Regulación quimiogenética en células precursoras derivadas de células madre reprogramadas en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas

Summary

Aquí, describimos un protocolo para diseñar células madre químicamente reprogramadas para lograr una modulación neuronal precisa mediante la diferenciación de estas células en células precursoras dopaminérgicas, trasplantándolas a modelos de ratón de la enfermedad de Parkinson y evaluando los resultados conductuales y electrofisiológicos para confirmar la integración exitosa y la efectividad funcional de las células trasplantadas.

Abstract

La integración de receptores de diseño activados exclusivamente por fármacos de diseño (DREADD) con terapias basadas en células madre presenta una estrategia avanzada para la modulación neuronal precisa. Aquí, utilizamos células madre humanas reprogramadas diseñadas con CRISPR que expresan receptores DREADD excitatorios (hM3Dq) o inhibidores (hM4Di) para evaluar la integración funcional y la modulación de los precursores dopaminérgicos trasplantados en un modelo murino de enfermedad de Parkinson (EP). Los pasos clave incluyeron la generación de líneas de células madre que expresan DREADD sin fusión, la diferenciación en precursores dopaminérgicos del mesencéfalo y el trasplante de estas células al cuerpo estriado de ratones lesionados por 6-hidroxidopamina (6-OHDA). Realizamos evaluaciones conductuales y registros electrofisiológicos para analizar los efectos de las células trasplantadas. Las pruebas de comportamiento, como la prueba del cilindro, demostraron una modulación significativa de la función motora después de la administración de clozapina-N-óxido (CNO). Específicamente, la activación de hM4Di redujo el movimiento contralateral de las extremidades anteriores, mientras que la activación de hM3Dq se asoció con un mejor comportamiento motor. Los registros electrofisiológicos revelaron distintas respuestas sinápticas. La activación de hM4Di aumentó los intervalos entre eventos y disminuyó las amplitudes máximas de las corrientes postsinápticas excitatorias espontáneas (sEPSC), mientras que la activación de hM3Dq disminuyó los intervalos entre eventos y aumentó las amplitudes máximas, lo que refleja una mayor señalización excitatoria. En resumen, la integración de evaluaciones conductuales y electrofisiológicas valida la incorporación funcional precisa de células madre reprogramadas químicamente en los circuitos neuronales del huésped.

Introduction

Los receptores de diseño activados exclusivamente por fármacos de diseño (DREADD) son receptores acoplados a proteínas G modificados genéticamente que pueden ser^activados selectivamente por ligandos sintéticos que de otro modo serían inertes. El enfoque quimiogenético se ha convertido en una herramienta esencial en neurociencia al permitir a los investigadores investigar la conectividad de los circuitos neuronales con alta precisión y mejorar nuestra comprensión de las funciones celulares tanto in vivo como in vitro a través de la activación selectiva o inhibición de regiones cerebrales especí....

Protocol

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las pautas establecidas por la Asociación de Beijing para la Ciencia de los Animales de Laboratorio y los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) se obtuvieron de un donante sano con el consentimiento informado por escrito, como se describe en un estudio previo¹⁷.

1. Construcción de líneas celulares basadas en células madre DREADD no fusionadas

1. Construye el plásmido donante DREADD.
   NOTA: Lo....

Results

La Figura 1 muestra los pasos clave de este enfoque metodológico para células madre humanas reprogramadas modificadas que expresan receptores DREADD excitatorios (hM3Dq) o inhibidores (hM4Di) para evaluar la integración funcional y la modulación de los precursores dopaminérgicos derivados en un modelo de ratón de la enfermedad de Parkinson (EP). La Figura 2 describe la estrategia de knock-in de genes mediada por CRISPR/Cas9 para introducir construcciones sin fus.......

Discussion

Este protocolo utilizó la tecnología CRISPR para diseñar células madre humanas reprogramadas para expresar receptores excitatorios hM3Dq e inhibidores hM4Di. La modulación de la actividad neuronal por CNO se evaluó mediante trasplante celular en modelos murinos de enfermedad de Parkinson, acompañado de evaluaciones conductuales y registros electrofisiológicos.

El primer paso crítico en la generación de construcciones DREADD expresadas de manera estable y sin f.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 x Rapid Taq Master Mix	Vazyme	P222-01	utilizado para el análisis de genotipado
2&veces; Mezcla de clonación sin fisuras	Biomed Gene Tech.	CL117-01	utilizado para la construcción de plásmidos
6-OHDA	Sigma-Aldrich	H4381	utilizado para establecer ratones con EP modelo
AAVS1-Pur-CAG-EGFP	Addgene	80945	utilizado como control
AAVS1-Pur-CAG-hM4Di-mCherry	Addgene	80947	plásmido original para la construcción de hM4Di-T2A-ZsGreen
AAVS1-Pur-CAG-hM3Dq-mCherry	Addgene	80948	plásmido original para la construcción de hM3Dq-T2A-ZsGreen
AAVS1-CAG-hM4Di-T2A-ZsGreen	N/A	N/A	Plásmido donante construido basado en #80947
AAVS1-CAG-hM3Dq-T2A-ZsGreen	N/A	N/A	Plásmido donante construido basado en #80948
Accutase	Invitrogen	A11105-01	Utilizado para digerir células
AMAXA Nucleofector	Lonza	AAD-1001S
Apomorfina	Sigma-Aldrich	A4393
Líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF)	N/A	N/A	125 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, 1,25 mM de NaH2PO4, 1 mM de MgSO4, 25 mM de glucosa y  26 mM NaHCO3
Ácido ascórbico	Sigma-Aldrich	1043003
B-27 Suplemento	Gibco	17504044
BDNF	Peprotech	450-02
cAMP	Sigma-Aldrich	D0627
CHIR99021	Yeasen	53003ES10
Clozapina-N-óxido Enzo		BML-NS105
DAPT	Sigma-Aldrich	D5942
Desipramina	Sigma-Aldrich	D3900
D-glucosa	Sigma-Aldrich	G5767
DMEM/F12	Gibco	11330-032
DMEM/F12	Gibco	11320-033
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
FGF8	Peprotech	100-25
GDNF	Peprotech	450-10
GlutaMax	Gibco	35050-061
Hank' s Solución salina equilibrada (HBSS)	Gibco	14175095
Factor inhibidor de la leucemia humana (hrLIF)	Millipore	LIF1010
Líquido intracelular helado	N/A	N/A	130 mM de K-gluconato, 16 mM de KCl, 0,2 mM de EGTA, 2 mM de MgCl2, 10 mM de HEPES, 4 mM de Na2-ATP, 0,4 mM de Na3-GTP, 0.3% de neurobiotina
Reemplazo de suero KnockOut	Gibco	10828028
Laminina	Extractor	11243217001
Suplemento N-2
Neurobasal-A Medium	Gibco	10888-022
ácidos (NEAA)	Gibco	11140-050
PBS	Gibco	10010023
paquete de software pCLAMP 11	Molecular Devices	N/A	Software de adquisición y análisis de datos de electrofisiología Patch-clamp
Medio de diferenciación de fase 1	N/A	N/A	96% DMEM/F12 (Gibco, 11320-033), 1% Suplemento de B-27, 1% Suplemento de N-2, 1% NEAA, 1% GlutaMax, 1 µ M SAG1 y 100 ng/mL FGF8
Medio de diferenciación de fase 2	N/A	N/A	96% DMEM/F12 (Gibco, 11320-033), 1% de suplemento de B-27, 1% de suplemento de N-2, 1% de NEAA y 1% de GlutaMax, 10 ng/mL de BDNF, 10 ng/mL de GDNF, 1 ng/mL de TGF-β III, 10 µ M DAPT, 0,2 mM de ácido ascórbico y 0,5 mM de AMPc.
Bromhidrato de poli-D-lisina (PDL)	Cebadores Sigma-Aldrich	P7886
para genotipado	N/A	N/A	Inserción Fuente: TCTTCACTCGCTGGGTTCCCTT; Inserción inversa: CCTGTGGGAGGAAGAAGAGGT; Homocigosidad Foward:CGTCTCCCTGGCTTTAGCCA; Homocigosidad inversa: GATCCTCTCTCTGGCTCCATCG
pX458	Addgene	152199
SAG1	Enzo	ALX-270-426-M01
SB431542	Yeasen	53004ES50
líquido cefalorraquídeo artificial a base de sacarosa (s-ACSF)			234 mM sacarosa, 2,5 mM de KCl, 26 mM de NaHCO3, 1,25 mM de NaH2PO4, 11 mM de Dglucosa, 0,5 mM de CaCl2 y 10 mM de MgSO4
Cultivo de células madre medios	N/A	N/A	48% DMEM/F12 (Gibco, 11330-032) y 48% Neurobasal, con la adición de 1% B27, 1% N2, 1% NEAA, 1% GlutaMax, 10 ng/mL hrLIF, 2 µ M SB431542, y 3 µ M CHIR99021
TGF-β III	Peprotech	100-36E
Tampón de trasplante	N/A	N/A	Hbss con 5 g/L de D-glucosa, 100 ng/ml de BDNF, 100 ng/ml de GDNF y 0,2 mM de vibrátomo de ácido ascórbico
	Leica	VT1000 S
Dispositivos moleculares	de pinza de parche de células completas	MultiClamp700B