Method Article

Generación y caracterización de astrocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanamente que carecen de ribonucleoproteína mensajera X frágil

DOI:

10.3791/68081

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June 6th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Centre for High Impact Neuroscience and Translational Applications, TCG Centres for Research and Education in Science and Technology, 2Centre for Brain Development and Repair, 3National Centre for Biological Sciences, Tata Institute for Fundamental Research, 4Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí describimos un protocolo que facilita la diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas en astrocitos funcionales específicos del prosencéfalo. Esto permite investigar el papel de las células gliales en la patogénesis de los trastornos del neurodesarrollo, como el síndrome del cromosoma X frágil, y modelar otros trastornos cerebrales.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El síndrome del cromosoma X frágil (SXF), una de las principales causas hereditarias del trastorno del espectro autista y la discapacidad intelectual, se ha estudiado ampliamente utilizando modelos de roedores. Más recientemente, los sistemas modelo derivados de células madre humanas también se han utilizado para obtener información mecanicista sobre la fisiopatología del SXF. Sin embargo, estos estudios se han centrado casi exclusivamente en las neuronas. Además, a pesar de la creciente evidencia de un papel clave de la glía en la función neuronal en la salud y la enfermedad, se sabe poco sobre cómo los astrocitos humanos se ven afectados por el SXF.

Por lo tanto, en este estudio, desarrollamos con éxito un protocolo que captura los hitos espacio-temporales clave del desarrollo del cerebro y también se alinea con el proceso de gliogénesis. En conjunto, esto ofrece un marco útil para estudiar los trastornos del neurodesarrollo. En primer lugar, modelamos las células madre pluripotentes inducidas humanas en el linaje neuroectodérmico con doble supresor de madres contra la inhibición decapentopléjica (SMAD) y moléculas pequeñas. Posteriormente, utilizamos factores de crecimiento específicos y citocinas para generar células progenitoras astrocíticas (APC) derivadas de pacientes de control (CTRL) y FXS. El tratamiento de las APC con factor neurotrófico ciliar, una citocina diferenciadora, reguló y condujo a las células progenitoras hacia la maduración astrocítica, produciendo astrocitos que expresan proteínas ácidas fibrilares gliales específicas del prosencéfalo.

Encontramos que estos astrocitos son funcionales, como lo demuestran sus respuestas de calcio a la aplicación de ATP, y exhiben un metabolismo glucolítico y mitocondrial desregulado en el FXS. Tomados en conjunto, estos hallazgos proporcionan una plataforma experimental útil de origen humano para la investigación de las consecuencias autónomas y no celulares de las alteraciones en la función astrocítica causadas por trastornos del neurodesarrollo.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El síndrome del cromosoma X frágil (SXF), una forma hereditaria común de discapacidad intelectual y trastorno del espectro autista (TEA), es causada por la falta de ribonucleoproteína mensajera del cromosoma X frágil (FMRP) producida por el gen de la ribonucleoproteína 1 mensajera del cromosoma X frágil (FMR1) (OMIM: #300624, https://www.omim.org/entry/300624). FMRP desempeña un papel en la regulación de la traducción de ARNm, la formación y el transporte de gránulos de ARNm y la regulación de la expresión génica mediada por microARN1. Por lo tanto, la pérdida de FMRP afecta no solo el desarrollo del cerebro, sino también la función cerebral adulta. Tanto los niveles de transcripción de ARNm de FMR1 como la inmunotinción para FMRP en el cerebro han mostrado una alta expresión neuronal, junto con una expresión significativa en las células gliales2. Sin embargo, la gran mayoría de los estudios anteriores en modelos animales de SXF se centraron principalmente en las neuronas y las aberraciones en su función. En consecuencia, se sabe poco sobre el papel de la glía en FXS3. Tradicionalmente consideradas como células de "soporte pasivo"4, cada vez hay más pruebas de que los astrocitos son fundamentales para mediar una amplia gama de funciones neuronales 5,6, incluyendo la promoción de la sinaptogénesis7, el refinamiento de los circuitos neuronales en desarrollo8 y el reciclaje de neurotransmisores9. Paralelamente, cada vez hay más evidencias del papel de los astrocitos en la patogénesis de la enfermedad y muchas afecciones neurológicas se han asociado con la disfunción astrocítica10.

Si bien gran parte de los trabajos anteriores en los que se utilizaron modelos animales de SXF se centraron en identificar y validar varios objetivos moleculares en las neuronas para el tratamiento del SXF, estos hallazgos preclínicos no siempre han dado lugar a resultados clínicos exitosos. Además, los reveses en los ensayos clínicos recientes también subrayan la necesidad de sistemas modelo basados en humanos. Los modelos de trastornos neurológicos basados en células cerebrales derivadas de células madre humanas ofrecen una poderosa estrategia para cerrar esta brecha entre los conocimientos mecanicistas de los estudios en animales y el éxito limitado con los resultados clínicos para los pacientes. Sin embargo, solo un puñado de estos estudios se han centrado en los astrocitos y también en los astrocitos de origen espinal. Esto, a su vez, es relevante a la luz de los estudios que muestran que la estructura y función de los astrocitos varía entre las regiones cerebrales11,12. Por lo tanto, una mejor comprensión de los cambios inducidos por enfermedades en los astrocitos humanos también debe tener en cuenta estas diferencias específicas de la región cerebral en los astrocitos. Sin embargo, los modelos de trastornos del neurodesarrollo que utilizan astrocitos derivados de células madre humanas que son específicos del prosencéfalo siguen siendo comparativamente poco explorados13. Por lo tanto, para comenzar a abordar estas brechas, describimos protocolos para generar astrocitos específicos del prosencéfalo a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) derivadas de pacientes portadoras de mutaciones en el SXF; Además, demostramos que los astrocitos son funcionales y muestran un metabolismo alterado.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los experimentos con células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) (Tabla 1) se realizaron después de obtener las aprobaciones regulatorias institucionales apropiadas. La Figura 1A representa el protocolo completo de diferenciación de las hiPSCs a los astrocitos maduros específicos del prosencéfalo.

1. Mantenimiento y expansión de las hiPSC

  1. Un día antes de enchapar las iPSC, cubra un plato de 6 pocillos con Matrigel diluido 1:60 (una matriz extracelular [ECM]) en Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 (DMEM/F12) y almacene a 2-8 °C.
    NOTA: Evite almacenar placas recubiertas de Matrigel durante >5 días a 2-8 °C, ya que esto puede causar la degradación de proteínas en el ECM con el tiempo. Para evitar que el plato se seque, cubra un mínimo de 1 ml de Matrigel diluido 1:60 por pocillo de un plato de 6 pocillos y extiéndalo uniformemente por todo el plato. Si se usa el mismo día, mantenga la placa en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2 durante 1 h.
  2. El día del cultivo de las hiPSCs, retire el material de recubrimiento y añada 1 mL de medio Essential 8 completo (medio basal E8 con suplemento Essential 8) junto con el inhibidor de ROCK 1x concentración final y mantenga la placa en una incubadora a 37 °C y 5% de CO2 antes de añadir las hiPSCs.
  3. Vuelva a suspender las hiPSC en medio E8 completo junto con el inhibidor de ROCK a 1x concentración final para una mejor adherencia de las colonias.
    NOTA: No prepare grandes cantidades de medio de cultivo. Prepare solo durante 3-4 días como máximo y almacene a 2-8 °C.
  4. Al día siguiente, reponga el medio E8 completo sin el inhibidor de ROCK hasta que las células estén confluentes en un 80% (aproximadamente 4-5 días).
  5. Cuando alcancen el 80% de confluencia, separar las colonias enzimáticamente.
    1. Para el paso de las iPSC, retire el medio gastado de la placa y agregue 1 mL por pocillo de mezcla precalentada (37 °C) de colagenasa (2 mg/mL) y dispasa (1 mg/mL) en una proporción de 1:1 e incube a 37 °C durante más de 20-30 min para permitir que las colonias de iPSC se levanten.
      NOTA: No deje los platos a 37 °C durante más de 20-30 min; Más allá de este período, las colonias se desintegrarán y las células morirán.
  6. Cuando las colonias comiencen a levantarse, saque las placas de la incubadora y neutralice la actividad enzimática agregando 2 mL de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco.
  7. Raspe las colonias con DPBS y recoja la suspensión en un tubo cónico de 15 mL con una pipeta serológica de 10 mL de diámetro ancho.
  8. Triture suavemente la suspensión 2-3 veces para romper las colonias con una pipeta serológica de 10 ml y deje que las colonias se asienten.
    NOTA: No convierta las colonias en celdas individuales; Esto puede hacer que las células no se adhieran a la placa y causar más muerte celular. Además, no las dejes como grandes colonias; Esto dará lugar a colonias más diferenciadas más adelante.
  9. Una vez que las colonias se asienten (aproximadamente después de 2 minutos), aspire la mezcla de enzimas DPBS dejando aproximadamente 1 mL en el tubo.
  10. Agregue 2 ml de DPBS al tubo, mezcle las colonias dando golpecitos y deje que se asienten. Repita esto 2 veces para eliminar toda la enzima residual de las colonias. Retire la mayor cantidad posible de sobrenadante después del2º lavado, vuelva a suspender las colonias en 1 ml de medio E8 completo y coloque en un plato recién preparado como se menciona en los pasos 1.2-1.3.
  11. Alternativamente, criopreservar una proporción de colonias utilizando un 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) como solución crioprotectora para su futura expansión y uso.
    1. Prepare el medio de criopreservación recién hecho mezclando un 90% de medio E8 completo y un 10% de DMSO como solución crioprotectora y colóquelo a 2-8 °C hasta su uso.
  12. Para criopreservar, siga los pasos 1.5-1.10.
  13. Durante el paso 1.10, después del2º lavado, deje que las colonias se asienten y elimine el sobrenadante. A las colonias, agregue 1 mL de medio de criopreservación en frío recién preparado y transfiéralo a crioviales.
    NOTA: Después de agregar el medio de criopreservación a las colonias, transfiera rápidamente el contenido a los crioviales. El retraso puede resultar en una tasa de reactivación más baja, ya que el DMSO es un crioprotector que puede dañar las células.
  14. Mueva inmediatamente los crioviales a una caja criogénica y manténgalos en un congelador a -80 °C durante la noche.
  15. Al día siguiente, cambie todos los crioviales a un tanque de nitrógeno líquido (tanque LN2 ) para su uso futuro.
    NOTA: Las hiPSC deben ser cariotipadas rutinariamente usando bandas G (Figura Suplementaria S1) para cualquier anormalidad, caracterizadas usando inmunocitoquímica para la pluripotencia (Figura 1B) y analizadas para micoplasma.
    1. Para caracterizar las hiPSCs mediante inmunocitoquímica, coloque las colonias en cubreobjetos de vidrio de 13 mm recubiertos de Matrigel y esterilizados en autoclave a escala 1:60. Una vez que tengan un 40% de confluente, lavar las células con PBS-T (PBS-0,1% Tween 20), fijar con paraformaldehído al 4% durante 10 min, permeabilizar con Triton X-100 al 0,3% en PBS durante 10 min, y bloquear con albúmina sérica bovina (BSA) al 3% en PBS durante 1 h para evitar la unión inespecífica.
    2. Después del bloqueo, incubar los cultivos con anticuerpos primarios durante 1 h y luego lavar 3 veces con PBS-T durante 5 min cada uno, seguido de los anticuerpos secundarios correspondientes (Tabla de Materiales) en la oscuridad durante 1 h.
    3. Monte los cubreobjetos en portaobjetos de vidrio con medio de montaje y adquiera imágenes mediante escaneo láser confocal a 405 nm, 488 nm, 561 nm y 633 nm. Captura imágenes a 512 x 512 píxeles; establezca el tamaño del paso Z en 0,5 μm con 1 unidad aireada de diámetro de agujero de alfiler.

2. Generación y caracterización de células progenitoras astrocíticas (APCs)

  1. Levante enzimáticamente las hiPSC como se menciona en los pasos 1.5-1.10 y colóquelas en una placa de cultivo en suspensión no adherente (100 mm) con medio químicamente definido14 que contenga 50% de medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM), 50% de mezcla de nutrientes F-12 de Ham (F12), 5 mg/mL de BSA, 1% de concentrado de lípidos químicamente definidos (CD-Lípido), 450 μM de monotioglicerol, 7 μg/mL de insulina, 15 μg/mL de transferrina, Penicilina-estreptomicina al 1% suplementada con mitógenos N-acetilcisteína (1 mM), LDN 193189 (0,1 μM) y SB431542 (10 μM) durante 7 días.
    NOTA: Los inhibidores de moléculas pequeñas SB431542 y LDN-193189 (LDN) son inhibidores de la proteína morfogenética ósea y de las vías de señalización del factor de crecimiento beta transformante.
    A partir de este momento, el medio se repuso una vez cada 2 días o siguiendo el protocolo de lunes/miércoles/viernes.
  2. Coloque la suspensión celular en un agitador orbital a 40 rpm durante 7 días en condiciones normóxicas para ayudar al desarrollo de corticosferas (Figura 1A).
  3. El día 8, transfiera las corticosferas a un medio de proliferación celular que contenga DMEM/F12 avanzado con un 1% de antibiótico-antimicótico, un suplemento de N2 al 1%, un sustituto de glutamina al 1%, un suplemento de B27 al 0,1% y 2,5 ng/ml de factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF) durante 7 días.
  4. Inducir las esferas para la especificación glial sometiéndolas a un medio de enriquecimiento glial que contenga DMEM/F12 avanzado con 1% de antibiótico-antimicótico, 1% de N2, 1% de sustituto de glutamina, suplemento de 0,1% de B27, 20 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico (EGF), bFGF-H (20 ng/mL de bFGF-5 mg/mL de heparina) durante 2 semanas para obtener gliosferas tempranas (Figura 1A).
  5. Para la maduración de las gliosferas tempranas, reemplace bFGF-H con 20 ng/mL de factor inhibidor de la leucemia (LIF) y mantenga las esferas durante 4 semanas.
  6. Después de 4 semanas en el medio de maduración, mantener las esferas en medio de enriquecimiento glial durante períodos prolongados. Para evitar la agregación y la pérdida de viabilidad, cada 2 semanas, corte mecánicamente las gliosferas con una cuchilla industrial estéril y reemplace todo el medio con DNasa I para eliminar los fragmentos de ADN generados por el corte.
  7. Disocie las gliosferas en monocapas de APC utilizando un kit de disociación de papaína y una placa en una placa adherente tratada con cultivo celular con dilución 1:80 de recubrimiento Matrigel.
  8. Propagar las APCs en un medio de enriquecimiento glial hasta que el 80% confluente y hacerlas pasar enzimáticamente utilizando el medio de desprendimiento de células enzimáticas (ver la Tabla de Materiales).
  9. Al paso:
    1. Retire los medios gastados y recójalos en un tubo cónico. A las células, agregue el medio de desprendimiento de células enzimáticas y espere 1-2 minutos. Una vez que las células comiencen a desprenderse, agregue los medios gastados para neutralizar la actividad enzimática.
    2. Recoja la suspensión de la célula y la centrífuga a 800 x ɡ durante 2 minutos.
    3. Aspire el sobrenadante, vuelva a suspender las células en un medio de enriquecimiento glial y coloque aproximadamente 1 x 106 células/pocillo en una placa de 6 pocillos recubierta de Matrigel a escala 1:80.
  10. Para la criopreservación:
    1. Resuspender las células en una mezcla fría de 90% de medio de proliferación de corticosfera (sin bFGF) y 10% de crioprotector. Transfiera las células resuspendidas a crioviales.
    2. Mueva inmediatamente los crioviales a una caja criogénica y manténgalos en un congelador a -80 °C durante la noche.
    3. Al día siguiente, cambie todos los crioviales a un tanque de nitrógeno líquido (tanque LN2 ) para su uso futuro.
      NOTA: Las APC fueron criopreservadas usando DMSO al 10% hasta el pasaje número 6.
  11. Caracterice las APC disociadas mediante inmunotinción (como se menciona en los pasos 1.15.1-1.15.3) con vimentina y marcadores de factor nuclear IA (NFIA) (Figura 1C, D) (consulte la Tabla de materiales para diluciones).
  12. Para confirmar la especificidad regional del prosencéfalo de las APC derivadas de hiPSC, pruebe las células en busca de un marcador del prosencéfalo, como la caja de horquilla humana G1 (hFOXG1) (positivo) y un marcador del cerebro posterior, como el Homeobox B4 humano (hHOXB4) (negativo) mediante qPCR en tiempo real (Figura 1E,F).
    NOTA: Las secuencias de cebadores utilizadas para estos experimentos se han enumerado en la Tabla Suplementaria S1.

3. Generación y caracterización de una población homogénea de astrocitos específicos del prosencéfalo

  1. Diferenciación de astrocitos de APCs
    1. Utilice el medio de diferenciación astrocítico (ADM) durante 14 días para diferenciar las APC en astrocitos. El medio de diferenciación astrocítico contiene Neurobasal, 1% antibiótico-antimicótico, 1% sustituto de glutamina, 1% de suplemento de N2, 0,2% de suplemento de B27, 1% de medio de aminoácidos no esenciales (NEAA) y 10 ng/mL de factor neurotrófico ciliar (CNTF).
    2. Confirmar la identidad astrocítica mediante inmunotinción (como se menciona en los pasos 1.15.1-1.15.3) con marcadores de expresión de proteína ácida fibrilar glial (GFAP) y S100β (Figura 2A,B).
  2. Síntesis de proteínas de novo en APCs y astrocitos
    1. Mantenga las APC y los astrocitos del prosencéfalo derivados de hiPSC en cubreobjetos de vidrio estériles de 13 mm esterilizados en autoclave e inmunotiña como se menciona en los pasos 1.15.1-1.15.3.
    2. Para la síntesis de proteínas de novo , utilice el método de marcado de aminoácidos fluorescente no canónico (FUNCAT), explicado brevemente en los pasos 3.2.3-3.2.6 (Figura 3A).
    3. Para asegurar la deficiencia de metionina, retire el medio de crecimiento de los cultivos y reemplácelo con un medio libre de metionina y cisteína entremezclado con L-azidohomoalanina (AHA) de 1 mM durante 30 min a 37 °C y 5% de CO2.
    4. Lavar los cultivos con PBS-T, fijar con paraformaldehído al 4% durante 10 min, permeabilizar con Triton X-100 al 0,3% en PBS durante 10 min y bloquear con 3% de BSA en PBS durante 1 h para evitar la unión inespecífica.
    5. Incubar los cultivos en la oscuridad durante 1 h a temperatura ambiente con la mezcla de reacción química de células Click y Alkyne Alexa Fluor 647, seguido de anticuerpos primarios durante 1 h y los anticuerpos secundarios correspondientes (Tabla de Materiales) durante 1 h (Figura 3B).
    6. Monte los cubreobjetos en portaobjetos de vidrio con medio de montaje y utilícelos para un análisis posterior de la imagen.
      1. Adquiera imágenes mediante escaneo láser confocal a 405 nm, 488 nm, 561 nm y 633 nm.
      2. Captura imágenes a 512 x 512 píxeles; establezca el tamaño del paso Z en 0,5 μm con 1 unidad aireada de diámetro de agujero de alfiler.
      3. Mantenga los parámetros de microscopía e imagen en un ajuste constante en todos los tipos de células. Captura imágenes de cada réplica biológica en la misma sesión.
      4. Realice mediciones de intensidad utilizando cualquier software de análisis de imágenes estándar (por ejemplo, Fiji o Imaris). En Imaris, utilice el módulo SURFACES para obtener mediciones volumétricas de cuerpos celulares positivos para la señal fluorescente de marcado de aminoácidos no canónicos (FUNCAT) con Vimentin (APCs) y GFAP (astrocitos) limitando el rango de vóxeles (250-350) para eliminar los desechos.
        NOTA: Mantenga los parámetros en todas las réplicas biológicas para ambos tipos de células.
  3. Ondas oscilatorias de calcio inducidas por adenosina 5′-trifosfato (ATP)
    1. Placa de astrocitos en una placa con fondo de vidrio (35 mm) a 5 × 103 células/placa para medir la respuesta celular al ATP.
    2. Dejar que las células se adhieran al fondo de vidrio durante 24 h, lavarlas 3 veces con HBSS (20 mM HEPES, 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM Glucosa, 1 mM MgCl2, pH = 7,3) sin calcio, e incubar en medio de cultivo con 5 μM de colorante métrico Fura-2AM y 0,02% Pluronics F127 durante 1 h a temperatura ambiente.
      NOTA: Fura-2AM es un producto químico sensible a la luz y a la temperatura; almacenar a -20 °C.
    3. Después de la incubación, lave 2 veces con medio de cultivo y reemplácelo con 2 mM de Ca2+ que contenga HBSS y obtenga imágenes de las células a una velocidad de 2 FPS utilizando un objetivo de aceite de 60x (1,35 NA) en un microscopio invertido con compensación de deriva de foco.
    4. Registre las respuestas de calcio inducidas por ATP mediante la aplicación de ATP en baño a la concentración final de 5 mM a 25th s (Figura 4A).
    5. Dibuje regiones de interés alrededor de cada celda utilizando Fiji/ImageJ y calcule la relación F340/F380 en todos los puntos de tiempo (Figura 4B).
  4. Ensayos metabólicos celulares
    NOTA: La tasa de consumo de oxígeno (OCR) y la tasa de acidificación extracelular (ECAR) de las células vivas se midieron según el protocolo del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
    1. Un día antes del ensayo, dejar que los astrocitos se adhieran a la microplaca (1,5 ×10 4 densidad de siembra) en medio CNTF e incubar a 37 °C con 5% de CO2.
    2. Para el ensayo de estrés por glucólisis:
      1. Sustituir el medio de cultivo celular por un medio base suplementado con 2 mM de glutamina (pH ajustado a 7,4) e incubar en una cámara sin CO2 a 37 °C durante 1 h.
        NOTA: el pH debe ajustarse en un baño de agua a 37 °C.
      2. Inserte la placa del cartucho en el instrumento para calibrar el sensor. Después de la calibración, reemplace la placa del cartucho con la placa de cultivo celular a una concentración final de los siguientes componentes del kit: 10 mM de glucosa, 1 μM de oligomicina y 50 mM de 2-desoxiglucosa (2-DG) (Figura 5A).
      3. Al final de la prueba, lisar las células y estimar el contenido total de proteínas.
    3. Para el ensayo de estrés mitocondrial:
      1. Sustituya el medio CNTF por un medio base suplementado con 2 mM de glutamina, 1 mM de piruvato y 10 mM de glucosa (pH ajustado a 7,4) en un baño de agua a 37 °C.
      2. Incubar la placa en una cámara sin CO2 a 37 °C durante 1 h. Mientras tanto, inserte la placa del cartucho en el instrumento para calibrar el sensor.
      3. Después de la calibración, reemplace la placa del cartucho con la placa de cultivo celular con una concentración final de los siguientes componentes del kit: 1,5 μM de oligomicina, 1 μM de cianuro de carbonilo-4 (trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP) y 0,5 μM de rotenona/antimicina A (Figura 5C).
      4. Al final de la prueba, lisar las células y estimar el contenido total de proteínas.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las colonias de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) se mantuvieron utilizando medio definido disponible comercialmente e inmunoteñidas para marcadores de pluripotencia, Oct4 y Nanog (Figura 1B). Las APC FXS y CTRL mostraron proporciones comparables altamente enriquecidas de células inmunopositivas para vimentina y NFIA (Figura 1C,D). Descubrimos que las APC derivadas de hiPSC sanas y FXS mostrar...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, describimos un método para generar astrocitos humanos derivados de iPSC que sirven como plataforma de ensayo para caracterizar los cambios funcionales inducidos por el FXS. Estos astrocitos son funcionalmente viables en cultivo y exhiben varias propiedades, como lo demuestran una serie de mediciones realizadas en el presente estudio. Un paso crítico en este protocolo es la conversión inicial de iPSCs en corticosferas utilizando el método de levantamiento enzimático. En esta etapa, ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos al Prof. Sumantra Chattarji por los fondos internos. Agradecemos al Prof. Gaiti Hasan por el acceso a la configuración de imágenes de calcio, al Centro Central de Imágenes y Flujo-Centro Nacional de Ciencias Biológicas, a Padmanabh Singh y Prangya Hota por la revisión y las sugerencias, y al equipo de Labmate Asia por su ayuda en la realización de los ensayos Seahorse XF.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1-TioglicerolSigma-AldrichM6145
Accutasa  soluciónSigma-AldrichA6964Medio de desprendimiento de células enzimáticas
Adenosina 5′-trifosfato sal de magnesioSigma-AldrichA9187
Advanced DMEM/F-12ThermoFisher Scientific12634010
antibiótico-antimicótico (100x)ThermoFisher Scientific15240062
B-27 Supplement (50x), sin sueroThermoFisher Scientific17504044
Albúminade suero bovinoSigma-AldrichA9418
Concentrado de lípidos químicamente definidosThermoFisher Scientific11905031
Colagenasa, Tipo IV, polvoThermoFisher Scientific17104019
Desoxirribonucleasa IWorthington Biochemical CorporationLK003170
DimetilsulfóxidoSigma-AldrichD2650
Dispasa II, polvoThermoFisher Scientific17105041
DPBS, sin calcio, sin magnesioThermoFisher Scientific14190144
Essential 8 MediumThermoFisher ScientificA1517001
FXS1, FXS2 Instituto Coriell de Investigación MédicaGM07072, GM05848Células de pacientes con FXS
Suplemento GlutaMAXThermoFisher Scientific35050061sustituto de glutamina
Mezcla de nutrientes F-12 de Ham'sThermoFisher Scientific11765054
Células de control saludables Centro Médico Cedars-Sinai ND30625células de control sanas 
Sal de heparina sódica de la mucosa intestinal porcinaSigma-AldrichH3149
IMDMThermoFisher Scientific12440053
Insulina, humanaRoche11376497001
LDN 193189 Stratech ScientificS2618-SEL
Factor inhibidor de leucemia humanoSigma-AldrichL5283
Matrigel  Matriz de membrana basal reducida en factor de crecimiento (GFR)MEM Corning354230
(100x)ThermoFisher Scientific11140050
Mouse FGF-basic (FGF-2/bFGF) Proteína recombinantePeprotech450-33
Mr. Frosty contenedor de congelaciónThermoFisher Scientific5100-0001cryobox
N-2 Suplemento (100x)ThermoFisher Scientific17502048
N-acetil-L-cisteínaSigma-AldrichA9165
Medio neurobasalThermoFisher Scientific21103049
Nunc Biobanco y cultivo celular Tubos criogénicosThermoFisher Scientific377267
Nunc Placa de 6 pocillos tratada con cultivo celularThermoFisher Scientific140675
Sistema de disociación de papaínaWorthington Biochemical CorporationLK003150
Penicilina-EstreptomicinaThermoFisher Scientific15140122
Proteína CNTF humana recombinante, CF R& D Systems257-NT-010
Proteína EGF humana recombinante, CFR& Suplemento RevitaCell236-EG-01M
(100x)ThermoFisher ScientificA2644501
SB431542Tocris1614
Seahorse XFe24 Analyzer Agilent Technologies
Agilent Technologies103015-100
PlacasAgilent Technologies103020-100-100
100 cmBiostar Lifetech
TransferrinRoche10652202001
VWR CuchillasVWR International55411-050
Antibodies 
Primary antibody>CompanyNúmero de catálogo>Dilution
Oct4 (C-10)Santa Cruz Biotechnologysc-5279Dilución: 1:250
Anticuerpo secundario: IgG anti-ratón de cabra, Alexa Fluor 568
NanogR & D SystemsAF1997Dilución: 1:100
Anticuerpo secundario: IgG anti-cabra de burro, Alexa Fluor 488
VimentinaAbcamAb5733Dilución: 1:500
Anticuerpo secundario: IgY anti-pollo de cabra, Alexa Fluor 488
NFIAAbcamAb41851Dilución: 1:500
Anticuerpo secundario: IgG anti-conejo de cabra, Alexa Fluor 568
GFAP-cy3SigmaC9205Dilución: 1:500
Anticuerpo secundario: NA
GFAPDAKOZ0334Dilución: 1:500
Anticuerpo secundario: IgG anti-conejo de cabra, Alexa Fluor 568
S100βDAKOIR504Dilución: 1:500
Anticuerpo secundario: IgG anti-conejo de cabra, anticuerpo anti-núcleos Alexa Fluor 488
, clon 235-1Dilución MAB1281 Merck Millipore: 1:1000
Anticuerpo secundario: IgG1 anti-ratón de cabra, anticuerpos secundarios Alexa Fluor 555
Second  Dilution
Goat anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 568Thermo Fisher Scientific A110041:1000
Donkey anti-Goat IgG, Alexa Fluor 488Thermo Fisher Scientific A110551:1000
IgY anti-pollo de cabra, Alexa Fluor 488Thermo Fisher Scientific A110391:1000
Cabra anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568Thermo Fisher Scientific A110111:1000
Cabra anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488Thermo Fisher Scientific A110341:1000
Cabra anti-ratón IgG1, Alexa Fluor 555Thermo Fisher Scientific A211271:1000
Solución de aminoácidos no esenciales de D SystemsKit de prueba de estrés Seahorse XF Cell Mito de Kit de prueba de estrés de glucólisis Seahorse XF de cultivo de tejidos - Maquinilla de afeitar TCD000100

References

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