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Artículo de método

Establecimiento de un modelo de ratón con psoriasis por Imiquimod

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DOI:

10.3791/68111

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20 de junio de 2025

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1College of Basic Medicine, Guangxi University of Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Characteristic Experimental Animal Models of Guangxi, 3Guangxi Key Laboratory of Translational Medicine for Treating High-Incidence Infectious Diseases with Integrative Medicine, 4College of Pharmacy, Guangxi University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un modelo de ratón de psoriasis altamente eficaz y estable establecido mediante la utilización de imiquimod. Además, detallamos las metodologías empleadas para evaluar la gravedad de la psoriasis.

Resumen

La psoriasis es una afección cutánea común, crónica, recurrente e inflamatoria caracterizada por engrosamiento de la piel, infiltración, escamas y eritema. La patogenia de la enfermedad es muy compleja e implica la interacción de varios factores como la genética, la inmunidad y los factores ambientales. Para investigar los mecanismos subyacentes a la psoriasis, los investigadores han desarrollado múltiples modelos animales de la enfermedad. Sin embargo, la variabilidad en las metodologías ha presentado desafíos para la construcción de estos modelos de manera consistente. En este estudio, establecimos y evaluamos exhaustivamente un modelo de ratón de psoriasis altamente eficiente y estable utilizando imiquimod (IMQ). Se utilizaron ratones hembra C57BL/6J de 8 semanas de edad para establecer el modelo de ratón con psoriasis. Después de una semana de aclimatación, se excluyeron los ratones con piel irritada o dañada en las áreas depiladas. A partir del segundo día, se aplicó diariamente una crema IMQ al 5% (62,5 mg/día) en las regiones depiladas del cuello y la espalda durante siete días consecutivos. Durante el experimento, se realizaron mediciones diarias del peso corporal, fotografías de la piel, puntuaciones de la piel y observaciones del comportamiento. Después del experimento, se realizó la determinación del índice de bazo, el análisis histológico de la piel, la detección de citocinas séricas y la detección del nivel de ARNm de la piel. Los resultados mostraron que los ratones del grupo IMQ desarrollaron síntomas típicos similares a los de la psoriasis, como eritema, escamas y engrosamiento de la piel, acompañados de un mayor comportamiento de rascado, pérdida de peso, aumento del índice del bazo y aumento del grosor de la piel. Y cambios significativos en los niveles de TNF-α, IL-23 e IL-17A en suero, así como en los niveles de ARNm de IL-23, IL-17A, IL-17F e IFN-γ en la piel. Los niveles séricos de citocinas (TNF-α, IL-23, IL-17A) y la expresión de marcadores proinflamatorios del ARNm de la piel (IL-23, IL-17A, IL-17F, IFN-γ) se regularon notablemente al alza. Por el contrario, el grupo control no mostró tales alteraciones. Al optimizar la duración de la inducción de IMQ y estandarizar el protocolo de administración, al tiempo que se monitorean dinámicamente los cambios en la piel, este estudio tiene como objetivo proporcionar un marco estandarizado para que los investigadores construyan modelos confiables de psoriasis.

Introducción

La psoriasis es una enfermedad sistémica cutánea frecuente, crónica, recurrente e inflamatoria, siendo la psoriasis en placas la manifestación clínica más predominante1. Sus características clínicas suelen incluir infiltración cutánea, grosor, escamas y eritema2, y también puede desencadenar diversas complicaciones, como artritis psoriásica, depresión, síndrome metabólico y enfermedades cardiovasculares1. Además, la psoriasis suele ir acompañada de prurito crónico3. A nivel mundial, la psoriasis afecta a entre el 2% y el 3% de la población4, y su incidencia va en aumento. Por lo tanto, el establecimiento de modelos animales fiables que imiten de cerca las características patológicas de la psoriasis humana es crucial para descubrir su patogénesis y desarrollar nuevas estrategias terapéuticas.

En el campo de la investigación dermatológica, la psoriasis ha atraído una atención significativa debido a su compleja patogenia, que involucra la interacción de factores genéticos, inmunológicos y ambientales, lo que presenta desafíos considerables para un estudio en profundidad1. Las investigaciones actuales indican que la aparición de la psoriasis está mediada principalmente por las células T, que, al activarse, estimulan la sobreproliferación de los queratinocitos y alteran la secreción de citocinas durante su proceso de diferenciación5. En este proceso, el eje interleucina (IL)-23/IL-17 desempeña un papel fundamental. La IL-23 promueve la diferenciación y activación de las células Th17, que producen citocinas como la IL-17A y la IL-17F, que desempeñan un papel importante en el desarrollo de la psoriasis 6,7,8. En la actualidad, la patogenia de la psoriasis engloba numerosas alteraciones moleculares. Estos involucran citocinas como el factor de necrosis tumoral-α (TNF-α), el eje IL-23/IL-17, IL-37, vías de señalización intracelular como el factor nuclear-κB (NF-κB) y la transducción de señales de quinasa Janus y el activador transcripcional (JAK-STAT). Además, está estrechamente asociado con moléculas relacionadas con el azúcar, el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA), aminoácidos, vías de metabolismo de los lípidos, así como factores reguladores epigenéticos, incluida la metilación del ADN y la modificación de histonas. Estos objetivos están intrincadamente entrelazados e interactúan entre sí, impulsando conjuntamente la aparición y la progresión de la psoriasis9.

En la investigación actual sobre la psoriasis, se emplean una variedad de modelos animales, incluyendo modelos espontáneos, modelos de trasplante alogénico, modelos transgénicos o de knockout génico y modelos inducidos químicamente, entre otros10. Estos modelos animales juegan un papel esencial en el estudio de la psoriasis, ya que los científicos han utilizado múltiples especies como ratones, conejillos de indias y peces cebra para construir modelos de psoriasis 11,12,13. Sin embargo, todos estos modelos tienen ciertas limitaciones, como la complejidad genética, las diferencias entre especies, las preocupaciones éticas y las consideraciones de costo14.

El imiquimod (IMQ), como agonista de los receptores tipo Toll (TLR), puede desencadenar inflamación de la piel e infiltración de células inmunitarias, al tiempo que promueve la proliferación de queratinocitos y el aumento de los vasos sanguíneos dérmicos13. Un estudio ha reportado que la aplicación tópica de IMQ en humanos puede inducir psoriasis15. Las observaciones clínicas también han revelado que la IMQ exacerba los síntomas de la psoriasis en los pacientes7. En modelos de psoriasis en ratones, la administración continua de una concentración del 5% de IMQ puede reproducir las manifestaciones cutáneas de la psoriasis humana, como eritema y escamas. Además, otros síntomas se asemejan mucho a los de la psoriasis en placas humana, incluidos los cambios epidérmicos como la acantosis y la paraqueratosis, la neoangiogénesis, etc. Los modelos de ratón de psoriasis inducida por IMQ también son capaces de simular el prurito crónico4. También hay una infiltración de células inflamatorias constituidas por linfocitos T, neutrófilos y células dendríticas en modelos de ratón con psoriasis 2,16. Las lesiones cutáneas inducidas por IMQ se basan principalmente en el eje TNF-α-IL-23/IL-17, lo que indica que los modelos de ratón de psoriasis basados en IMQ pueden utilizarse para investigar más a fondo la psoriasis humana9.

El modelo de ratón de psoriasis inducida por IMQ empleado en este estudio es adecuado para cepas de ratón como C57BL/6 y BALB/c, que tienen tendencias Th1 y Th2, respectivamente7. Este modelo es estable y altamente eficiente, con las ventajas de bajo costo, corta duración experimental, operación simple, síntomas distintos y una alta tasa de éxito. En el experimento, proporcionamos una descripción detallada de varios métodos empleados para monitorear la progresión de la psoriasis. Estos métodos abarcaron la puntuación de la piel y las pruebas de comportamiento. Además, validamos aún más los hallazgos experimentales mediante la utilización de análisis histopatológicos, ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR). Este modelo no solo es adecuado para explorar la patogénesis de la psoriasis, sino también para la evaluación preclínica de nuevos enfoques terapéuticos, lo que lo convierte en una herramienta valiosa en la investigación.

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Protocolo

El protocolo de uso de animales que se enumera a continuación ha sido revisado y aprobado por el Comité Institucional de Ética y Bienestar Institucional de la Universidad de Medicina China de Guangxi (DW20191220-153). El certificado de animal de los ratones comprados fue SCXK (Xiang) 2024-0009. En este estudio, ratones hembra C57BL/6J de 8 semanas de edad, grado SPF, se dividieron aleatoriamente en grupos, cada grupo contenía 6 ratones. La jaula se coloca en una habitación con temperatura controlada (23 ± 2 °C, ciclo de luz/oscuridad de 12 h) con libre acceso a alimentos y agua. El diagrama de flujo del experimento se muestra en la Figura 1. A excepción de no ser inducidos con la crema IMQ, los ratones del grupo de control recibieron los mismos tratamientos que los del grupo IMQ en todos los demás aspectos.

1. Preparación animal

  1. Comienza a modelar después de adaptar al animal al entorno durante una semana. Antes de comenzar el experimento, desinfecte meticulosamente la mesa experimental con una solución de etanol al 75%.
  2. Con un rotulador, marque claramente las colas de los ratones, asegurando su identificación individual.
  3. Utilice la afeitadora para afeitar el pelo del cuello y la espalda de todos los ratones en un área de unos 4 cm x 3 cm (día 0; Figura 2A). Utilice un bastoncillo de algodón para aplicar una cantidad adecuada de crema depilatoria sobre la piel afeitada y extiéndala uniformemente (Figura 2B).
  4. Después de aplicar la crema depilatoria, espere unos 15 s. Deje la crema depilatoria en la superficie de la piel del ratón durante unos 15-20 segundos óptimos. Limpie suave y rápidamente.
  5. Use un hisopo de algodón nuevo para remojarlo en agua y limpie repetidamente en la dirección desde la cola del ratón hasta la cabeza para limpiar el cabello. Seque suavemente la piel local con papel absorbente médico.
  6. Examine el estado de la piel de los ratones 24 horas después de la depilación y excluya a aquellos con áreas de depilación dañadas.

2. Modelo de ratón de psoriasis inducida por IMQ

  1. Asegúrese de que los daños leves en la piel causados por el afeitado o la depilación se recuperen por completo.
  2. A partir del2º día, aplicar la crema IMQ al 5% a una dosis de 62,5 mg7. Para ello, llene previamente toda la jeringa de 1 ml con crema IMQ y administre el fármaco al ratón según el volumen correspondiente a 62,5 mg de IMQ al día sobre la piel depilada del ratón con una cuchara de mango plano (Figura 2C). Durante la aplicación, asegúrese de que la crema IMQ se distribuya lo más uniformemente posible sobre el área depilada y que el área de aplicación sea más pequeña que el área depilada.
  3. Después de untar el medicamento, coloque al ratón en una jaula vacía y espere 15 minutos. Vuelva a colocar al ratón en la jaula de alimentación después de que el medicamento se haya absorbido por completo. Realizar la aplicación del fármaco de forma continuada durante 7 días.

3. Análisis del peso corporal de ratones con psoriasis

  1. Coloque un vaso de precipitados limpio sobre una balanza electrónica y tara. A continuación, coloque suavemente el ratón en el interior y observe las lecturas estables que se muestran en la balanza.
  2. A partir del día 1 (el día anterior a la aplicación inicial de IMQ), pesar los ratones diariamente hasta el día 8. Compara el peso de cada ratón con su peso correspondiente el día 1.

4. Caracterización cutánea de ratones con psoriasis

  1. Coloca los ratones sobre un fondo blanco con una regla. Mantenga los cuerpos de los ratones rectos sin encoger la cabeza ni hacer grandes balanceos (Figura 3).
  2. A partir del día 1, tome una fotografía de alta resolución del sitio de administración de los ratones bajo la misma intensidad de iluminación todos los días y registre la caracterización de la piel de los ratones.
  3. Durante cada sesión de fotografía, mantenga constante la distancia entre la cámara y los ratones, así como el aumento de la cámara, y coloque la regla perpendicular a la cámara.

5. Puntuación de la piel

  1. Puntúe la gravedad de la dermatitis por psoriasis en ratones utilizando el Índice de Área y Gravedad de la Psoriasis (PASI) modificado17 todos los días desde el día 1 hasta el día 8. Emplee a tres investigadores que utilicen un método doble ciego para puntuar de forma independiente el eritema, las escamas y el grosor de la piel en una escala de 0 a 4, tomando la media aritmética de los tres. Para conocer las reglas de puntuación PASI, consulte la Tabla 1.
    Puntuación PASI = eritema + escama + grosor

6. Observación del comportamiento de ratones

  1. En el mismo ambiente tranquilo y normalmente iluminado a temperatura ambiente (como en el paso 4), coloque cada ratón en una caja acrílica individual (10 cm x 10 cm) con una pequeña cantidad de relleno de mazorca de maíz en la parte inferior.
  2. Use particiones negras para separar cada caja y bloquear la línea de visión. Después de un periodo de adaptación de 15 minutos, graba en vídeo el comportamiento de los animales durante 1 h.
  3. Grabe videos de comportamiento a una hora fija cada día desde el día 1 hasta el día 8. Coloque la lente de la cámara perpendicular a la caja acrílica y asegúrese de que capture completamente las actividades del mouse en el interior.
  4. Registre los casos en los que el ratón levanta su pata trasera para rascarse el cuello y la espalda y luego la baja como un comportamiento de picazón.

7. Recolección de la sangre y medición de los niveles de citocinas en el suero mediante ELISA

  1. Retire los globos oculares de los ratones rápidamente con pinzas y recoja la sangre el día 9.
  2. Deje reposar la sangre a 4 °C durante 4 h. Separe la sangre utilizando una centrífuga de baja temperatura a 3000 x g durante 30 min a 4 °C. Recoja el suero y guárdelo a -80 °C para usarlo en el futuro.
  3. Cuantifique los niveles séricos de TNF-α, IL-17A e IL-23 utilizando el kit ELISA correspondiente de acuerdo con el protocolo del fabricante18.

8. Toma de muestras de la piel y el bazo

  1. De acuerdo con las regulaciones del comité de ética de experimentos con animales relevante, disloque las vértebras cervicales de los ratones para la eutanasia después de la recolección de sangre en el día 9.
  2. Después de la eutanasia, corte las lesiones cutáneas en la espalda de los ratones en dos porciones. Sumerja una porción en un tubo de centrífuga de 5 ml con una solución de paraformaldehído al 4% para su fijación y conservación. Separe y empaque la otra porción de los tejidos de la piel y guárdelos a -80 °C para su uso futuro.
  3. Use tijeras esterilizadas para abrir la piel a lo largo de la línea media del abdomen del ratón, exponer la cavidad abdominal y encontrar y extirpar completamente el bazo. Lave las muestras con solución salina normal estéril, luego colóquelas en solución salina normal, péselas y registre los datos.

9. Análisis histológico de secciones de piel

  1. Retire el tejido cutáneo del paraformaldehído y colóquelo en la caja de inclusión.
  2. Realice los siguientes pasos en la piel: Use alcohol de gradiente de 75% a 100% (de baja a alta concentración), con tres tanques de alcohol 100%. Déjalo en cada tanque durante 30 min a temperatura ambiente. Utilice dos tanques de xileno. Déjalo en cada tanque durante 30 min a temperatura ambiente. Utilice tres tanques de cera de parafina con un punto de fusión de 56-58 °C. Déjalo en cada tanque durante 1 h a temperatura ambiente.
  3. Incruste el tejido cutáneo tratado: Coloque el tejido cutáneo impregnado de cera en posición vertical en un molde de parafina. Vierta la parafina derretida en el molde cuando la temperatura de la parafina de inclusión sea 5-7 °C más alta que el punto de fusión de la parafina. Muévalo rápidamente a la mesa de congelación para enfriar y solidificar el bloque de cera rápidamente.
  4. Congele el bloque de cera a 0 °C, sáquelo de la caja de inclusión, fíjelo en la mesa de sujeción de la cortadora y córtelo hasta que tenga un grosor de 3 μm.
  5. Utilice unas pinzas para recoger las rodajas y escaldarlas en agua tibia a 45 °C. Coloque la sección en el centro de la parte lisa del portaobjetos y marque el número patológico en el área esmerilada con un lápiz. Incline el portaobjetos a 45° por un momento para permitir que la humedad fluya, luego colóquelo en un horno a 62 °C y hornee por 30 min.
  6. Tinción HE: Coloque las rodajas en xileno durante 5 minutos, luego en otro tanque de xileno durante 5 minutos, en etanol anhidro durante 1 minuto, en etanol al 95% durante 1 minuto, en etanol al 85% durante 1 minuto y en etanol al 75% durante 1 minuto. Enjuague con agua del grifo durante 1 minuto, manche con solución de hematoxilina durante 5 minutos y lave la solución de hematoxilina con agua corriente durante 1 minuto.
  7. Remojar en etanol de ácido clorhídrico al 1% durante 3 s, lavar con agua durante 20 s, usar agua tibia para el retorno azul durante 5 min, enjuagar con agua corriente durante 2 min, teñir con eosina al 0,5% durante 1 min, remojar en etanol al 95% durante 2 s, luego en etanol al 95% durante 2 min, en etanol anhidro durante 4 min, en otro tanque de etanol anhidro durante 4 min, en xileno durante 4 min, en otro tanque de xileno durante 4 min, y en el último tanque de xileno durante 4 min. Después de secar al aire, séllelo con goma neutra.
  8. Observe las secciones bajo un microscopio y tome fotografías al azar en tres posiciones con un aumento de 400. Para cada imagen, mida aleatoriamente el grosor epidérmico en cinco ubicaciones utilizando el software Image J. Registre y analice los datos.

10. Medición de los niveles de ARNm de IL-17A, IL-17F, IL-23 e IFN-γ en la piel mediante RT-qPCR

  1. Tome el tejido cutáneo almacenado en un refrigerador a -80 °C, con un peso aproximado de 100 mg, y extraiga el ARN por el método Trizol.
  2. Transcribir inversamente a ADNc de acuerdo con el kit de transcripción inversa (VAZYME, China).
  3. Configure el sistema de reacción de PCR de acuerdo con el manual y realice PCR en tiempo real utilizando un instrumento de PCR cuantitativa de fluorescencia según el procedimiento de reacción especificado (Tabla 2) y la secuencia de cebadores (Tabla 3).
  4. Recopile datos de PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real, calcule y analice los resultados utilizando el algoritmo qPCR (método 2-ΔΔCt).

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Resultados

Después de la administración continua de IMQ, los ratones del grupo IMQ mostraron síntomas clínicos en la piel de la espalda que recordaban a la psoriasis (Figura 4), y el área inducida por IMQ presentó los síntomas típicos de eritema, escamas y grosor (Figura 5). Por el contrario, el grupo control no presentó ningún síntoma similar a los del grupo IMQ. En comparación con el grupo control, el eritema y las escalas menores comenzaron a surgir en el grupo IMQ a pa...

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Discusión

Nuestra investigación utiliza IMQ para inducir lesiones cutáneas similares a la psoriasis, construyendo así un modelo de psoriasis. Este modelo se puede utilizar para estudiar los mecanismos subyacentes al desarrollo de la psoriasis y para proporcionar información para el desarrollo de tratamientos para la afección. En el estudio de van der Fits7, cuando se administró inicialmente la inducción de IMQ, el tiempo de inducción se estableció en 5 o 6 días. Sin embargo...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias Naturales de China (NSFC) a Guanyi Wu (82060768), la Fundación de Ciencias Naturales de la Región Autónoma Zhuang de Guangxi a la Región Autónoma de Guanyi Wu (2020GXNSFAA297244); Proyecto de financiación de talentos de primer nivel de medicina tradicional china de Guipai de la Universidad de Medicina China de Guangxi; el segundo lote del proyecto de cultivo del equipo de talento de alto nivel "Proyecto Qihuang" de la Universidad de Medicina Tradicional China de Guangxi (2024002).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
5% Imiquimod CremaSichuan Medshine Pharmaceutical Co.
75% EtanolXUE HUAN20240401
Balanza AnalíticaSartoriusSQP
Crema DepilatoriaReckitt Benckiser20240612 08X
Báscula ElectrónicaYingheng Technology7915
Papel Tissue MédicoJD20221208
AfeitadoraHORD shenjianAUX-C6S
Hisopo de algodón esterilizado20230728río Beilun
40220602

Referencias

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