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Artículo de método

Células similares a islotes derivadas del trasplante de células ductales en ratas

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DOI:

10.3791/68066

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1 de agosto de 2025

 , 
1Department of Physiology, Ankara Medipol University Faculty of Medicine

En este artículo

Resumen

Las células similares a islotes derivadas de células ductales demuestran potencial para el tratamiento de la diabetes al reducir los niveles de glucosa en sangre y mejorar la producción de insulina en ratas diabéticas. Sin embargo, siguen existiendo desafíos para garantizar una función celular suficiente, defensa inmunológica y seguridad. Se requiere investigación adicional para mejorar la capacidad terapéutica de estas sustancias.

Resumen

El uso de células similares a islotes derivadas de células ductales ha surgido como un enfoque potencial para tratar la diabetes tipo 1. Los pacientes diabéticos tienen una síntesis insuficiente de insulina en sus cuerpos debido a la destrucción autoinmune de las células beta pancreáticas responsables de producir insulina. En este marco, el objetivo del trasplante de células de los islotes es restablecer la capacidad de los pacientes para producir insulina. Sin embargo, obstáculos como la adquisición insuficiente de células de los islotes del páncreas del donante y las reacciones inmunes dificultan la amplia aplicación de este método de terapia. En circunstancias específicas, las células ductales pancreáticas poseen la capacidad de transformarse en células que producen insulina. Estas células podrían cultivarse en un ambiente controlado y convertirse en células similares a islotes que tienen la capacidad de liberar insulina, lo que las hace adecuadas para el trasplante. Esta estrategia innovadora ofrece el potencial de detener la progresión de la diabetes tipo 1 y reducir la dependencia de las inyecciones de insulina. En este estudio, las células similares a islotes derivadas de células ductales se trasplantaron al hígado a través de la vena porta del hígado en ratas diabéticas inducidas por estreptozotocina. Después del trasplante, notamos reducciones sustanciales en los niveles de glucosa en sangre de las ratas a partir del día 5, que continuaron durante 15 días. Además, una prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal (IPGTT) demostró que las ratas diabéticas que recibieron los trasplantes de células similares a islotes produjeron significativamente más insulina que el grupo de control. Estos resultados sugieren que las células similares a los islotes derivadas de células ductales pueden ser un enfoque terapéutico prometedor para la diabetes. Los principales obstáculos en este campo de estudio incluyen lograr una capacidad funcional suficiente para las células, protegerlas del sistema inmunológico y garantizar su seguridad para la aplicación terapéutica. Los esfuerzos de estudios futuros tienen el potencial de proporcionar información crucial para optimizar el uso de estas células en entornos terapéuticos, con un enfoque en mejorar tanto la eficacia como la seguridad.

Introducción

La diabetes tipo 1 es un trastorno autoinmune persistente marcado por la destrucción de las células beta en el páncreas que producen insulina. Los tratamientos actuales incluyen principalmente terapia con insulina a largo plazo, que, aunque tiene éxito en el control de los niveles de glucosa en sangre, no proporciona una cura para la afección ni detiene su avance1. La investigación de terapias alternativas para la diabetes tipo 1 está motivada por la necesidad de alternativas más eficaces que el énfasis existente en el tratamiento con insulina. La investigación en curso se ha visto impulsada por esto, centrándose en tratamientos alternativos como el trasplante de células de los islotes, que busca restablecer la capacidad inherente del cuerpo para producir insulina. Aún así, el hecho de que las células de los islotes del donante sean difíciles de conseguir y exista la posibilidad de rechazo inmunológico ha dificultado que este tratamiento se use ampliamente. Como resultado, la comunidad científica se ha interesado cada vez más en encontrar fuentes alternativas de células que produzcan insulina 1,2,3.

Este método busca aprovechar el potencial de regeneración de estas células para establecer un suministro sostenible de células secretoras de insulina4. Las investigaciones in vitro han demostrado la capacidad de estas células ductales para transformarse en células funcionales similares a betas capaces de secreción de insulina en respuesta a la estimulación de la glucosa5. Esta línea de investigación es especialmente vital, considerando los resultados desfavorables relacionados con el trasplante convencional de islotes debido a las intrincadas respuestas inmunes involucradas. Numerosos estudios indican que las células derivadas del ducto no solo tienen la capacidad intrínseca de generar insulina, sino que también pueden demostrar características que podrían promover la tolerancia inmune, mitigando así algunos desafíos asociados con las técnicas tradicionales de trasplante 5,6,7,8. Estas células pueden cultivarse fuera del cuerpo, convertirse en células parecidas a islotes que pueden liberar insulina y, posteriormente, implantarse en personas con diabetes. Las investigaciones preclínicas, que abarcaron experimentos con ratas diabéticas inducidas por estreptozotocina, han demostrado que el trasplante de estas células puede reducir eficazmente los niveles de glucosa en sangre y mejorar la secreción de insulina9.

Nuestro enfoque se centró en acelerar el proceso de diferenciación y mejorar la funcionalidad de las células productoras de insulina mediante el aumento del medio de cultivo celular estándar con insulina-transferrina-selenio (ITS)10,11,12, isoxazol 9 (ISX-9)13,14 y GLP-15. Se informa que estos factores son esenciales para facilitar la diferenciación pancreática y mejorar la secreción de insulina. La integración de estos componentes tenía como objetivo lograr células funcionales similares a islotes de manera más eficiente, asegurando su capacidad para producir y liberar insulina en respuesta a la estimulación de la glucosa 9,10,11,12,13,14.

En el trasplante de islotes, el rechazo inmunológico constituye un obstáculo importante para lograr resultados exitosos. Los islotes alogénicos trasplantados son vulnerables al ataque inmunológico, requiriendo terapias inmunosupresoras para evitar el rechazo16,17. La participación de las células ductales pancreáticas en el rechazo inmunológico durante el trasplante de islotes representa un campo de estudio en desarrollo. Se cree que las células ductales pueden tener propiedades que podrían reducir el rechazo inmunológico, lo que haría que los islotes trasplantados tengan más probabilidades de sobrevivir y funcionar correctamente. Ilieva et al. demostraron que los islotes cocultivados con células ductales exhibieron una reducción de la necrosis central y la apoptosis, lo que indica un efecto protector contra el daño inmunomediado. Este efecto puede estar mediado por factores como el factor de crecimiento similar a la insulina 2 (IGF-2) secretado por las células ductales, como lo señalan Marín-Cañas et al. (2019)18. El efecto protector es esencial, ya que el rechazo inmunológico plantea un desafío considerable para el éxito del trasplante de islotes, especialmente en la diabetes tipo 1. Las células ductales en los injertos de islotes se han asociado con una mayor función y supervivencia del injerto, probablemente atribuible a su capacidad para secretar factores inmunomoduladores que mitigan la respuesta inmune19.

A pesar de los avances prometedores, se deben resolver algunos obstáculos para garantizar la eficacia operativa y la seguridad de estas terapias basadas en células para uso clínico. Es esencial verificar que las células inducidas exhiban propiedades funcionales comparables a las células beta nativas y establecer técnicas efectivas para proteger estas células de las agresiones del sistema inmunológico para asegurar su supervivencia y funcionalidad prolongadas20,21. A medida que avanza este dominio de investigación, el conocimiento integral y la resolución de estos obstáculos serán esenciales para aprovechar la promesa de las células productoras de insulina derivadas de células ductales en el tratamiento de la diabetes tipo 1 22,23,24.

Este estudio tiene como objetivo evaluar la eficiencia in vivo de las células ductales derivadas de células flodularias, desarrolladas en condiciones óptimas, para la restauración del control glucémico en un modelo de rata diabética inducida por estreptozotocina.

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Protocolo

Este estudio se adhirió a las recomendaciones de ARRIVE, asegurando que el diseño, la ejecución y el informe de la investigación cumplieran con altos estándares de bienestar animal e integridad experimental (https://arriveguidelines.org). La Universidad Medipol de Ankara obtuvo la aprobación del comité de ética (AMUHADYEK-12- 09.05.2025) y la autorización institucional. Todos los métodos se realizaron de acuerdo con las pautas y regulaciones aplicables. Se promulgaron todas las medidas para minimizar el sufrimiento de los animales y emplear el número mínimo de animales necesario para lograr los objetivos científicos.

1. Preparación de soluciones

  1. Solución enzimática: Preparar una solución de colagenasa con 50 mg de colagenasa tipo V de Clostridium histolyticum en polvo. Preparar una solución de 50 ml combinando colagenasa con HBSS (que contiene Ca-Mg) para lograr una concentración de 1 mg/ml. Utilice 7 ml de la solución por muestra y coloque el resto en el congelador a -20 °C.
    NOTA: La concentración recomendada de colagenasa es de 1 mg/1 ml. Antes de ser introducida en las jeringas, la colagenasa debe mezclarse con la solución de HBSS preparada previamente hasta una concentración de 1 mg/ml.
  2. Solución de lavado 1: Retirar 62,5 ml de 500 ml de HBSS sin rojo de fenol. Agregue 50 ml de FBS al HBSS restante con mucho cuidado. Agregue 5 ml de penicilina/estreptomicina (P/S), 5 ml de L-glutamina (L-Gln) y 2,5 ml de HEPES 1 M. Lleve el volumen a 500 ml.
    NOTA: Con la adición de rojo de fenol, el volumen final consiste en 88% de HBSS, 10% de FBS, 1% de P/S y 1% de l-Gln. Para evitar la formación de espuma y asegurar la precisión, incorpore cuidadosamente el suero fetal bovino paso a paso.
  3. Medio de cultivo para células y solución de lavado 2: Retire 62,5 ml de 500 ml de medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI con L-Gln). Tenga cuidado para evitar que el FBS forme espuma durante la adición gradual de 50 ml al RPMI restante. Agregue 2,5 ml de HEPES de 1 M, 5 ml de P/S y 5 ml de L-Gln. Asegúrese de que el volumen total sea de 500 ml. Conservar a 4 °C.
  4. Soluciones de gradiente de densidad: Prepare las soluciones de densidad final diluyendo la solución de densidad de 1100 mg/ml con solución de HBSS para obtener un rango de densidad intermedio de 1062-1096 mg/ml. Para garantizar la precisión, verifique con un densitómetro la densidad de cada solución preparada. Utilice la solución de concentración 1077 como referencia. Una vez obtenidas las concentraciones deseadas (1062-1096 mg/mL), transfiera las soluciones a recipientes herméticos y guárdelas en un lugar oscuro a 4 °C para mantener su estabilidad.
  5. Prepare una solución de azul de tripano al 0,4%. El desarrollo celular es promovido por la solución salina tamponada con fosfato (PBS), que tiene un pH de 7,4.
  6. Medio de crecimiento de cultivo celular: Combine 43,4 ml de medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) y medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM-bajo en glucosa). Agregue 10% de suero fetal de ternero (FCS), 1% de insulina-transferrina-selenio (ITS), 1% de L-glutamina (L-Gln), 1% de penicilina-estreptomicina (P/S) y 0,2 ml de 1 M HEPES. Aumente el volumen final a 100 ml. Conservar a 4 °C.
  7. Medio de diferenciación de cultivo celular: Agregue 43,4 ml de RPMI con 43,4 ml de DMEM bajo en glucosa. Agregue 10% de FCS, 1% de insulina-transferrina-selenio (ITS), 1% de L-Gln, 1% de P/S y 0,2 ml de 1 M HEPES en la mezcla. Además, agregue 1 μL de Isoxazol 9 (ISX-9) diluido en 4 mL de etanol al medio de diferenciación. Finalmente, agregue 24 μL de una solución de péptido similar al glucagón 1 (GLP-1) a una concentración de 50 nM en el medio de cultivo celular.
    NOTA: ISX-9 y GLP-1 solo se agregan frescos durante los cambios de cultivo; están preparados previamente. Se requiere una nueva preparación para cualquier material cultural.
  8. Solución de ditizona (DTZ): Disuelva 100 mg de ditizona en 20 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) y mezcle bien. Agregue 30 ml de HBSS a la solución resultante y revuelva hasta obtener una mezcla homogénea. Filtre la solución con filtros de 0,2 o 0,4 μm. Agregue 50 ml de HBSS a la solución filtrada. Etiquete la solución con la fecha de preparación. Una vez que los sólidos estén completamente descompuestos, pase la solución a través de un dispositivo de filtro de 0,4 μm. Coloque la solución filtrada en tubos de 2 ml y utilícelos de inmediato, después de que se hayan descongelado. Mantener la solución que se ha preparado a -20 °C.
  9. Solución de Krebs: En un recipiente de 250 ml, agregue 1,68 g de cloruro de sodio (durante 115 mM), 0,50 g de bicarbonato de sodio (durante 24 mM), 0,09 g de cloruro de potasio (para 5 mM), 0,05 g de cloruro de magnesio (durante 1 mM), 0,09 g de cloruro de calcio (durante 2,5 mM) y 0,25 g de albúmina sérica bovina (para 0,1%). Agregue 6,25 ml de HEPES 1 M. Ajuste el volumen a 250 ml agregando agua desionizada y revuelva hasta que todo esté combinado. Ajuste el pH a un rango de 7,3 a 7,5, utilizando NaOH 1 M o HCl 1 M. Filtre a través de un filtro de 0,22 μm. Almacene las soluciones a temperatura ambiente. En un baño de agua a 37 °C, añadir las soluciones cuando estén listas para ser utilizadas.
  10. Solución de alta concentración de glucosa: Mida y agregue 149,1 mg de D-(+)-glucosa a un tubo. Agregue 50 ml de solución de Krebs al tubo y mezcle bien agitando. Filtrar a través de un filtro de 0,22 μm.
  11. Solución de baja concentración de glucosa: Combine 1 ml de solución de alta concentración de glucosa 16,7 mM con 9 ml de solución de Krebs.

2. Aislamiento del páncreas de ratas.

  1. Comience con una cohorte de tres ratas de laboratorio Wistar Albino (3 meses de edad/macho) que pesen entre 220 g y 280 g. Anestesiar a los animales con una combinación de ketamina (35-50 mg/kg) y xilacina (5-10 mg/kg). Verifique la profundidad de la anestesia por la falta de respuesta de retirada del pedal. Aplique ungüento veterinario en los ojos para evitar que se sequen.
  2. Comience el proceso quirúrgico con una incisión abdominal de 3-4 cm en la línea media a lo largo de la línea alba con unas tijeras. (Figura 1A). Realice una manipulación delicada del hígado ejerciendo una suave presión física con los dedos en la caja torácica para elevar el diafragma. Exteriorice el hígado y colóquelo sobre una gasa estéril para mayor estabilidad.
  3. Preparar una solución estandarizada de colagenasa a una dosis de 28 mg/g de peso corporal y extraer 7 ml (aproximadamente 7 g) en la jeringa para ratas que pesen entre 250 y 300 g. Modifique el volumen de la solución en función del peso corporal de cada animal.
  4. Hacer una incisión en el conducto pancreático. Con unas tijeras vasculares finas, corte el conducto cerca del hígado. Use posiciones anatómicas en relación con el páncreas y la vasculatura circundante para identificar el conducto. Utilice señales de ubicación como vasos sanguíneos cercanos y características de tejido para garantizar la precisión. Haz un corte perfecto en este lugar para la oclusión.
    NOTA: La incisión era mínima, demasiado pequeña para medirla con precisión, pero lo suficientemente ancha como para permitir la inserción del catéter. La incisión permite una colocación suave y eficiente del catéter, asegurando un trauma mínimo en el tejido circundante.
  5. Inserte un catéter con un intracket integrado dentro de la abertura ductal generada (Figura 1B). Tras la colocación correcta, sujete el catéter con una pinza quirúrgica (p. ej., microfórceps) para evitar que se desprenda.
  6. Administrar la solución enzimática de colagenasa mediante infusión controlada a través de la depresión gradual e intencional del émbolo.
  7. Después de la inflación, use instrumentos quirúrgicos finos para separar cuidadosamente el tejido pancreático de las estructuras circundantes. Realice la escisión rápidamente y con maniobras precisas y suaves para minimizar el daño tisular. Inmediatamente después de la extracción, coloque el páncreas en un tubo de 50 ml sobre hielo para detener cualquier actividad enzimática.
  8. Todo el proceso debería durar alrededor de 60 s para un páncreas25. Además, hasta que todos los páncreas se hayan congestionado, mantenga la colagenasa y los páncreas extirpados en hielo.

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Figura 1: Procesamiento pancreático. (A) El pinzamiento de la abertura del conducto pancreático en el duodeno y (B) la inflación de colagenasa tipo 5 da como resultado una imagen del páncreas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3 Aislamiento de células ductales del tejido pancreático

  1. Después de la extracción quirúrgica, incubar el páncreas en un baño de agua a 37 °C durante 12 min.
  2. Agregue 25 ml de solución de lavado 1 al tubo para neutralizar la actividad de la colagenasa. Agite manualmente el tubo para promover la descomposición del tejido pancreático. Realice todos los procedimientos posteriores bajo un campo estéril con flujo laminar.
  3. Mantenga todos los medios en hielo. Centrifugar muestras a 4 °C, a 100 x g durante 1 min, y poner el freno al máximo. Deseche el sobrenadante. Al pellet celular, agregue 25 ml de solución de lavado 1 y vuelva a suspender la mezcla.
  4. Vuelva a realizar la centrifugación y deseche el sobrenadante. Al pellet, agregue 25 ml de solución de lavado 1 y vuelva a suspender. Cuele el tejido pancreático procesado a través de una malla de acero de 425 μm para eliminar cualquier fragmento de tejido vascular residual o no digerido.
  5. Después de la filtración, haga que el volumen sea de 25 ml con la solución de lavado 1. Realice la centrifugación 1x a 100 x g durante 1 min a 4 °C. Retire el sobrenadante.
  6. Transfiera el gránulo a un nuevo tubo con una pipeta de plástico estéril después de agregar 50 ml de medio RPMI. Centrifugar la muestra de nuevo a 100 x g durante 1 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y guarde el gránulo para su posterior análisis.
    NOTA: Todos los pasos restantes se realizaron dentro de cabinas de flujo laminar en condiciones estériles adecuadas para experimentos de cultivo celular.
  7. Agregue 10 ml de solución de densidad 1.077 al pellet adquirido después del último, seguido de una suave interrupción y homogeneización del pellet golpeando el borde del tubo con un dedo.
    NOTA: El rango de densidad para aislar las células de los islotes del tejido pancreático circundante es de aproximadamente 1,077, en contraste con la densidad del medio, que es de aproximadamente 1,00126. En consecuencia, empleamos la solución de densidad 1.077 para este objetivo.
  8. Añadir 10 mL de RPMI y centrifugar a 600 x g durante 12 min a 4 °C con los frenos apagados. Este procedimiento estableció una división basada en la densidad dentro de los tubos, lo que resultó en la acumulación de células de los islotes en una capa justo debajo de la capa RPMI, colocada directamente debajo de la capa RPMI.
  9. Se eliminaron tanto las células de los islotes como el RPMI. El objetivo de este paso era purificar las células de los islotes para mejorar su eliminación de los tejidos pancreáticos, lo que resultó en un proceso de aislamiento de células ductales más puro.
  10. Retire cualquier exceso de tejido pancreático en un nuevo tubo de 50 ml con una pipeta. Agregue 10 ml de solución de densidad 1.096 al gránulo de tejido.
  11. A continuación, agregue lentamente 10 ml de gradiente de solución de densidad 1.062 con una jeringa. Preste atención a mantener una distribución homogénea de los componentes. Haga un gradiente apilando soluciones en orden de más denso a menos denso.
  12. Agregue 10 ml de RPMI encima. Centrifugar tubos a 600 x g durante 12 min a 4 °C sin frenos. Después de girar, se ven diferentes capas de densidad. Las células ductales están en la capa intermedia, debajo de la capa RPMI.
  13. Retire con cuidado las células ductales con una pipeta Pasteur desechable y colóquelas en un tubo separado de 50 ml. Añadir 25 ml de solución de lavado 2 y mezclar la suspensión suavemente dando golpecitos en el tubo con un dedo.
  14. Gira el tubo a 100 x g durante 1 min y desecha el sobrenadante. Realice dos rondas más de centrifugación con el pellet. Después del último lavado, agregue 2 ml de solución de lavado 2 al pellet27.

4. Aislamiento y cultivo de células ductales

  1. Inocular las células recolectadas en un matraz T25 y agregar 5 ml de fluidos de cultivo celular precalentados. Mantener la incubadora al 5% deCO2y 37 °C.
    NOTA: Mantener estables las temperaturas fisiológicas es importante para que el cultivo celular funcione, por lo que todas las soluciones se calentaron a unos 37 °C antes de su uso.
  2. Después de 24 horas, aspire el medio con cuidado. Enjuague las celdas dos veces con solución de lavado 2. Agregue medio de cultivo celular fresco y devuelva el matraz a la incubadora. Aquellas células que se adhirieron a la superficie del matraz se llamaron células ductales.
  3. Reemplace el medio de cultivo cada 3 días. Si el color del medio cambia muy rápidamente, significa que está perdiendo nutrientes y se está volviendo más ácido, lo que indica que el medio debe cambiarse con más frecuencia.
  4. Células de paso una vez que las células de los matraces alcanzan el 80% de confluencia. Lavar con 1-2 ml de PBS 2x y eliminar cualquier medio adicional.
  5. Agregue 2 ml de solución de disociación enzimática (sin rojo de fenol) para iniciar el proceso de descomposición enzimática y separar las células de la superficie del matraz.
  6. Incubar durante 2-3 min y evaluar el desprendimiento celular bajo un microscopio de 10x. Si las células permanecen parcialmente adheridas, vuelva a incubar a 37 °C durante 2 min más.
  7. Después de que las células se hayan separado completamente de la superficie del matraz, detenga la digestión enzimática agregando aproximadamente 8 ml de medio de crecimiento celular, que es 4 veces el volumen de la solución de disociación enzimática. Golpee suavemente las paredes del matraz.
    NOTA: El tapping, que puede ayudar a las células a separarse, reduce el tiempo total de incubación y evita que las enzimas dañen la membrana celular, asegurando que esto suceda después del contacto prolongado con la solución de disociación enzimática.
  8. Después de añadir los medios de cultivo celular, transfiera la suspensión celular a tubos de 15 ml y centrifugue a 150 x g durante 10 min a 25 °C con un ajuste de desaceleración suave (velocidad 9 de rotura) para granular las células.
  9. Deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender el gránulo celular en 6-8 ml de solución de lavado 2. Repita la centrifugación como se indicó anteriormente. Deseche el sobrenadante. El procedimiento se repitió para garantizar la eliminación completa de la solución de disociación enzimática.
  10. Con un pipeteo suave, vuelva a suspender el gránulo en 5 ml de medio de cultivo celular fresco para obtener una suspensión celular uniforme. En esta etapa, realice el recuento de células.
  11. Mezcle 10 μL de la suspensión celular con 10 μL de azul de tripano y cuente las células con un hemocitómetro.
  12. Sembrar 1 × 106 células por matraz T25 utilizando la suspensión contada.
    NOTA: En ese momento, la mayoría de las células habían sido identificadas como células ductales. Se sembró una buena cantidad de células en cada plato según el recuento de células que se realizó. Según lo que vimos en los experimentos, las células se distribuyeron en dos matraces T25 diferentes una vez que alcanzaron el mejor nivel de confluencia en un matraz. Esto se hizo para mantener alta la eficiencia de la proliferación. Pudimos separar con éxito las células ductales del tejido del páncreas de rata utilizando este método. Después de separarse con éxito, las células se prepararon para más experimentos de acuerdo con el plan de estudio.
  13. Continúe cultivando hasta el pasaje 4. Células de paso cuando sea necesario para mantener condiciones óptimas de crecimiento.
    NOTA: A partir del pasaje 4, hubo un aumento notable en el número de células entre los días 3 y 9. Dado que las células tienden a ser menos capaces de dividirse después de más ciclos, este método se aseguró de que hubiera suficientes células viables. Una vez que las células ductales crecieron lo suficiente, comenzaron a convertirse en células similares a islotes. Según lo que encontramos, las células entre las etapas 3 y 6 tienen las tasas de proliferación más rápidas. El pasaje 4 muestra un aumento particularmente notable en el número de células ductales. Sin embargo, después del pasaje 6, hubo una disminución en la capacidad proliferativa. El protocolo se modificó en función de estos resultados para obtener el número correcto de células manteniendo su viabilidad y utilidad28.

5. Diferenciación de células ductales en grupos similares a islotes

  1. Recolecte 4 células ductales utilizando el procedimiento de paso estándar. Lave dos veces con 1-2 ml de PBS para eliminar el medio residual y las células sueltas.
  2. Añadir 2 ml de solución de disociación enzimática (sin rojo de fenol) al matraz. Incubar a 37 °C durante 2-3 minutos y monitorizar bajo un microscopio de 10x.
  3. Si las células permanecen adheridas, incube durante otros 2 minutos. Detenga la reacción enzimática agregando 8 ml de medio de crecimiento celular.
  4. Transfiera la suspensión a un tubo de 15 ml y centrifugue a 150 × g durante 10 minutos a 25 °C, configurando 9 para acelerar y reducir la velocidad.
  5. Deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender el gránulo en 6-8 ml de solución de lavado 2. Centrifugar y desechar el sobrenadante.
  6. Vuelva a suspender el pellet final en medio fresco de 5 ml. Cuente las celdas como se describió anteriormente.
  7. Siembre 1 × 105 células por pocillo en una placa de seis pocillos, agregando 3 ml de medio por pocillo. Incubar a 37 °C, 5% CO2.
  8. Reemplace el medio cada 3 días durante los primeros 7 días. Ajuste la frecuencia si el color medio cambia rápidamente.
  9. Cambie gradualmente al medio de diferenciación después de 7 días. Continuar cultivando durante 15 días en total (7 días de crecimiento + 8 días de diferenciación). Cambiar de medio cada 2 días durante la diferenciación.
  10. El día 8, comience la fase de diferenciación. Después de 4 días, lave las células dos veces con PBS y agregue 500 μL de solución de disociación enzimática.
  11. Incubar 2-3 min, deteniendo la reacción agregando 2 mL de medio de crecimiento. Centrifugar a 150 x g durante 10 min a 25 °C. Vuelva a suspender y volver a sembrar 1 x 105 células por pocillo en placas de seis pocillos.
  12. El día 15, realizar un análisis microscópico completo para caracterizar y confirmar claramente la formación de agregados celulares similares a islotes24.

6. Cuantificación de la concentración de zinc en células ductales diferenciadas por ditizona

  1. Descongele y equilibre la solución DTZ desde el almacenamiento a -20 °C. Agregue 3-4 gotas de solución DTZ a cada pocillo de las células diferenciadas de 15 días. Observe bajo un microscopio. Identifique las células productoras de insulina mediante tinción roja28 (Figura 2).

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Figura 2: Imágenes de microscopio de células ductales similares a islotes. Imágenes en (A) día 11 de cultura (20x), (B) día 13 de cultura (20x), (C, C) día 15 de cultura (20x). Las células se visualizaron después de la tinción con ditizona. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

7. Prueba de estimulación de glucosa

  1. Siembre 1 x 104 racimos en forma de islotes por pocillo en una placa de 24 pocillos con 1 ml de medio de diferenciación por pocillo.
  2. El día 15, estimula las células con glucosa. Retire el medio existente y agregue 1 ml de solución baja en glucosa (1,67 mM). Incubar 1 h a 37 °C.
  3. Recoja el medio y transfiéralo a tubos de 2 ml. Agregue 1 ml de solución con alto contenido de glucosa (16,7 mM). Incubar 1 h. Recopile el medio para el análisis. Recoger el medio de cultivo celular cada 1 h entre la adición de diferentes soluciones de glucosa.
  4. Realice ELISA de insulina siguiendo las instrucciones del fabricante. Una vez retirado de la bolsa de aluminio, deje que la microplaca se equilibre a temperatura ambiente antes de comenzar el procedimiento ELISA.
  5. Agregue 10 μL de reactivo a la muestra, al control y a los pocillos estándar. Agregue 75 μL de solución conjugada de trabajo. Sela la placa e incubar durante 2 h a temperatura ambiente con agitación (700-900 rpm).
  6. Lave los pocillos 6 veces con 350 μL de tampón de lavado. Agregue 100 μL de sustrato de 3,3′,5,5,5,5-tetrametilbencidina (TMB) por pocillo. Selle las placas e incube 15 min en la oscuridad agitando (700-900 rpm) a temperatura ambiente.
  7. Agregue 100 μL de solución de parada por pocillo y mezcle agitando suavemente la placa para detener el proceso. Elimine las burbujas y lea la absorbancia a 450 nm. Mida durante 30 min después de la adición de la solución de parada27.

8. Trasplante de islotes y células ductales similares a islotes

  1. Anestesiar ratas con ketamina (100 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg). Desinfecte y cubra el sitio quirúrgico. Haga una incisión de 2-3 cm en la línea media.
  2. Desplace los intestinos y exponga la vena porta con retractores. Realice una venotomía e inserte un catéter precargado con solución salina (Figura 3A).
  3. Infundir 100-500 μL de suspensión celular en la vena porta. Retire el catéter y cierre la venotomía con suturas o adhesivo. Cierre el abdomen y controle la recuperación, proporcionando analgesia según sea necesario (Figura 3B).

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Figura 3: Trasplante de islotes y células similares a islotes. (A) Intracatéter intravenoso estéril utilizado para trasplantar islotes y células similares a islotes. (B) Trasplante de islotes y células similares a islotes en una jeringa estéril. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

9. Ratas diabéticas inducidas por estreptozotocina (STZ)

  1. Ratas rápidas 12 h. Administrar 45 mg/kg de STZ por vía intraperitoneal, disueltos en tampón de citrato frío (pH 4,5).
    NOTA: El ayuno durante 12 h antes de la inyección de STZ mejora la expresión de GLUT2, lo que facilita el transporte de glucosa en las células beta pancreáticas. Este proceso aumenta la absorción de STZ en las células, lo que resulta en un mayor daño de las células beta. Este mecanismo facilita la progresión de una hiperglucemia más significativa y mejora la eficacia del modelo de diabetes.
  2. Confirmar la diabetes 48-72 h después de la inyección con glucosa en sangre >250 mg/dL. Clasificar a las ratas que generalmente alcanzaban valores de glucosa en sangre superiores a 250 mg/dL como diabéticas e incorporarlas al experimento29.

10. Preparación de islotes y células similares a islotes para trasplante.

  1. Recoja las células después del tratamiento con la solución de disociación enzimática durante 1 min. Raspe las células que se adhieren a la superficie. Reemplace con medio nuevo y recolecte las células.
  2. Centrifugar a 300 x g durante 5 min. Vuelva a suspender el sedimento en 100-150 μL de solución salina. Realice el recuento de células y ajuste el recuento de células a 1000 IEQ u 800 islotes por rata o 1 x 10 5 células similaresa islotes por rata.

11. Trasplante de vena porta

  1. Anestesiar a los animales mediante inyección intraperitoneal de ketamina (100 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg).
  2. Desinfecte la región del abdomen del animal con una solución estéril (betadine o etanol al 70%). Envuelva el área quirúrgica con un paño estéril.
  3. Haga una incisión en la línea media, de aproximadamente 2-3 cm de longitud, para acceder a la cavidad abdominal.
  4. Desplaza los intestinos para revelar el hígado. Asegure los lóbulos izquierdo y derecho del hígado con retractores estériles. Exponga la superficie ventral del hígado para localizar la vena porta.
  5. Enjuague previamente el catéter de polietileno (PE-10 o PE-50) con solución salina y llénelo por completo. Use pinzas microquirúrgicas para sostener una rama de la vena porta, generalmente la rama lateral izquierda o derecha.
  6. Realice una venotomía menor (aproximadamente 1-2 mm). Inserte con cuidado el catéter en el sitio de la venotomía. Para evitar el desplazamiento, use material de sutura o fórceps para anclar el catéter, generalmente usando un hilo de sutura 6-0.
  7. Verifique el posicionamiento preciso del catéter administrando gradualmente soluciones salinas estériles. El catéter administró gradualmente la suspensión de células de los islotes preparada y células similares a islotes en la vena porta. El volumen total es de 100-500 μL.
  8. Al finalizar la infusión, retire el catéter y use adhesivo de tejido estéril o suturas absorbibles para sellar el sitio de la venotomía.
  9. Llevar a cabo el manejo de hemorragias. Reposicione todos los tejidos que rodean el hígado y sutura los músculos abdominales con hilo absorbible. Asegure la piel con suturas o clips.
  10. Mantenga al animal bajo vigilancia en un ambiente cálido. Proporcionar analgésicos adecuados para el manejo del dolor durante la salida de la anestesia (p. ej., buprenorfina 0,1 mg/kg). Observar animales durante 48 h. Examine si hay indicios de infección, edema en el sitio quirúrgico o hemorragia30.

12. Monitoreo de glucosa en sangre

  1. Evaluar los niveles iniciales de glucosa en sangre. Sostenga con cuidado la rata y use una lanceta para crear un pequeño corte en la punta de la cola. Retire suavemente la gota inicial de sangre con un hisopo de algodón estéril.
  2. Aplique la segunda gota de sangre en la tira reactiva de glucosa y documente el nivel de glucosa de referencia31.

13. Prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal

NOTA: Las ratas se someten a la prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal (IPGTT) para evaluar la eficiencia de eliminación de glucosa de su torrente sanguíneo. Esta prueba ofrece información sobre el metabolismo de la glucosa, la sensibilidad a la insulina y las posibles afecciones diabéticas. La prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal se realizó el día 15 en el día 15 después del trasplante. La razón principal para implementar una duración de ayuno designada antes del IPGTT es estabilizar los niveles basales de glucosa y garantizar un estado metabólico constante. El período de ayuno facilita el agotamiento de las reservas de glucógeno hepático, lo que permite una evaluación más confiable de la respuesta de tolerancia a la glucosa. El ayuno durante 6 h reduce los efectos posprandial, mientras que el ayuno nocturno (aproximadamente 12-16 h) puede tener distintas implicaciones, lo que puede influir en la sensibilidad a la insulina y el metabolismo de la glucosa.

  1. Someter a las ratas a un período de ayuno de 6 h, con solo acceso al agua durante la noche, asegurando que la duración del ayuno no exceda las 12 h. Asegure un período de ayuno uniforme para todos los sujetos para reducir la variabilidad en las mediciones de glucosa.
  2. Antes de administrar glucosa, pese las ratas. Para preparar una solución estéril, disuelva 20 g de glucosa en 100 ml de solución salina estéril.
    NOTA: La dosis estándar es generalmente de 2 g de glucosa/kg de peso corporal (2 g/kg). El volumen total dado está determinado por el peso corporal del animal.
  3. Evaluar los niveles basales de glucosa en sangre. Sostenga la rata y use una lanceta para hacer una pequeña incisión en la punta de la cola. Retire suavemente la primera gota de sangre con un hisopo de algodón estéril.
  4. Aplique la segunda gota de sangre a la tira reactiva de glucosa y registre el nivel de glucosa de referencia.
  5. Según el peso corporal de la rata, administre la cantidad adecuada de solución de glucosa a razón de 2 g / kg.
  6. Antes de la administración intraperitoneal (IP) de la solución de glucosa, manipule suavemente a la rata. Inyecte glucosa en la cavidad peritoneal, no en el tejido subcutáneo ni en ningún órgano, y asegúrese de que sea una administración correcta.
  7. Después de la inyección de glucosa, recolecte muestras de sangre a intervalos específicos para controlar los niveles de glucosa. Los intervalos de tiempo típicos son 15, 30, 60, 90 y 120 min después de la inyección.
  8. En cada punto, recolecte sangre cortando la vena de la cola. Antes de cada extracción de sangre, asegúrese de limpiar la cola con un hisopo con alcohol.
  9. En cada punto de tiempo designado, mida los niveles de glucosa y documente con un medidor de glucosa.
  10. Durante la prueba, controle a las ratas para detectar signos de malestar o reacciones adversas. Para minimizar el estrés de los animales entre mediciones, mantenga un ambiente cálido y tranquilo.
  11. Después de la última medición de glucosa en sangre, limpie las heridas de la cola y consuele a los animales29.

14. Análisis de insulina a través de ELISA después de la extracción de sangre

NOTA: Los pasos de este protocolo son extraer sangre de la aorta abdominal de una rata y luego usar el método de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para detectar insulina.

  1. Anestesiar a la rata antes de la extracción de sangre como se describió anteriormente. Coloque la rata anestesiada en posición supina sobre una plataforma quirúrgica estéril.
  2. Afeitar la zona abdominal y desinfectar la zona con etanol al 70% o solución de yodo para asegurar la esterilidad.
  3. Haga una incisión en la línea media con un bisturí para penetrar la piel y las capas musculares y exponer la cavidad abdominal.
  4. Retraiga los intestinos para acceder a la aorta abdominal ubicada adyacente a la columna vertebral. Use una jeringa heparinizada para insertar la aguja en la aorta abdominal en un ligero ángulo.
  5. Recolecte sangre (generalmente de 1 a 3 ml, según el tamaño de la rata) en la jeringa. Aplicar succión gradual y constante para evitar el colapso vascular o la hemólisis de la sangre.
  6. Coloque la sangre recolectada en un tubo de centrífuga y manténgala en hielo.
  7. Si el animal va a ser sacrificado después del procedimiento, realice la eutanasia de acuerdo con las pautas éticas institucionales.
  8. Centrifugar la sangre recogida a 300 x g durante 10-15 min a 4 °C para asegurar la separación del plasma o suero. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y guárdelo a -80 °C para su posterior análisis de insulina.
    NOTA: Es importante evitar la hemólisis durante la extracción de sangre, ya que esto puede afectar la precisión de los resultados de ELISA (Figura 4)29.

figure-protocol-4
Figura 4: Se obtuvieron muestras de sangre de la vena de la cola de ratas en tubos de sangre para análisis de insulina al final del experimento el día 15 después del trasplante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

15. Medición de insulina por ELISA

  1. Prepare el kit ELISA de insulina de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Deje que todos los reactivos, estándares y muestras alcancen la temperatura ambiente antes de comenzar el ensayo.
  2. Determine el número requerido de pocillos en la placa ELISA para estándares, controles y muestras de suero de rata.
  3. Prepare las muestras de suero de rata para su análisis diluyéndolas como se indica en el protocolo del kit ELISA, por ejemplo, dilución 1:10 en PBS.
  4. Preparar patrones de insulina mediante dilución en serie para generar una curva estándar, por ejemplo, que oscile entre 0 y 10 ng/ml.
  5. Dispense estándares, controles y muestras diluidas de suero de rata (generalmente 50-100 μL por pocillo) en los pocillos indicados de la placa ELISA. Dispense la solución de anticuerpos de detección provista con el kit en cada pocillo para garantizar una distribución uniforme.
  6. Incube la placa durante el tiempo especificado (generalmente 1-2 h) a temperatura ambiente o de acuerdo con las instrucciones proporcionadas.
  7. Después de la incubación, asegúrese de que los pocillos se laven con el tampón de lavado designado, generalmente PBS que contiene 0.05% Tween-20, para eliminar las sustancias no unidas. Realice el paso de lavado de 3 a 5 veces de acuerdo con las instrucciones del kit, asegurándose de que cualquier líquido restante se elimine por completo después de cada lavado.
  8. Coloque la solución de sustrato en cada pocillo. El sustrato interactuará con el anticuerpo unido a la enzima, provocando un cambio de color; La intensidad del color está relacionada con la cantidad de insulina presente en la muestra. Incube la placa en la oscuridad durante el tiempo indicado por el kit, que generalmente oscila entre 15 y 30 minutos.
  9. Agregue la solución de parada a cada pocillo para terminar la reacción colorimétrica. El cambio de color se estabilizará después de la adición de la solución de parada, que generalmente es amarilla.
  10. Mida inmediatamente la densidad óptica (OD) de cada pocillo utilizando un lector de placas configurado a 450 nm (o según lo especificado por el kit).
  11. Genere una curva estándar trazando las concentraciones conocidas de estándares de insulina contra los valores de densidad óptica (DO) correspondientes.
  12. Calcular la concentración de insulina en muestras de suero de rata utilizando la curva estándar y los valores de DO correspondientes. Los niveles de insulina deben informarse en ng/mL u otras unidades apropiadas29.

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Resultados

Análisis de microscopía óptica

Durante los exámenesdel día 14 de las células ductales, el análisis de microscopía óptica reveló que las células se agruparon y formaron una estructura similar a un islote. Este cambio estructural indica que después de un cierto período, las células ductales cambian sus características morfológicas al entrar en un orden organizativo y adquirir una apariencia similar a la de un islote. La tendencia de las células a agruparse probablemen...

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Discusión

El estudio de la capacidad funcional de las células similares a islotes de diferentes fuentes ha atraído un interés considerable en la investigación de la diabetes. La investigación inicial muestra que estas células pueden liberar insulina cuando se elevan los niveles de glucosa, lo que sugiere que podrían imitar las funciones de los islotes pancreáticos naturales. Los investigadores han utilizado la tinción de ditizona para verificar la semejanza fenotípica de las células similares a los islotes con los islotes pancreát...

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Divulgaciones

El autor o autores no informaron de ningún posible conflicto de intereses.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer al equipo de laboratorio por sus contribuciones al estudio.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Cloruro de sodio al 0,9%Sahar PharmaPara la extirpación del páncreas y el trasplante de células
Pipeta serológica estéril de 10 ml -estéril Corning4488Para el aislamiento
placa de 24 pocillosCorning353047Para GSIS 
Pipeta serológica estéril de 25 ml Corning4489Para aislamiento
de etanol al 70%ISOLAB64-17-5Para la desinfección de ratas
betadineBaticonol  1186Para la desinfección de ratas
Biocholl 1077SigmaL6715-BCPara la purificación del páncreas
Biocoll, Densidad 1,10 g/mLSigmaL6155-BCPara la purificación del páncreas
Medidores de glucosa en sangre y tiras reactivas de glucosaOn Call PlusPara la medición de la glucosa en sangre
BSASigmaA9418Para la preparación de krebs
CaCl2Sigma57647902Para la preparación de krebs
Composición del catéter: Catéter de polietileno (intravenoso intravenoso) Bicakcilar24G  y 14GPara el páncreas y el hígado
CentrífugaThermoST1R PlusPara aislamiento 
Colagenasa tipo V, ≥ 1 unidades FALGPA / mg sólido,
>125 CDU / mg sólido		SigmaC9263- 1GPara la digestión del páncreas
D-(+)-glucosa Sigma50-99-7Para GSIS e IPGTT
Ditizona (DTZ)SigmaD5130Para determinación de islotes
DMSOSigmaD8779Para resolver DTZ
Dulbecco' s Águila modificada' s Medio (DMEM— glucosa baja) Gibco11885084Para cultivo celular
Tubo de EppendorfISOLABPara lavado celular
Tubo Falcon (50 mL)ISOLABLB. IS.078.02.009Para
aislamiento de suero fetal bovino (FBS)SigmaN4637Para aislamiento y cultivo de páncreas
Aguja fina y material de sutura (tamaño 6-0 o 7-0)PROLENE Azul 18" Aguja P-1 | 8697GPara la extirpación de páncreas y trasplante de células
péptido similar al glucagón 1 (GLP-1) Aladdinrp174144Para cultivo celular
Solución salina equilibrada de Hank (HBSS con Ca-Mg) CapricornioHBSS-1APara la preparación enzimática
HBSS sin calcio, sin magnesio, sin rojo de fenolBIOCHROM  L2015Para aislamiento de páncreas
HEPESLonzaPara cultivo celular
Insulina ElisaAlpco80-INSRT-E01Para insulina elisa
insulina-transferrina-selenio (ITS)GibcoITS -GPara cultivo celular
Isoxazol 9 (ISX-9) AladdinI304735-10mgPara cultivo celular
KClSigma329820207Para la preparación de krebs
Ketamina HCl 200 mg/mLNexGenPara ratas anestesia
Cabinas de flujo laminarLabor IldamBSC-1100IIA2-XPara aislamiento y período de cultivo
LancetasAyset28 GPara medir la glucosa
en sangreL-glutaminaSigma59202cPara aislamiento y cultivo de páncreas
MgCl2Sigma329759772Para la preparación del lector de microplacas krebs
BioTek SynergyH1 Lector multimodode insulina elisa
VWR  444-0270Para insulina elisa
Microscopio microquirúrgicoEMZ-200TR3.9X Para la extirpación de páncreas y trasplante de células
Tijeras y pinzas microquirúrgicasAesculapPara la extracción de páncreas y trasplante de células
Inserto de cultivo de células colgantes Millicell, tereftalato de polietileno 8.0µ m MILLIPOREPIEP30R48 Para GSIS 
NaClSigma7647-14-5Para la preparación de krebs
NaHCO3Sigma144-55-8Para la preparación de krebs
Pasteur Pipette 3 MlBIOSIGMAPara el aislamiento
penicilina/estreptomicinaSigmaPara el aislamiento y cultivo del páncreas
Solución salina tamponada con fosfato (PBS) BIOCROMO L1815Para el paso celular
Retractor (para la estabilización del hígado y los tejidos conectivos)AesculapPara la extirpación del páncreas y el trasplante de células
Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI con L-Gln)CapricornRPMI-APara el aislamiento y cultivo del páncreas
Dynarexpunta de algodón estérilPara la extirpación del páncreas y el trasplante de células
Jeringa estéril (10 ml)Ayset32MM 22Greacción Collegenase
KenkoKK613Dpara
estreptozotocina IPGTT (STZ)Sigma18883-66-4Para ratas diabéticas
Unidad de filtro de jeringa (GP-0.22 µ m-3 mm)MillexSLGP033RSPara la esterilización de medios de cultivo celular
Matraz T25Thermo130189Para cultivo
Reactivos TrypLE ExpressGibcode paso celular
 Labor IldamALB128Para reacción de collegenasa
Xilacina 2% p/v Solución para inyecciónRompunPara anestesia de ratas
de Para agitador de microplacas de con para cronómetro de Para baño de agua

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