporación irreversible se ha convertido en una técnica popular en el tratamiento del cáncer, ya que proporciona una alternativa no tóxica al romper permanentemente las células con PEF. Esto se puede combinar con varios tipos de medicamentos o reactivos para mejorar el efecto, lo que se conoce como electroquimioterapia (TEC). Sin embargo, a pesar del amplio éxito en las aplicaciones prácticas, se requiere más tecnología de apoyo e investigación para mejorar las técnicas actuales. Para abordar esto, se desarrolló un sistema de citometría de electroporación para respaldar la experimentación con PEF de células vivas con la capacidad de realizar microscopía de fluorescencia a largo plazo. Esto se combinó con una línea celular FUCCI(CA)5 U2-OS de expresión estable para evaluar los cambios en el ciclo celular en respuesta a la exposición al PEF. De este modo, se logró una microscopía timelapse de hasta 30 horas, que proporciona cambios en tiempo real en la actividad celular según el informe FUCCI(CA)5. Como resultado, los cambios específicos de fase fueron cuantificables para el análisis posterior.

Introducción

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Los campos eléctricos pulsados (PEF) se han convertido en una herramienta común para una variedad de aplicaciones en biologíay aplicaciones clínicas. A grandes rasgos, se pueden clasificar por electroporación (EP) y electroestimulación (ES). La electroporación tiene dos subcampos conocidos como electroporación reversible e irreversible. La electroporación reversible (ER) se ha utilizado durante décadas como una herramienta eficaz para transferir carga molecular, como el ADN plasmídico, a células de varios tipos, como mamíferos, bacteriasy levaduras. Más recientemente, la electroporación irreversible (IRE) ha crecido en prominencia como una alternativa no tóxica a los tratamientos actuales contra el cáncer3. Un subcampo emergente se conoce como Ablación de Campo Pulsado (PFA), que se centra en la eliminación no térmica de tejidos, en particular para el tratamiento de ciertas disfunciones cardíacas4. En combinación con fármacos y otros reactivos, esto ha llevado al desarrollo de la electroquimioterapia (TEC). Sin embargo, la comprensión actual de los tratamientos con PEF está siendo superada por las aplicaciones clínicas5. Aquí presentamos un sistema de citometría de electroporación para investigar electroquimioterapias. El ciclo celular representa un indicador clave de la viabilidad celular, y los cambios pueden identificar efectos específicos de fase. Mediante el desarrollo de estas herramientas, los protocolos se pueden adaptar más rápido, proporcionando tratamientos más eficaces para una gama más amplia de cánceres.

Nuestro sistema de electrocitometría personalizado (Figura 1) consta de una cámara con electrodos de placa paralela de aluminio y un fondo de cubreobjetos, así como un generador de pulsos de decaimiento exponencial simple. La cámara está construida a partir de una cámara impresa en 3D y un fondo de cubierta de vidrio # 1.5 está fijado por un adhesivo sensible a la presión de grado médico. Los electrodos se forman a partir de una película adhesiva de aluminio colocada sobre soportes integrados en la cámara, proporcionando dos electrodos paralelos a 0,4 cm de distancia. Esta es una configuración común para los electrodos comerciales y proporciona un diseño robusto que podría adaptarse rápidamente a los protocolos actuales. La cámara puede caber dentro de recintos ambientales diseñados para portaobjetos de 25 mm x 55 mm, que también es un formato de portaobjetos común compatible con los proveedores comerciales de microscopios. El generador de pulsos proporciona pulsos de decaimiento exponencial de hasta 330 V, lo que permite lograr una amplia gama de experimentos, incluida la electroporación reversible e irreversible.

Para estudiar los efectos de los PEFs en el ciclo celular, utilizamos una línea celular de osteosarcoma humano transgénico (U2 OS) que expresa el Indicador de Ciclo Celular de Ubiquitinación Fluorescente (CA)5 (FUCCI(CA)5), una construcción fluorescente reportera del ciclo celular vivo. El sistema introduce dos formas fluorescentes y truncadas de Geminin y Cdt1, que se producen y reciclan a tasas específicas durante el ciclo celular. Además, la apoptosis se puede monitorizar directamente durante el experimento utilizando una línea de células U2-OS FUCCI(CA)5 que exprese de forma estable. Durante el ciclo celular, el reportero opera de manera predecible con cada fase porque estas se producen y degradan a las mismas tasas que las versiones funcionales expresadas naturalmente en la célula. Cuando se produce la apoptosis, este ciclo se interrumpe y el ciclo celular se apaga rápidamente. Por lo general, esto se manifestará visualmente como el envejecimiento de la fluorescencia dentro del ciclo celular, seguido de cambios morfológicos dramáticos en el núcleo, que es claramente visible debido a la localización de los reporteros en el núcleo6. Esto permite la identificación visual de cada fase en células individuales a lo largo del tiempo (Figura 2). La electroporación reversible causa cambios en las condiciones intracelulares y se seleccionó un pulso de decaimiento exponencial de 180 V para la investigación. Este pulso se seleccionó para limitar la muerte celular tanto como fuera posible, al tiempo que aseguraba la electroporación en la mayoría de la población. Esto se determinó sobre la base de investigaciones previas que investigaron los parámetros óptimos de pulso de electroporación para seis líneas celulares de mamíferos. La densidad de energía de un pulso de 180 V fue ligeramente inferior a los parámetros óptimos de transfección, lo que proporciona una mejor viabilidad celular con alta poración7. El efecto del pulso se estudió en células no sincronizadas y células sincronizadas en fase S utilizando un doble bloque de timidina con y sin aplicación de PEF (Figura 3). Los resultados indicaron una disminución en la longitud promedio para S y G2 en comparación con el control. Esto indicó que la fase S era sensible a la exposición al PEF, lo que resultaba en un ciclo celular más rápido. Esto demostró que el sistema de citometría por electroporación era capaz de combinar la administración de PEF con imágenes de células vivas a largo plazo para estudiar el ciclo celular. Si bien utilizamos esta plataforma para observar la progresión celular a lo largo del ciclo celular en respuesta a los PEF, esta es una herramienta útil para estudiar una variedad de aplicaciones y condiciones para los PEF y el cultivo celular.

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Protocolo

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1. Preparación de cultivos celulares

  1. Prepare la línea estable mediante electroporación reversible con los siguientes parámetros: 100 μL de células U2 OS resuspendidas (6 × 106 células/mL) con 5 μg de ADN plasmídico en una cubeta de 0,4 cm, y un pulso de onda cuadrada de 180 V durante 10 ms.
  2. Imprima el diseño personalizado de la cámara utilizando cualquier impresora 3D adecuada y plástico biocompatible como el ácido poliláctico (PLA) (consulte el archivo complementario 1). Desinfecte la cámara completa con etanol (70%) y guárdela en un recipiente estéril antes de usarla.
  3. Cultivo de células U2-OS FUCCI(CA)5 en una placa de 10 cm con 10 mL de Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)-High Glucose que contiene 10% de suero fetal bovino y 1% de PenStrep e incubar a 37 °C y 5% de CO2.
  4. Cuando el cultivo alcance el 80% de confluencia, aspire el medio, lave el cultivo celular con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y disocie las células con 1 mL de tripsina al 0,25% durante 1,5 min.
  5. Neutralizar la tripsina resuspendiendo el cultivo celular en 5 mL de DMEM-Glucosa Alta (que contiene 10% de FBS y 1% de PenStrep).
  6. A partir del cultivo celular resuspendido, obtenga una muestra de 100 μL y colóquela en la cámara del sistema de citometría de electroporación en el cubreobjetos de vidrio inferior. Asegúrese de que la cámara tenga un 30% de confluente después de introducir la muestra. Si la muestra parece ser demasiado confluente antes de la incubación, aspire la muestra y reduzca el volumen de la muestra.
  7. Lentamente, agregue 4 ml de DMEM-glucosa alta (que contiene 10% de FBS y 1% de PenStrep) en el extremo más alejado de la cámara, evitando que el líquido salga de la muestra.
  8. Coloque un portaobjetos de microscopio estándar en la parte superior de la cámara e incube la cámara a 37 °C y 5% de CO2 durante 24 h, asegurándose de que el cultivo se haya adherido completamente al fondo de la cámara. Opcionalmente, utilice Hoechst 33342 (1 μg/mL) para teñir núcleos celulares y facilitar la cuantificación celular posterior, así como la apoptosis. Realice la tinción 30 minutos antes de la microscopía de lapso de tiempo.

2. Preparación del microscopio

  1. Primero, encienda un microscopio fluorescente invertido con controles ambientales y cámara, lo que permite que las condiciones se estabilicen antes de realizar la electroporación.
    NOTA: Cualquier microscopio de fluorescencia invertida con un sistema ambiental que pueda aceptar el portaobjetos de cámara de 25 mm x 55 mm x 16 mm. El diseño fue diseñado originalmente para trabajar en el microscopio invertido de referencia (ver Tabla de Materiales) y el sistema ambiental correspondiente.
    El calentamiento de la platina puede causar una deriva en la imagen debido a la expansión del metal.
  2. Mientras el sistema ambiental alcanza la temperatura óptima, conecte un multímetro digital al condensador del generador de impulsos y al interruptor de alto voltaje mediante cables eléctricos adecuados. Para seguir este protocolo, utilice cables de clip "cocodrilo" para permitir un montaje y desmontaje rápidos con la cámara de electroporación.
  3. A continuación, seleccione un aumento de 20x y, utilizando el software del microscopio, asegúrese de que se seleccionan los canales FITC (GFP) y A594 (TexRed/mCherry) (opcionalmente, el canal DAPI para Hoechst 33342) correspondientes a las dos proteínas fluorescentes del sistema FUCCI(CA)5. Utilice ajustes de exposición bajos (normalmente <0,05 s) para evitar daños en las fotos durante lapsos de tiempo prolongados.
  4. Optimice el enfoque y la calidad de la imagen tomando imágenes de prueba antes de comenzar el lapso de tiempo.
    NOTA: La fluorescencia debe ser tan brillante como sea necesario para la visualización del color.
  5. Programe el time-lapse para capturar de 3 a 6 puntos de vista cada 10 min durante 24 h para obtener un gran volumen de datos del ciclo celular por time-lapse y mitigar el daño fotográfico.
    NOTA: El período de tiempo puede variar dependiendo de la escala de tiempo de la actividad celular.
  6. Asegúrese de que el enfoque automático esté habilitado para el canal A594 para obtener los mejores resultados en el seguimiento del cultivo celular durante el lapso de tiempo.
  7. Deje el software en modo de espera hasta que se realice la electroporación. Una vez que se entrega el pulso, active inmediatamente el lapso de tiempo para garantizar la mayor precisión posible de los datos.

3. Electroporación

  1. Coloque la cámara de citometría de electroporación en el microscopio con una cámara ambiental adecuada. Antes de la electroporación, deje la cámara cerrada con el sistema ambiental en funcionamiento para asegurarse de que el ciclo celular no se vea afectado.
  2. Conecte un multímetro digital al generador de impulsos y conecte el generador de impulsos a los electrodos de la cámara mediante cables de pinza de cocodrilo abriendo la cámara ambiental.
  3. Cargue el condensador en el generador de pulsos a 180 V y descargue rápidamente el pulso en la cámara hasta que el multímetro digital marque 0 voltios.
  4. Retire las conexiones eléctricas a la cámara y vuelva a colocar la tapa lo más rápido posible para garantizar las condiciones de cultivo adecuadas.
  5. Active inmediatamente el lapso de tiempo una vez que el sistema ambiental del microscopio esté en su lugar.

4. Adquisición de datos en time-lapse

  1. Una vez completado el time-lapse, utilice el software del microscopio para guardar el time-lapse como un único vídeo basado en las imágenes capturadas a lo largo del time-lapse. Mejore la calidad visual en esta etapa para ayudar con la cuantificación manual.
    NOTA: Se puede seleccionar cualquier velocidad de fotogramas; Sin embargo, 6 fotogramas/s proporciona una velocidad de reproducción moderada con 1 segundo de vídeo, lo que da como resultado 1 h de tiempo real.
  2. Una vez que el video de lapso de tiempo esté preparado, realice un seguimiento de las fases de la celda a lo largo del tiempo observando los cambios en las señales FITC y A594

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Resultados

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Utilizando el sistema FUCCI (Figura 2), se obtuvieron datos visuales del ciclo celular midiendo el tiempo durante el cual cada color fue expresado por la célula como resultado de la expresión de proteínas y la no biquitinación. Sobre la base de los resultados de los experimentos sincronizados y no sincronizados (Figura 3), se evidenció que la exposición al PEF en fase S reguló al alza el ciclo celular. Esto se evidenció por la disminución en la longitud promedio...

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Discusión

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Cuando se realiza correctamente, los datos de fase del ciclo celular se pueden cuantificar para grandes volúmenes de células individuales durante períodos de hasta 24 h. Este protocolo produjo datos del ciclo celular comparables a métodos alternativos como los FAC. Este es un método comúnmente utilizado por el cual las células se marcan fluorescentemente a medida que avanzan a través del ciclo celular. Después de incubar durante al menos 24 h, se clasifican por intensidad fluorescente, c...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

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Nos gustaría agradecer tanto al Laboratorio Gupta como a los miembros del Grupo Rackus por su continuo apoyo dentro y fuera del laboratorio. Fondos de subvenciones generosamente proporcionados a través de la asociación con Mitacs.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Corredera de cámara (impresa en 3D/ensamblada) N/AN/A
Placa de cultivo (10 cm)Sarstedt83.3902
Delta VisionOlympusN/ATambién se pueden utilizar modelos de microscopios alternativos. Asegúrese de que el escenario y el sistema ambiental puedan acomodar la corredera de la cámara de electroporación (55 mm x  
DMEM – Gibco de alta glucosa11965092
suero fetal bovino ThermoFisherA5256701 
i3 MK3S Impresora 3DPrusaN/ASe pueden utilizar modelos de impresoras alternativos que pueden usar archivos STL.
Pen StrepThermoFisher15070063
Fosfato Tamponado Solución SalinaGibco10010031
tFUCCI(CA)5Addgene153521
TripsinaSigma-Aldrich9002-07-07
U2-OS Línea CelularATCCHTB-96

Referencias

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  1. Shi, J., et al. A review on electroporation-based intracellular delivery. Molecules. 23 (11), 3044(2018).
  2. Kandušer, M., Miklavčič, D. Electroporation in biological cell and tissue: An overview. Electrotechnologies for extraction from food plants and biomaterials. Food Engineering Series. , Springer. New York. (2009).
  3. Cemazar, M., Sersa, G. Recent advances in electrochemotherapy. Bioelectricity. 1 (4), 204-213 (2019).
  4. Iyengar, S. K., Iyengar, S., Srivathsan, K. The promise of pulsed field ablation and the challenges ahead. Front Cardiovasc Med. 10, 1235317(2023).
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