Artículo de método

Detección y aislamiento de cáncer en biopsias de próstata mediante histología Raman estimulada e inteligencia artificial

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DOI:

10.3791/68083

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10 de junio de 2025

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1Genecentrix Inc., 2Vancouver Prostate Center, University of British Columbia, 3Invenio Imaging, 4Dept. of Urology, NYU Langone Health, 5Dept. of Radiology, NYU Langone Health, 6Dept. of Biomedical Engineering, NYU Langone Health, 7Dept. of Urologic Sciences, University of British Columbia

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo estandarizado para la detección del cáncer de próstata utilizando histología Raman estimulada (SRH) en muestras de biopsia debido a las ventajas sobre la histopatología tradicional, centrándonos en la preparación de la muestra, la imagen y la inteligencia artificial para mejorar la relación cáncer-tejido. Además, admite biobancos para modelos transcriptómicos, organoides o xenoinjertos, y la identificación de márgenes quirúrgicos intraoperatorios.

Resumen

El cáncer de próstata sigue siendo una de las neoplasias malignas más prevalentes que afectan a los hombres en todo el mundo, por lo que la detección temprana y los avances en la medicina de precisión son cruciales para una intervención y un tratamiento eficaces. Se presenta un protocolo estandarizado para utilizar la histología Raman estimulada (SRH) con inteligencia artificial (IA) integrada en la detección del cáncer de próstata, que ofrece avances significativos sobre los métodos histopatológicos convencionales. La SSR proporciona estos avances al mejorar la eficiencia a través de imágenes casi en tiempo real y sin etiquetas de tejidos frescos y sin teñir, eliminando así los retrasos asociados con el análisis de biopsia tradicional.

Mediante el uso de microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS) para detectar las frecuencias vibratorias específicas de los enlaces CH2 asociados con lípidos y enlaces CH3 unidos a proteínas y ADN, se pueden diferenciar los tejidos cancerosos y benignos en las biopsias de próstata. El modelo de IA mejora aún más la precisión diagnóstica, logrando una precisión del 98,6% en la identificación del cáncer de próstata. El protocolo describe los pasos esenciales para la preparación de muestras, la obtención de imágenes y el análisis de datos, lo que facilita la mejora de los procesos de biobancos y permite aplicaciones posteriores, como la transcriptómica y los estudios de xenoinjertos. Este enfoque acelera el flujo de trabajo de diagnóstico y se muestra prometedor para las aplicaciones intraoperatorias, lo que podría ayudar a los cirujanos a identificar márgenes positivos intraoperatorios. Además, la capacidad de volver a escanear y ajustar las proporciones de cáncer a tejido permite un análisis más personalizado de las muestras de biopsia, lo que mejora la detección de tumores en tejidos no procesados. Se necesita más investigación y validación para la adopción generalizada de la SSR en la práctica clínica.

Introducción

El cáncer de próstata sigue siendo una de las principales neoplasias malignas que afectan a los hombres en todo el mundo, y la detección precoz es fundamental para el éxito de la intervención y el tratamiento1. Históricamente, el diagnóstico del cáncer de próstata se ha basado en gran medida en la evaluación histopatológica de las muestras de biopsia de próstata, más comúnmente a través de la tinción de hematoxilina y eosina (H&E)2. Si bien son efectivos, los métodos tradicionales de análisis de biopsia de próstata generalmente resultan en un período de espera de varios días a semanas, dependiendo de la ciudad o el país, debido a factores logísticos y de procedimiento. Estos retrasos surgen de múltiples pasos que requieren mucha mano de obra, incluida la fijación de formalina, la inclusión en parafina, el corte y la tinción de H&E. Por lo tanto, el tiempo de procesamiento acumulado, agravado por el alto volumen de muestras de biopsia, puede retrasar el diagnóstico y la planificación del tratamiento.

Los avances recientes en las tecnologías de imagen, en particular la microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS), pueden transformar las prácticas diagnósticas al proporcionar un método de imagen robusto que no tiene antecedentes y es fácilmente interpretable 3,4. El SRS utiliza dos rayos láser, el haz de bombeo (ωp) y el haz de Stokes (ωs), que interactúan con la muestra. Cuando la diferencia de frecuencia (Δω = ωp −ωs) coincide con una frecuencia vibratoria molecular específica (Ω), la señal se amplifica debido a la ganancia o pérdida Raman estimulada. Este proceso mejora el contraste de las vibraciones moleculares, lo que permite obtener imágenes altamente sensibles de los tejidos 3,4. El SRS permite la detección de vibraciones moleculares asociadas a las vibraciones de estiramiento del CH2 (2.845 cm-1), correlacionadas con lípidos, y vibraciones de estiramiento del CH3 (2.930 cm-1), vinculadas a proteínas y ADN4. La detección de la señal SRS suele implicar un esquema de transferencia de modulación de alta frecuencia, lo que permite un aislamiento preciso de las señales vibratorias débiles del ruido de fondo.

La microscopía SRS tiene capacidades de corte óptico que permiten obtener imágenes tridimensionales precisas sin la necesidad de seccionar el tejido físico. Esto se logra alineando y enfocando la bomba y los rayos láser de Stokes en un punto de difracción limitada dentro de la muestra, donde se excitan vibraciones moleculares específicas. La naturaleza confocal del SRS, derivada de su dependencia cuadrática de la intensidad de los láseres, asegura que las señales se limiten al plano focal, excluyendo las contribuciones desenfocadas y proporcionando información química altamente localizada 5,6. Estas imágenes con resolución profunda preservan la integridad del tejido al eliminar el corte mecánico, reducir el tiempo de procesamiento y mantener el contexto biológico y molecular de la muestra.

Sobre la base de los principios de la SRS, la histología Raman estimulada (SRH) utiliza estos datos vibracionales moleculares para crear imágenes pseudo-H&E de tejido fresco y sin teñir en tiempo real, proporcionando así a los clínicos herramientas de diagnóstico más rápidas y eficientes 7,8. Esta capacidad de generar imágenes de alta calidad ha convertido a la SSR en una herramienta indispensable para la investigación y las posibles aplicaciones clínicas9. Recientemente, la evaluación del margen intraoperatorio mediante SSR proporcionó retroalimentación patológica casi en tiempo real durante la ablación parcial de la glándula y la prostatectomía radical, lo que permitió ajustes inmediatos del tratamiento10,11.

El generador de imágenes SRH aprovecha las vibraciones moleculares intrínsecas para proporcionar información sobre la composición de los tejidos. La SSR se puede utilizar para diferenciar eficazmente los tejidos cancerosos de los benignos de la próstata mediante el análisis de las propiedades vibratorias de CH2 y CH3 7,12. El generador de imágenes SRH captura estas vibraciones y produce imágenes pseudo-H&E que mejoran el contraste nuclear, sirviendo como una alternativa rápida a la histopatología convencional y proporcionando imágenes de alta calidad en 2-8 min, dependiendo del tamaño del tejido 7,8.

Se evaluó la efectividad de la SSR para el examen anatomopatológico rápido de biopsias de próstata no procesadas. Los patólogos fueron entrenados para interpretar las imágenes de SSR de los núcleos de biopsia de próstata obtenidos ex vivo a partir de muestras de prostatectomía8. El método de escaneo SRH se optimizó para permitir la adquisición de imágenes de alta resolución en cuestión de minutos, reduciendo significativamente el tiempo requerido en comparación con la histopatología tradicional. Las muestras de biopsia que contenían una mezcla de histología benigna y maligna sirvieron como conjunto de entrenamiento para los patólogos, quienes luego realizaron una evaluación ciega de un conjunto separado de biopsias obtenidas por SRH y procesadas por tinción de H&E para que sirvieran como verdad fundamental. Los resultados mostraron que la precisión media del patólogo para la identificación del cáncer de próstata fue del 95,7%, con buena concordancia en la detección de cánceres clínicamente significativos, lo que indica que la SSR puede apoyar eficazmente el diagnóstico casi en tiempo real8.

En estudios posteriores, se integró la inteligencia artificial (IA) para mejorar aún más la precisión del diagnóstico, la eficiencia y la facilidad de implementación. Este modelo de IA emplea técnicas de aprendizaje profundo para analizar las características vibratorias y morfológicas capturadas por la SSR, lo que permite la clasificación automatizada de muestras de biopsia de próstata en regiones benignas, cancerosas y no diagnósticas, lo que agiliza significativamente el proceso de evaluación patológica9. La integración de SRH-IA demostró una precisión impresionante, logrando un 96,5% en la detección del cáncer de próstata, con tasas de sensibilidad y especificidad del 96,3% y el 96,6%, respectivamente9. Al integrar la IA con la SSR, se logró un rendimiento diagnóstico igual al de los patólogos experimentados.

A través de la evaluación exhaustiva de la SSR con patólogos y el desarrollo de un modelo de IA integrado en el generador de imágenes de SSR, las capacidades de esta tecnología han avanzado significativamente. Este protocolo describe los pasos detallados para preparar muestras de biopsia de próstata, obtener imágenes con el generador de imágenes SRH y analizar los datos con herramientas asistidas por IA. Al seguir estos pasos, los investigadores y los médicos pueden aprovechar esta nueva técnica para mejorar la detección, la investigación y el tratamiento del cáncer de próstata.

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Protocolo

Este protocolo implica el uso de especímenes humanos y se adhiere a las pautas de cuidado humano de la Universidad de Columbia Británica. La investigación ha sido aprobada por la Junta de Revisión Institucional (IRB, por sus siglas en inglés) bajo los siguientes números de aprobación ética: SRH: H23-00459, AI: H24-00585 y Biobank: H21-03722. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los sujetos humanos antes de la recolección de los especímenes. Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con los estándares éticos institucionales y regulatorios para garantizar la protección y confidencialidad de los participantes.

1. Encienda el generador de imágenes SRH

  1. Encienda el generador de imágenes SRH (Figura 1A). Deje que el sistema se caliente durante 30 minutos para garantizar que el láser alcance la temperatura óptima de funcionamiento para obtener imágenes precisas.

2. Preparar la cámara de fluido

  1. Conecte una jeringa de 50 mL llena de agua esterilizada a la válvula de jeringa en el lado izquierdo de la interfaz del generador de imágenes SRH (Figura 1B). Asegúrese de que la jeringa esté bien ajustada para mantener una circulación adecuada del fluido.

3. Inicie sesión en el sistema

  1. Una vez que se cargue el sistema, use el monitor de pantalla táctil para ingresar el nombre de usuario y la contraseña.
  2. Seleccione el nombre de usuario adecuado y escriba la contraseña. Pulsa Iniciar sesión.
  3. Acepte el Descargo de responsabilidad para reconocer que el estudio es para fines de investigación si se utiliza fuera de los Estados Unidos o la Unión Europea.

4. Crea un nuevo estudio

  1. Seleccione Crear nuevo estudio en las opciones de visualización: Crear nuevo estudio, Continuar estudio existente y Ver estudio existente.

5. Ingrese la información del caso

  1. Ingrese información relevante del caso , incluido el apellido, el nombre, el número de registro médico, la fecha de nacimiento, el número de acceso, la identificación del ensayo, el nombre del médico, el número de habitación, la ubicación anatómica primaria y el módulo de análisis.
  2. Guarde las muestras como John Doe (por ejemplo).
  3. En Ubicación anatómica primaria, seleccione Próstata (solo para uso en investigación).
  4. En Modo de análisis, elija Cáncer de próstata (solo para uso en investigación) para utilizar la IA integrada para la detección del cáncer de próstata.

6. Finalice la creación del estudio y llene la cámara de fluido

  1. Toque Crear estudio después de ingresar la información del caso.
  2. Cuando el sistema se lo solicite, toque Confirmar para confirmar que los datos se utilizarán únicamente con fines de investigación.
  3. Llene la cámara de fluido con agua esterilizada según las instrucciones.
  4. Pulsa Siguiente cuando se te solicite y, a continuación, selecciona Adquirir en las opciones que se muestran.
  5. Toque Cargar nuevo espécimen y el sistema mostrará Preparar espécimen y cargar diapositiva NIO.

7. Preparación de la muestra y el portaobjetos

  1. Recupere el portaobjetos de la biopsia de próstata. Use pinzas de tejido con dientes para abrir cuidadosamente el cubreobjetos adjunto. Mientras sostiene el portaobjetos y el cubreobjetos abiertos, use las pinzas de tejido para colocar la biopsia de próstata del medio RPMI de forma segura en la ranura del portaobjetos. Cierre suavemente el cubreobjetos y asegure la muestra.
  2. Abra el portaobjetos en la interfaz del generador de imágenes SRH e inserte el portaobjetos preparado en el soporte de portaobjetos, asegurándose de una alineación adecuada. Cierre la tapa del generador de imágenes SRH. Cuando el sistema detecte la tapa cerrada, toque Siguiente para continuar.

8. Establecer los parámetros de adquisición de imágenes

  1. Establezca los siguientes parámetros de imagen:
    1. Para el nombre del espécimen: Seleccione Biopsia 1 A para la primera biopsia.
    2. Para el área de exploración: seleccione 0,4 mm x 6,1 mm, 3 regiones (solo para uso en investigación) para escanear toda la biopsia.
    3. Para la posición de escaneo: use la imagen en pantalla para ajustar manualmente la ubicación de escaneo.
  2. Toque Adquirir imagen para continuar.
  3. Revise los detalles de la muestra que se muestran en la pantalla y confirme seleccionando Continuar.

9. Adquirir la imagen SRH

  1. Permita que el generador de imágenes SRH se enfoque automáticamente y adquiera imágenes que generen la imagen SRH final.
  2. Deje que el generador de imágenes escanee la biopsia en tres secciones (exploración 1, exploración 2 y exploración 3) como se muestra en la figura 2A.
  3. Deje que el generador de imágenes combine las secciones para formar una imagen SRH completa (Figura 2B), produciendo una imagen pseudo-H&E para su evaluación.

10. Visualización de la imagen SRH

  1. Vea la imagen de SSR de la biopsia de próstata fresca y sin teñir. La imagen imita la tinción de H&E utilizando un esquema de color rosa/púrpura que resalta las vibraciones moleculares de CH2 (asociadas con lípidos) y las vibraciones moleculares de CH3 (relacionadas con proteínas y ADN).

11. Interpretación de IA de la imagen de SSR solo para uso en investigación

  1. Aplique la superposición de IA haciendo clic en el icono (>>) en la pantalla. La superposición de IA identifica las regiones cancerosas en rojo, las regiones no cancerosas en verde y las regiones no diagnósticas en violeta (Figura 3A).
  2. Revise el gráfico de barras que cuantifica el porcentaje de tejido canceroso, tejido no canceroso y tejido no diagnóstico (Figura 3B).
  3. Vuelva a la imagen SRH original sin la superposición de IA haciendo clic en el icono (<<).

12. Zoom y navegación de la imagen SRH

  1. Utilice las funciones de acercar y alejar de la pantalla táctil para explorar en detalle las diferentes regiones de la biopsia.
  2. Utilice los iconos de navegación para desplazarse por la imagen y realizar un examen exhaustivo de la muestra de biopsia.

13. Aislamiento de tejido seleccionado

  1. Después de la exploración inicial, retire con cuidado la biopsia del portaobjetos. Use pinzas de tejido con dientes para levantar el cubreobjetos adjunto y liberar suavemente la biopsia.
  2. Coloque la biopsia en un Telfa humedecido empapado en solución salina para mantener la integridad del tejido durante el proceso de recorte.
  3. Utilice una cuchilla quirúrgica para recortar las áreas no cancerosas identificadas en la superposición generada por IA de la imagen de SSR mediante la evaluación visual de la superposición para determinar las regiones óptimas para la extirpación. Concéntrese en extirpar las áreas que normalmente se encuentran en los extremos de la biopsia para aumentar la proporción de cáncer a tejido. Asegúrese de que quede suficiente tejido para volver a escanear.

14. Vuelva a escanear la biopsia

  1. Vuelva a escanear la biopsia siguiendo el mismo procedimiento descrito en los pasos 9 a 11.
  2. Ajuste el área y la posición de la exploración para confirmar un aumento en la proporción de cáncer a tejido (visto en la Figura 3C-E). Revise la imagen de SSR actualizada y la superposición de IA para verificar los porcentajes de regiones cancerosas y no cancerosas.
  3. Repita el recorte y vuelva a escanear hasta lograr la proporción deseada.

15. Biobancos y criopreservación

  1. Retire la biopsia del portaobjetos con pinzas de tejido con dientes . Coloque la biopsia en un tubo criogénico.
  2. Congele el tubo criogénico en nitrógeno líquido para garantizar una rápida conservación de la muestra.
  3. Transfiera el tubo criogénico en nitrógeno líquido a un congelador a -80 °C o a una instalación de almacenamiento de nitrógeno líquido para su conservación a largo plazo.

16. Exportar datos de imagen

  1. Toque el icono del avión de papel para exportar los datos de la imagen para almacenarlos y analizarlos más a fondo.
  2. Para seleccionar la ubicación de exportación, toque la opción Seleccionar ubicación de exportación y elija entre USB (no identificado), USB (completo) y iPhone (completo). Seleccione USB (Completo) y elija un disco duro externo para la exportación de datos.
  3. Para seleccionar la serie de imágenes que desea exportar, seleccione Estudio completo para exportar todas las series de imágenes de SSR para el paciente en lugar de una serie específica.
  4. Espere a que el sistema muestre Exportación en curso y toque Confirmar una vez que se complete la exportación.

17. Apague el microscopio SRH

  1. Toque Salir y siga las instrucciones de apagado que se muestran en la pantalla.
  2. Seleccione Continuar sin cuando se le pida que archive los datos de la imagen (si ya se han exportado).
  3. Deseche la muestra de acuerdo con los protocolos de laboratorio apropiados.
  4. Toque Siguiente y vacíe la cámara de líquido con la jeringa adjunta, como se indica.
  5. Pulsa Siguiente cuando se te solicite y, a continuación, selecciona Sí en las opciones que se muestran.
  6. Retire y deseche la jeringa.
  7. Toque Apagar para apagar el microscopio SRH por completo.

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Resultados

La aplicación de la SSR integrada con la IA demostró la rápida detección y caracterización del cáncer de próstata dentro de muestras de biopsia en cuestión de minutos. La Figura 2A describe el procedimiento de exploración de varios pasos del generador de imágenes de SRH, donde se realizaron tres exploraciones distintas (exploración 1, exploración 2 y exploración 3) a través de la muestra de biopsia. Cada escaneo capturó firmas vibratorias moleculares únicas correspondientes al contenido de l...

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Discusión

El protocolo de SSR para la detección del cáncer de próstata representa un avance significativo en la imagen médica y la histopatología. La SSR permite obtener imágenes casi en tiempo real y sin etiquetas de tejido fresco y sin teñir, lo que permite la detección rápida del cáncer de tejidos no procesados sin los retrasos asociados con los métodos histopatológicos tradicionales 3,4,5,6,7,8,9.

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Divulgaciones

C. Freudiger es empleado, accionista y director de Invenio Imaging y posee patentes sobre microscopía espectroscópica Raman estimulada con licencia independiente. A. Ion-Margineanu es accionista de Invenio Imaging.

Agradecimientos

Agradecemos las contribuciones del equipo de investigación del Centro de Próstata de Vancouver y NYU Langone Health, y el apoyo técnico brindado por Invenio Imaging. Este trabajo fue financiado por el Centro de Innovación del Ministerio de Salud de Columbia Británica.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Contenedor de nitrógeno líquido de sobremesaThermo Scientific11-670-4B
CitotuboGreiner Bio-One126279
Pinzas finas Dumont #5Herramientas de ciencia fina11254-20
Portaobjetos de biopsia de próstata NIOInvenio Imaging, Inc.AT0013
Solución RPMIThermo Fisher Scientific11875093
Solución salinaBaxter
SRH Imager (Sistema de imágenes láser NIO)Invenio Imaging, Inc.
Cuchilla quirúrgicaFisher Scientific501094395

Referencias

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2020. CA Cancer J Clin. 70 (1), 7-30 (2020).
  2. Epstein, J. I., et al. The 2014 International Society of Urological Pathology (ISUP) Consensus Conference on Gleason Grading of Prostatic Carcinoma: Definition of grading patterns and proposal for a new grading system. Am J Surg Pathol. 40 (2), 244-252 (2016).
  3. Freudiger, C. W., et al. Stimulated Raman scattering microscopy with a robust fibre laser source. Nat Photonics. 8 (2), 153-159 (2014).
  4. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  5. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nat Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  6. Cheng, Q., Miao, Y., Wild, J., Min, W., Yang, Y. Emerging applications of stimulated Raman scattering microscopy in materials science. Matter. 4 (5), 1460-1483 (2021).
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  8. Mannas, M. P., et al. Stimulated Raman histology, a novel method to allow for rapid pathologic examination of unprocessed, fresh prostate biopsies. Prostate. 83 (11), 1060-1067 (2023).
  9. Mannas, M. P., et al. Stimulated Raman histology interpretation by artificial intelligence provides near-real-time pathologic feedback for unprocessed prostate biopsies. J Urol. 211 (3), 384-391 (2024).
  10. Mannas, M. P., et al. Intraoperative margin assessment with near real time pathology during partial gland ablation of prostate cancer: A feasibility study. Urol Oncol. 43 (1), 64.e19-64.e25 (2024).
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  12. Hollon, T., et al. Artificial-intelligence-based molecular classification of diffuse gliomas using rapid, label-free optical imaging. Nat Med. 29 (4), 828-832 (2023).
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  14. Sarri, B., et al. In vivo organoid growth monitoring by stimulated Raman histology. Npj Imaging. 2 (1), 18(2024).
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