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Artículo de método

Generación de organoides intestinales apicales y evaluación de la tasa de proliferación de organoides mediante el marcaje EdU

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DOI:

10.3791/68039

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28 de marzo de 2025

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1Small Animal Internal Medicine, Department for Small Animals and Horses, University of Veterinary Medicine, 2Cluster of Excellence Physics of Life, TU Dresden, 3Unit for Microbiology, Center for Pathobiology, Department for Biological Sciences and Pathobiology, University of Veterinary Medicine

En este artículo

Resumen

Aquí, describimos un protocolo para generar organoides intestinales apicales a partir de cultivos de organoides estándar incrustados en matriz. También describe la posterior incorporación de EdU en células en proliferación activa y la cuantificación semiautomática de células EdU positivas.

Resumen

Aquí, describimos la generación de cultivos flotantes de organoides intestinales apicales a partir de cultivos de organoides intestinales incrustados en hidrogel. Al mismo tiempo, se establecen cultivos flotantes de organoides basales para la comparación directa entre organoides apicales y basales. Los organoides apicales y basales se someten posteriormente al análogo de timidina 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU), que se integra en el ADN recién sintetizado durante la fase S de la división celular. Esta incorporación al ADN se puede visualizar en organoides morfológicamente intactos utilizando microscopía confocal de barrido láser. A continuación, las células marcadas con Hoechst33342 y EdU se cuantifican de forma semiautomática utilizando un software de análisis de imágenes. El cálculo del porcentaje de células EdU positivas del número total de células permite el análisis de la proliferación celular en organoides tridimensionales (3D). A pesar de que se utiliza aquí para el análisis de la proliferación en organoides intestinales, el protocolo es aplicable al análisis de tinciones específicas de núcleos de varios tipos en otros organoides o también en cultivos celulares bidimensionales.

Introducción

Los organoides intestinales son modelos tridimensionales in vitro que recapitulan el epitelio intestinal compuesto por diferentes tipos de células. Estos organoides pueden establecerse fácilmente a partir de células madre adultas aisladas de criptas intestinales1. Dado que los organoides están mucho más cerca del epitelio in vivo, son cada vez más importantes en la investigación biomédica. Los organoides del intestino no solo se utilizan para el análisis de mecanismos fisiológicos (por ejemplo, la señalización del nicho intestinal 2,3 y la diferenciación celular 4,5), sino también para la investigación de enfermedades infecciosas 6,7. Sin embargo, el crecimiento de células polarizadas en 3D que encierran un lumen central es un desafío, ya que la superficie de la célula apical termina siendo inaccesible dentro del lumen del organoide. El examen de las diferencias entre las superficies celulares apicales y basolaterales puede ser importante en los estudios metabólicos, como lo demuestran las diferencias en la absorción de ácidos grasos8 y la investigación de enfermedades infecciosas 9,10,11,12.

La generación de los llamados organoides apicales es una opción fácil para superar este problema. Al eliminar la matriz extracelular de los cultivos de organoides estándar (es decir, organoides basales e incrustados en la matriz) y sembrar estos organoides en un medio libre de matriz, se puede inducir un cambio de polaridad9.

Como hemos publicado anteriormente, la mayoría de los organoides invierten su polaridad en 12 h. Sin embargo, se necesitan 48-72 h para obtener un cultivo con más del 90% de organoides apicales. A pesar de su ventaja de permitir el acceso a la superficie de la célula apical, los organoides apicales muestran una proliferación significativamente disminuida después de la inversión de la polaridad, mientras que las tasas de muerte celular aumentan13. El factor de la actividad proliferativa puede representar una variable de confusión en varios análisis y debe tenerse en cuenta al diseñar un experimento.

Aquí, presentamos un protocolo detallado para establecer cultivos de organoides apicales intestinales y organoides de control basales flotantes para análisis posteriores. Además, describimos el marcaje con 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU), incorporado en el ADN recién sintetizado y, por lo tanto, marca las células en proliferación activa. Describimos además el análisis semiautomático de la tasa de proliferación de los organoides utilizando el software arivis Pro (Zeiss) mediante la cuantificación de células EdU+ . En la Figura 1 se describe un esquema del proceso.

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Protocolo

Se utilizaron organoides intestinales derivados de células madre adultas de perros, establecidos según Kramer et al., 202014 . De acuerdo con las directrices del comité de ética institucional, el uso de material tisular recogido durante la escisión terapéutica o la autopsia se incluye en el "consentimiento del propietario para el tratamiento" de la universidad, que fue firmado por todos los pacientes propietarios.

1. Cultivo de organoides

  1. Cultivo de organoides intestinales derivados de células madre adultas incrustados en la matriz de extracto de membrana basal (BME) de elección en placas de 24 pocillos y división mecánica con pipetas de vidrio como se describe en detalle en Pleguezuelos et al., 202015.
    NOTA: Para el protocolo descrito aquí, se utilizó Geltrex como BME.
  2. Retire con cuidado el medio refinado (Tabla 1) de los organoides incluidos en BME.
  3. Añada 500 μl de tripsina-EDTA al 0,05 % por pocillo y separe todas las cúpulas de la matriz del pocillo pipeteando hacia arriba y hacia abajo repetidamente. Transfiera los organoides a un tubo de 15 mL y vuelva a suspender bien para disociar completamente la matriz de hidrogel.
  4. Incubar organoides con tripsina-EDTA al 0,05 % a 37 °C en un baño de agua hasta que todos los organoides se disocien en células individuales o pequeños grupos de células.
  5. Diluir la suspensión de tripsina/célula con medio basal (Tabla 1). Use al menos el doble de medio basal que tripsina.
  6. Centrifugar las celdas a 8 °C a 420 × g durante 5 min. Retire la mayor cantidad posible de sobrenadante.
  7. Células semilla incrustadas en BME en tantos pocillos como se utilizaron para la tripsinización en el paso 1.3. y suministrarles medio refinado (Tabla 1).
  8. Incubar las células durante 3 días en una incubadora de cultivo celular y continuar con el paso 2.1.

2. Inducción de inversión de polaridad y marcaje de EdU

  1. Retire con cuidado el medio de los organoides incluidos en BME.
  2. Agregue 500 μL de solución de recolección de organoides a cada pocillo y separe todas las cúpulas de la matriz del pocillo pipeteando hacia arriba y hacia abajo repetidamente. Transfiera los organoides a un tubo de 15 mL y vuelva a suspender bien para disociar completamente la matriz de hidrogel.
  3. Incubar el tubo de 15 mL en hielo durante 1,5 h. Agite bien el tubo cada 10 minutos para evitar la aglomeración de los organoides y asegurar una disociación uniforme de los componentes restantes del hidrogel.
  4. Durante la incubación, cubra una placa de 96 pocillos con una solución antiadherente. Para cada pocillo de una placa de 24 pocillos tripsinizada en el paso 1.3., cubra 8 pocillos de una placa de 96 pocillos. Incubar durante al menos 1 h a temperatura ambiente (RT).
  5. Agregue al tubo de 15 mL al menos el doble de PBS que la solución de recolección de organoides utilizada y centrifugue a 8 °C a 150 × g durante 5 min.
  6. Retirar el sobrenadante y resuspender los organoides en 1 mL de PBS.
  7. Transfiera 500 μL de la suspensión de organoide/PBS en un tubo separado de 15 mL y centrifugue ambos tubos nuevamente a 8 °C a 150 × g durante 5 min.
  8. Retire toda la solución antiadherente de la placa de 96 pocillos.
  9. Elimine la mayor cantidad posible de sobrenadante después de la centrifugación.
  10. Utilice uno de los tubos para la generación de organoides basales flotantes (BO) y el otro tubo para organoides apicales (AO).
  11. En el caso de los organoides BO, añadir 100 μL de medio refinado que contenga un 7,5% de BME por pocillo de la placa de 96 pocillos a un tubo. Mezcle bien y disperse los organoides de manera uniforme en el número deseado de pocillos de la placa de 96 pocillos prerrecubierta.
  12. En el caso de los organoides AO, añada 100 μL de medio refinado simple (sin ningún BME añadido) por pocillo de la placa de 96 pocillos al otro tubo. Mezcle bien y disperse los organoides de manera uniforme en el número deseado de pocillos de la placa de 96 pocillos prerrecubierta.
  13. Incubar los organoides a 37 °C y 5% de CO2 durante 3 días.
    NOTA: Las diferencias morfológicas comenzarán a ser visibles después del día 1. Sin embargo, los resultados publicados anteriormente muestran que la gran mayoría de los organoides tardan alrededor de 3 días en presentar la polaridad apical13.
  14. En puntos de tiempo definidos, por ejemplo, 24 h/48 h/72 h después de la inducción de la inversión de polaridad, agregue 50 μL de 3 μM de EdU diluido en medio refinado a todos los pocillos de organoides que se van a marcar, para recibir una concentración final de 1 μM de EdU en cada pocillo.
  15. Incubar a 37 °C y 5% de CO2 durante 1,5 h.
  16. Recoja los organoides marcados con EdU con puntas de diámetro ancho y transfiérelos a un tubo de 15 ml.
  17. Agregue una cantidad igual de 4% de PFA a cada tubo (organoides BO y AO; concentración final de PFA = 2%) y mezcle cuidadosamente.
  18. Incubar en RT durante 15 min.
  19. Agregue al menos el doble de la cantidad de PBS según el volumen en el tubo de 15 ml y centrifugue a 8 °C a 80 × g durante 5 minutos.
  20. Retirar el sobrenadante y resuspender los organoides en 1 mL de PBS.
  21. Centrifugar de nuevo a 8 °C a 80 × g durante 5 min.
  22. Retire el sobrenadante, vuelva a suspender los organoides en 1 mL de PBS y transfiéralos a un tubo de 1,5 mL. Almacene los organoides a 4 °C hasta que se realice la reacción de tinción de EdU (ver sección 3).
  23. Repita los pasos 2.14-2.22 para cada punto de tiempo que se vaya a analizar.

3. Reacción de tinción EdU click-it y tinción Hoechst 33342

  1. Centrifugar los organoides fijos (a partir del paso 2.22.) en un tubo de 1,5 mL a 4 °C a 50 × g durante 5 min.
  2. Retirar el sobrenadante y resuspender los organoides en 1 mL de albúmina sérica bovina (BSA) al 3% diluida en PBS utilizando puntas de diámetro ancho.
  3. Repita los pasos 3.1. y 3.2 (etapas de lavado).
  4. Retirar el sobrenadante y resuspender organoides en 1 mL de Triton X-100 al 0,5% diluido en PBS.
  5. Incubar en RT durante 20 min.
  6. Centrifugar los organoides a RT a 50 × g durante 5 min.
  7. En un tubo nuevo, prepare 1x Aditivo tampón mezclando 45 μL de H2O con 5 μL de 10x Aditivo tampón.
  8. En otro tubo, prepare el cóctel de reacción mezclando los siguientes componentes: 385,8 μL de H2O, 43 μL de 10x Tampón de Reacción, 20 μL de CuSO, 4,1,2 μL de azida Alexa Fluor 647 y 50 μL o 1x Aditivo tampón (del paso 3.7.).
    NOTA: Esta mezcla es suficiente para cinco reacciones y se puede escalar hacia arriba y hacia abajo de acuerdo con el número requerido de reacciones de tinción.
  9. Repita los pasos 3.1. y 3.2. dos veces (pasos de lavado).
  10. Retirar el sobrenadante y añadir 100 μL de Reaction Cocktail (paso 3.8.) en cada tubo con organoides.
  11. Incubar en RT durante 30 minutos en la oscuridad.
  12. Repita los pasos 3.1. y 3.2 (etapas de lavado).
  13. Centrifugar organoides a 50 × g durante 5 min en RT.
  14. Resuspender organoides en 1 mL de 10 μg/mL Hoechst33342 diluido en PBS.
  15. Incubar en RT durante 45 min en la oscuridad.
  16. Repita los pasos 3.1. y 3.2 (etapas de lavado).
  17. Centrifugar organoides a 50 × g durante 5 min a 4 °C.
  18. Siembre los organoides de la matriz BME elegida en un portaobjetos compatible con la microscopía confocal (p. ej., pocillo μ-Slide 18)
  19. Imagen de organoides bajo un microscopio confocal.

4. Análisis semiautomático de imágenes

NOTA: Para este análisis se utilizó arivis Pro versión 4.2.2 (software de análisis de imágenes).

  1. Importe las imágenes del microscopio confocal en el software de análisis de imágenes y defina una carpeta en la que se guardará el archivo de análisis. Utilice la opción Imágenes como puntos de tiempo para importar varias imágenes (replicar imágenes, diferentes puntos de tiempo, diferentes tratamientos, etc.). Cada imagen se tratará como un único punto de tiempo, lo que permite cambiar fácilmente entre las imágenes individuales.
  2. Abra el panel de análisis e importe la canalización de análisis proporcionada como Archivo complementario 1 (arivis_EdU_pipeline).
  3. Utilice la herramienta Colocar nuevos objetos y la Esfera con la etiqueta Organoide para rodear fácilmente todos los organoides bien separados.
  4. Cambie a la siguiente imagen, es decir, al siguiente punto de tiempo, y proceda a marcar organoides para todas las imágenes.
  5. Para los organoides que están muy cerca unos de otros y, por lo tanto, no se pueden separar usando el modo Esfera , abra la lista de objetos y active la etiqueta Organoide.
  6. Continúe utilizando la herramienta Dibujar objetos en el modo Polígono para marcar los contornos de los organoides a mano.
    NOTA: En la lista de objetos, todos los organoides ahora están marcados y asignados a un punto de tiempo específico. Este punto de tiempo corresponde al orden de las imágenes importadas en el paso 4.1. Ahora se puede cambiar el nombre de estos puntos de tiempo para que coincidan con el nombre de la imagen original si se prefiere.
  7. En la lista de objetos, marque todos los objetos (=organoides) y haga clic con el botón derecho, luego haga clic en Eliminar etiquetas para eliminar la etiqueta Manual de todos los objetos.
  8. Desactive la etiqueta Organoide en la lista de objetos y marque todas las áreas dentro de los objetos previamente definidos que deben excluirse del análisis utilizando la herramienta Dibujar objetos en el modo Polígono . Estas áreas pueden incluir células muertas dentro de la luz del organoide o áreas borrosas, lo que podría sesgar el análisis.
  9. Al abrir la lista de objetos, asegúrese de que todos los organoides estén enumerados con la etiqueta Organoide y que todas las áreas que deben excluirse tengan la etiqueta Manual.
  10. Inicie la canalización de análisis haciendo clic en la flecha en el panel superior izquierdo.
    NOTA: El software ahora segmenta todos los núcleos en los canales Hoechst33342 y EdU. Esta canalización de análisis solo tiene en cuenta los núcleos segmentados de Hoechst33342+ y EdU+ de más de 15μm2 de tamaño (es decir, el área en el segmento del núcleo) para garantizar que los núcleos pequeños, muy probablemente procedentes de células muertas, se excluyan del análisis.
  11. Busque los resultados del análisis en la lista de objetos haciendo clic en la etiqueta Columnas de características .
  12. Cambie a la vista de detalles maestra y seleccione la etiqueta Organoides en el panel superior y la función Primer punto de tiempo.
  13. En el panel inferior, seleccione las características que desea mostrar por organoide. Utilice el área de proyección (x/y/z) (vóxel), la intensidad media # 1 (canal EdU) y las intensidades SD # 1.
  14. Exporte los resultados (Informe de detalle maestro) utilizando la función de exportación de Excel .
  15. Guarde el archivo de análisis y cierre el software.

5. Determinación de las tasas de proliferación de organoides

  1. Abra el archivo de informe de detalle maestro exportado en el paso 4.14.
  2. Hay una pestaña separada para cada imagen analizada. Calcule la suma de área/vóxel para los núcleos y la tinción de EdU para cada imagen. A continuación, copie todos los datos resultantes en una nueva pestaña colectiva y agrupe todos los datos que se refieran al mismo punto temporal.
  3. A continuación, calcule el área total de los núcleos celulares (es decir, la suma del área de Hoechst33342+ y el área de EdU+ ) para cada imagen.
  4. Posteriormente, divida el área total por sí misma (= 100%) y el área media de EdU+ por el área total (=porcentaje de ADN de EdU+ ).
  5. Grafique el porcentaje de ADN proliferativo de los organoides BO y AO en el eje y y los diferentes puntos de tiempo en el eje x.

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Resultados

Los organoides cultivados durante 3 días después de la tripsinización deben estar idealmente entre 50-250 μm, como se muestra en la Figura 2A. Es posible que los organoides que son considerablemente más grandes que esto no inviertan su polaridad de manera eficiente. Los organoides más grandes también pueden comenzar a brotar, y hemos notado que estos organoides también pueden tener problemas con la inversión eficiente de la polaridad. Los organoides basales y apicales pr...

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Discusión

Este protocolo describe en detalle cómo inducir la inversión de polaridad en cultivos estándar de organoides intestinales derivados de células madre adultas. Los organoides apicales cumplen el propósito de acceder a la superficie de la célula apical, que generalmente está orientada hacia la luz del organoide. Ser capaz de sondear la superficie apical puede ser de gran importancia para ciertas aplicaciones, ya que esta es la porción de la membrana celular que está expuesta a todo el conte...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

Esta investigación fue apoyada utilizando recursos del VetImaging Core Facility (VetCore, Vetmeduni, Austria). Queremos agradecer a Ursula Reichart por su apoyo con el análisis semicuantitativo de imágenes. GC es beneficiario de una beca DOC (subvención número 26349) de la Academia Austriaca de Ciencias (ÖAW) en la División de Medicina Interna de Pequeños Animales de Vetmeduni.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
placas de 24 pocillosBiologix07-6024
[Leu15]-Gastrin I humano, ≥ 95% (HPLC)Sigma-AldrichG-9145
µ-Slide 18 Well Glass Bottomibidi81817
100X Penicilina-Estreptomicina suplemento para MediaGibco/Thermo15140122
A 83-01 Tocris Bioscience2939/10 
Solución de enjuague antiadherenteStemCell Technologies7010
arivis ProZeissVersión 4.2.2
B27 Suplemento sin suero (50X), líquidoGibco/Thermo17504044
Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342)Abcamab145597
Albúmina de suero bovinoSigma-AldrichA7906-100G
Click-iT EdU Kit de proliferación celular para imágenes, colorante Alexa Fluor 647Thermo ScientificC10340
DMEM-F12Gibco/Thermo11320033
GeltrexGibco/ThermoA1413202
GlutaMAX Suplemento Gibco/Thermo35050061
HEPES Solución tampón 1 M, líquidoGibco/Thermo 15630056
Human FGF-basicPeproTech100-18B-100µ G
HGF humanoPeproTech100-39-100µ G 
IGF-I  humanoPeproTech100-11-100µ G
CABEZA humana (mamífero) PeproTech120-10C-200µ G 
N-acetil-L-cisteína, cultivo celular probado, biorreactivoSigma-AldrichA9165-5G 
Solución de recolección de organoidesThermoC10340
Triton (TM) X-100, para biología molecularSigma-AldrichT8787-250ML
Tripsina-EDTA (0,05%), rojo de fenolGibco / Thermo25300054

Referencias

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