Aquí, presentamos un protocolo para cuantificar la dinámica espacio-temporal de la activación y fosforilación de Akt en células HepG2 vivas. Las imágenes de transferencia de energía por resonancia (FRET) de Förster son una poderosa herramienta que proporciona información valiosa sobre las vías de señalización de la insulina y la regulación metabólica en las células cancerosas.
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Artículo de método
Imágenes de transferencia de energía por resonancia de Förster de células vivas de la dinámica de activación de Akt regulada metabólicamente en células HepG2
En este artículo
Resumen
Resumen
La activación de Akt regulada metabólicamente es un nodo crítico en la cascada de señalización de insulina y proporciona información valiosa sobre la relación entre la diabetes y el cáncer. Para cuantificar con precisión la actividad de Akt en células HepG2, desarrollamos un protocolo robusto y reproducible que utiliza la transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) con biosensores específicos de Akt codificados genéticamente. Este protocolo describe los pasos detallados para el cultivo celular, la preparación de la placa de imágenes y la transfección de células HepG2 para expresar biosensores basados en FRET, junto con pautas específicas para la configuración de hardware y software de microscopio confocal de escaneo láser. Los resultados demostraron patrones únicos de señalización de insulina en las células HepG2, que exhiben un interruptor irreversible caracterizado por la activación constitutiva de Akt con un umbral de encendido definido pero sin umbral de apagado. Por el contrario, los miotubos muestran un interruptor reversible. La activación persistente de Akt en las células HepG2 sugiere mecanismos subyacentes a la resistencia a la insulina y la desregulación metabólica en las células hepáticas, con implicaciones más amplias para comprender la progresión de los trastornos metabólicos y el cáncer. Este protocolo ofrece un marco valioso para explorar las vías de señalización relacionadas con Akt y los comportamientos celulares en diversos contextos de enfermedades.
Introducción
La diabetes mellitus plantea un importante desafío para la salud mundial, caracterizada por resistencia a la insulina y alteración de la homeostasis de la glucosa1. Una comprensión integral de las vías de señalización de la insulina es crucial para dilucidar la fisiopatología de esta enfermedad, ya que la insulina desempeña un papel fundamental en el metabolismo de la glucosa, el crecimiento celulary la supervivencia. Numerosos estudios han demostrado que la señalización de la insulina tiene un impacto significativo en varios tipos de cáncer, relacionando la resistencia a la insulina con....
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Protocolo
En la Figura 1 se muestra una descripción general de los pasos experimentales involucrados en la obtención de imágenes de células vivas FRET para monitorear la fosforilación de Akt en células HepG2 individuales.
1. Adquisición, propagación y purificación de plásmidos
NOTA: En esta sección se describen los pasos esenciales para adquirir, amplificar y purificar el plásmido necesario para el análisis FRET de una sola célula.
- Utilice el plásmido pEevee-iAkt-NES-YPet (Figura 2A).
NOTA: El plásmido fue generosamente proporcionad....
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Resultados
Para investigar la activación de Akt en las células HepG2, las células se sembraron en placas de imagen prerrevestidas y se transfectaron con el biosensor pEevee-iAkt-NES basado en FRET (Figura 2A), diseñado para permitir el monitoreo en tiempo real de la fosforilación de Akt. Después de la transfección, las células se sometieron a inanición sérica durante 4 h en un medio libre de suero para sincronizar su estado metabólico y minimizar la señalización de insulina basal.
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Discusión
El protocolo para la obtención de imágenes FRET de células vivas para monitorizar la fosforilación de Akt en células HepG2 implica varios pasos clave para garantizar resultados fiables y reproducibles. El primer paso crítico es el cultivo celular, que incluye el mantenimiento celular de rutina, el recubrimiento de las placas de imágenes y la siembra de células. El recubrimiento adecuado es esencial para la unión de las células durante los experimentos de imágenes de lapso de tiempo, ya q.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación de Ciencias Naturales de Shenzhen (JCYJ20240813113606009), la Zona de Cooperación Shenzhen-Hong Kong para Tecnología e Innovación (HZQB-KCZYB-2020056), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32070681), el Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (2019YFA0906002) y el Plan del Pavo Real de Shenzhen (KQTD2016053117035204).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,25% tripsina-EDTA | Gibco | Categoría#25200-056 | Use PBS helado para el lavado de celdas |
| Plato de cultivo celular con fondo de vidrio de 15 mm | NIDO | Gato#801001 | |
| 2 Viales criogénicos Nalgene mL | Thermo Scientific | Categoría#5012-0020 | |
| 5 ml de pipetas serológicas Stripette | Corning | Categoría#4487 | |
| 95% de etanol | Kermel | Gato#C028005 | |
| Microscopio confocal A1 HD25/A1R HD25 | Nikon | https://www.nikon.com/ | Aumento: 40 veces, Apertura numérica (NA): 1.30, Tiempo de permanencia de píxeles: 2.4 ms, Tamaño de píxel: 1024 |
| Ampicilina | Sigma-Aldrich | Categoría#A9393 | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | VWR Ciencias de la vida | Gato#N208-10g | |
| Corning 25 Matraces de cultivo rectangulares CM2 | Corning | Gato#430639 | |
| Contador de celdas automatizado Countess 3 | Thermo Scientific | http://www.thermofisher.com/#AMQAX2000 | |
| Portaobjetos de la cámara de recuento de células Countess | Thermo Scientific | http://www.thermofisher.com/#C10228 | |
| Mezcladores de vórtice digitales | Thermo Scientific | https://www.thermofisher.com/ | |
| Dimetilsulfóxido | Sigma-Aldrich | Categoría#D2650 | |
| Tubos Eppendorf Safe-Lock 1.5 Ml | Eppendorf | Gato#022363204 | |
| Kit de detección de micoplasma EZ-PCR | Industrias biológicas | Categoría # 20-700-20 | |
| Suero fetal bovino, calificado, Australia | Gibco | Gato#10099141 | |
| Suplemento GlutaMAX | Gibco | Gato#35050061 | |
| GraphPad Prisma 9 | GraphPad Software | https://www.graphpad.com/ | |
| HepG2 | Colección Nacional de Cultivos Celulares Autentificados | #CSTR:19375.09.3101HUMSCSP510 http://www.cellbank.org.cn/ | |
| Aceite de inmersión tipo 37 | Laboratorios Cargille | Gato #16237 | |
| Insulina | Sigma-Aldrich | Cat#I5500-50MG | Cálido a 37 ° C antes de usar |
| LB Caldo (1x) | Invitrogen | Gato#10855001 | |
| Medio Mínimo Esencial (MEM) | Gibco | Gato#11095080 | Cálido a 37 ° C antes de usar |
| mySPIN 12 mini centrífuga | Thermo Scientific | https://www.thermofisher.com/ | |
| NanoDrop Uno | Thermo Scientific | https://www.thermofisher.com | |
| Lente de aceite Nikon Plan Fluor 40×/1.30 | Nikon | https://www.nikon.com/ | |
| NIS-Elements-AR | Nikon | https://www.nikon.com/ | |
| Aminoácidos no esenciales (NEAA) (100x) | Gibco | Gato#11140050 | |
| Placas de agar LB de un solo disparo | Invitrogen | Modelo#A55802 | |
| One Shot Stbl3 químicamente competente E. Coli | Invitrogen | Gato#C737303 | |
| Parafilm | PARAFILM | Gato#B8R05606 | |
| PBS (solución salina tamponada con fosfato) | Gibco | Gato#10010023 | |
| pEevee-iAkt-NES (7,033 bp) | Miura et et al31 | https://benchling.com/s/seq-q46zFYCfl0swLAun0t28/edit | |
| Penicilina-estreptomicina | Gibco | Gato#15070063 | |
| Profiláctico de plasmocina | InvivoGen | Cat#ant-mpp | |
| Bromhidrato de poli-L-lisina | Sigma-Aldrich | Categoría#P4832 | |
| Baños de precisión de uso general | Thermo Scientific | https://www.thermofisher.com/ | |
| Kit de minipreparación de giro QIAprep | QIAGEN | Categoría#27106 | |
| SnapGene | SnapGene de Dotmatics | https://www.snapgene.com | |
| Piruvato de sodio (100 mM) | Gibco | Gato#11360070 | |
| Unidad de filtro de jeringa, 0.22 μ m | Millipore | Gato#SLGP033RS | |
| Incubadora superior de Tokai Hit stage | GOLPE TOKAI | https://www.tokaihit-livecell.com/stagetopincubator | |
| Agua destilada sin DNasa/RNasa UltraPure | Invitrogen | Gato#10977015 | |
| Reactivo de transfección Xfect | Biografía de Takara | Gato#631317 |
Referencias
- GBD 2021 Diabetes Collaborators. Global, regional, and national burden of diabetes from 1990 to 2021, with projections of prevalence to 2050: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2021. Lancet. 402 (10397), 203-234 (2023).
- Li, M., et al.
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Reimpresiones y permisos
