Artículo de método

Efectos neuroprotectores del análogo de octadecaneuropeptide administrado por vía intranasal en un modelo de ratón de enfermedad de Parkinson inducida por MPTP

DOI:

10.3791/68122

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29 de agosto de 2025

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1Faculty of Sciences of Tunis, LR18ES03, Laboratory of Neurophysiology Cellular Physiopathology and Biomolecule Valorization, University Tunis El Manar, 2Inserm U1239 NorDiC, Laboratory of Neuroendocrine, Endocrine and Germinal Differentiation and Communication, PRIMACEN, Univ Rouen Normandie, 3Confocal Microscopy Unit, Faculty of Medicine of Tunis, University Tunis El Manar

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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La administración intranasal permite la administración directa de moléculas bioactivas al cerebro, proporcionando una alternativa no invasiva al método intracerebroventricular. Este estudio demuestra que la administración intranasal de ciclo(1-8)OP, un análogo de ODN, ejerce fuertes efectos neuroprotectores contra el daño oxidativo inducido por MPTP y la apoptosis en el cuerpo estriado en un modelo de ratón de la enfermedad de Parkinson, destacando el potencial terapéutico.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La enfermedad de Parkinson (EP) es un trastorno neurodegenerativo para el cual las terapias existentes son principalmente paliativas y carecen de eficacia curativa. El octadecaneuropeptide (ODN) es un péptido producido exclusivamente por astrocitos que protege a las neuronas contra el daño celular oxidativo y la apoptosis en modelos in vitro e in vivo de EP. Sin embargo, la ODN no puede cruzar la barrera hematoencefálica (BBB) y requiere inyección intracerebroventricular para llegar al cerebro, lo que presenta un desafío significativo para la aplicación terapéutica. Este estudio investiga la eficacia neuroprotectora del ciclo(1-8)OP, un análogo de la ODN, administrado por vía intranasal (IN) para evitar la BHE en un modelo in vivo de EP. Para los experimentos se utilizaron ratones machos C57BL/6J y se dividieron en cuatro grupos: simulado, MPTP- (20 mg/kg de peso corporal, intraperitoneal), ciclo(1-8)OP- (10 ng/10 μL, IN) y MPTP + animales tratados con ciclo(1-8)OP. En el día 0 (D0), los animales recibieron tres inyecciones intraperitoneales de 100 μL de solución MPTP a intervalos de 2 h (ratones tratados con MPTP y MPTP + ciclo(1-8)OP) o solución salina (ratones simulados y tratados con ciclo(1-8)OP). Una hora después de la inyección final, se administraron 10 μL de instilación de IN de ciclo(1-8)OP (ratones tratados con ciclo(1-8)OP- y MPTP + ciclo(1-8)OP) o solución salina de IN (ratones simulados y tratados con MPTP). En D7, se realizó una prueba de cilindro para evaluar la función motora. Posteriormente, se sacrificaron animales y se extirpó el cuerpo estriado y se analizó mediante RT-qPCR para evaluar la expresión del gen de la caspasa-3. Las muestras de tejido también se utilizaron para medir las actividades de las enzimas antioxidantes, las especies reactivas de oxígeno (ROS), el malondialdehído (MDA) y la abundancia de proteínas carboniladas. Una dosis única de IN de 10 ng ciclo(1-8)OP, administrada 1 h después de la dosis final de MPTP, previno la neurotoxicidad en el cuerpo estriado 7 días después del tratamiento. La neuroprotección mediada por ciclo(1-8)OP se asoció con una fuerte inhibición de la expresión de caspasa-3 inducida por MPTP en el cuerpo estriado. Además, el ciclo(1-8)OP restauró las actividades de las enzimas antioxidantes, evitando la acumulación de ROS, productos de peroxidación lipídica y carbonilación de proteínas en el cuerpo estriado.

Introducción

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La enfermedad de Parkinson (EP) es un trastorno neurodegenerativo marcado por la pérdida progresiva de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra, que inerva el cuerpo estriado. Esta pérdida da como resultado síntomas neurológicos significativos, incluidos déficits motores severos como rigidez muscular, acinesia y bradicinesia. La prevalencia de enfermedades neurodegenerativas como la EP continúa aumentando, principalmente debido al envejecimiento de la población, lo que representa un desafío sustancial para la salud pública2. Los tratamientos actuales para la EP se basan predominantemente en análogos dopaminérgicos y estimulación intracerebral de alta frecuencia 3,4. Sin embargo, estas terapias carecen de efectos neuroprotectores y no logran detener la progresión de la enfermedad, lo que subraya la necesidad urgente de estrategias innovadoras para prevenir la pérdida neuronal, promover la regeneración y mitigar el avance de la enfermedad5.

El octadecaneuropeptide (ODN) es un péptido derivado del procesamiento proteolítico del precursor de 86 aminoácidos inhibidor de la unión al diazepam (DBI)6, expresado principalmente por células astrogliales en el sistema nervioso central de mamíferos. La conservación evolutiva de la estructura primaria de ODN sugiere sus importantes funciones biológicas. Se ha demostrado que la ODN regula funciones clave como la ingesta de alimentos, el sueño, la agresión y los comportamientos relacionados con la ansiedad7. Más allá de su papel regulador, una amplia investigación ha demostrado las propiedades neuroprotectoras de la ODN en diversos trastornos neurológicos asociados con la degeneración neuronal. Por ejemplo, ODN protege las neuronas dopaminérgicas en un modelo de PD8 y reduce el tamaño del infarto al tiempo que mejora la recuperación funcional después de un accidente cerebrovascular en roedores9. Una de las características clave de ODN es su capacidad para contrarrestar muchos procesos deletéreos activados durante el daño cerebral a través de sus actividades antiapoptóticas, antiinflamatorias, antioxidantes e inmunomoduladoras 10,11,12. Además, la ODN puede actuar más allá de la fase aguda del accidente cerebrovascular al promover la neurogénesis y la plasticidad neuronal9. Para posibles aplicaciones clínicas de péptidos o sus análogos como agentes terapéuticos, elegir una vía de administración óptima es crucial para evitar la rápida degradación en el torrente sanguíneo y minimizar el efecto de primer paso. Entre varias estrategias de administración, la administración intranasal (IN) ha surgido como una alternativa no invasiva prometedora, que permite la administración directa de ciertas moléculas bioactivas al cerebro mientras se evita la barrera hematoencefálica (BBB)13,14,15. Esta ruta elimina la necesidad de inyecciones estereotáxicas invasivas y mejora la biodistribución cerebral en comparación con los órganos periféricos. Por ejemplo, el polipéptido activador de la adenilato ciclasa hipofisaria (PACAP) ha demostrado una mayor eficacia en la captación cerebral y la neuroprotección cuando se administra mediante instilación de IN en comparación con la inyección intravenosa, lo que reduce significativamente el volumen del infarto y mejora la recuperación funcional en modelos de accidente cerebrovascular9.

Aunque la administración de IN es una técnica mínimamente invasiva y eficiente para administrar agentes terapéuticos directamente al cerebro sin pasar por la BBB, su eficacia sigue dependiendo de varios parámetros prácticos, incluida la dosis y el volumen total administrado. En roedores, el volumen recomendado suele oscilar entre 10 y 25 μL por fosa nasal para evitar la aspiración o el desbordamiento en el tracto gastrointestinal16,17. La eficiencia de la captación nasal también se ve afectada por el tamaño del animal, el área de superficie de la cavidad nasal, el aclaramiento mucociliar y las propiedades compuestas como la lipofilia y el peso molecular18,19. Estas restricciones deben tenerse en cuenta durante el diseño del protocolo para garantizar la reproducibilidad y la relevancia traslacional en los modelos preclínicos.

Un estudio in vivo ha demostrado que la inyección intracerebroventricular (ICV) de dosis bajas de ODN confirió efectos neuroprotectores significativos, particularmente al prevenir la degeneración de las neuronas dopaminérgicas en ratones tratados con MPTP8. El presente estudio tiene como objetivo evaluar la viabilidad y eficacia de la administración de IN del análogo de ODN, ciclo(1-8)OP, como una alternativa no invasiva a la inyección de ICV para administrar un análogo peptídico neuroprotector al cerebro, específicamente para determinar si esta ruta puede prevenir la pérdida neuronal dopaminérgica y mejorar los resultados motores en ratones tratados con MPTP, un modelo bien establecido de EP.

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Protocolo

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Todos los experimentos siguieron las pautas de la Asociación Médica Veterinaria Estadounidense y fueron aprobados por el Comité de Ética Médica del Instituto Pasteur (número de aprobación: FST / LNFP / Pro 160220). Se obtuvieron ratones machos C57BL/6J de diez semanas de edad del Instituto Pasteur de Túnez. Los ratones se alojaron en tres por jaula en una habitación con temperatura controlada (21 °C ± 1 °C) con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h y se les proporcionó libre acceso a alimentos y agua durante 1 semana de aclimatación. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados se enumeran en la Tabla de materiales.

1. Procedimiento de tratamiento

  1. Divida a los animales en cuatro grupos: simulado (n = 9), MPTP- (n = 9), ciclo(1-8)OP- (n = 9) y MPTP + ciclo(1-8)OP-tratado (n = 9).
  2. Administrar tres inyecciones intraperitoneales (IP) de MPTP (20 mg/kg de peso corporal) en 100 μL de NaCl al 0,9% a intervalos de 2 h el primer día de tratamiento (D0). 1 h después de la última inyección de MPTP, administrar 10 μL por vía intranasal (IN) de ciclo(1-8)OP (10 ng) o solución salina.
  3. Inyecte a los animales de control solución salina en lugar de MPTP, con o sin ciclo(1-8)OP (Figura 1).
  4. En el séptimo día (D7), someta a los ratones a la prueba del cilindro. Luego, anestesiar profundamente a los ratones usando una inyección IP de pentobarbital y sacrificarlos (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente) para recolectar cerebros para PCR en tiempo real y análisis bioquímicos20 (Figura 2).

2. Procedimiento de inyección

  1. Inyección intraperitoneal
    1. Coloque el ratón con cuidado e inmovilice su cabeza durante el procedimiento.
    2. Oriente el ratón con la cabeza hacia abajo para permitir que los órganos se muevan naturalmente con la gravedad, minimizando cualquier contacto con la aguja.
    3. Inserte la aguja en un ángulo de 45 grados en la parte inferior del abdomen.
    4. Administre tres inyecciones de 100 μL en el mismo lado, con un intervalo de 2 h entre cada inyección, todas realizadas el mismo día.
    5. Inyecte solución salina al 0,9% para los grupos simulado y ciclo(1-8)OP, o solución MPTP (20 mg/kg de peso corporal) para los grupos MPTP y MPTP + ciclo(1-8)OP.
  2. Administración intranasal
    NOTA: La dosis seleccionada (10 ng) se basó en un estudio previo que demostró la eficacia neuroprotectora de la administración de ICV de ODN8. El volumen total de 10 μL y el tamaño de gota (5 μL por fosa nasal) se eligieron de acuerdo con los protocolos de administración de IN establecidos18,21. Este volumen está muy por debajo de la capacidad promedio de la cavidad nasal del ratón (0,032 cm3), minimizando así el riesgo de obstrucción o asfixia de las fosas nasales y asegurando una absorción nasal segura y eficiente22.
    1. Sujete firmemente el ratón por el cogote de su cuello, asegurándose de que su nariz esté orientada hacia arriba para facilitar una dosificación precisa y minimizar el movimiento de la cabeza.
    2. Invierta el animal de modo que su lado ventral mire hacia el techo, con el cuello paralelo al piso. Asegúrese de que la cabeza del ratón permanezca inmovilizada de forma segura, evitando movimientos verticales u horizontales.
    3. Alinee la punta de la pipeta con la fosa nasal del ratón y presione lentamente el émbolo para formar una pequeña gota.
    4. Coloque una gota de 5 μL (la mitad del volumen) cerca de cada una de las fosas nasales del ratón.
    5. Deje que el ratón inhale la solución de forma natural.
    6. Repita estos pasos para garantizar una dosificación constante, con 10 μL de ciclo(1-8)OP (10 ng) administrados para los grupos MPTP + ciclo(1-8)OP y ciclo(1-8)OP.
    7. Observe cuidadosamente la boca del ratón durante todo el procedimiento. La presencia de líquido en la boca puede indicar una absorción nasal incompleta. Esto podría deberse a un tamaño inadecuado de las gotas, una administración rápida o una inhalación insuficiente, lo que permite que la solución se acumule en la nasofaringe y posteriormente salga por la boca.
    8. Minimice este riesgo reduciendo el tamaño de las gotas si es necesario y asegurando el tiempo adecuado para la inhalación antes de administrar volúmenes adicionales.
    9. Evite administrar inmediatamente una dosis adicional para evitar un volumen excesivo.
    10. Documente cualquier dosis extraviada y anote cuidadosamente cualquier líquido expulsado.
    11. Asegúrese de que cada ratón inhale completamente ambas gotitas (una por fosa nasal) antes de continuar con la administración.
    12. Confirme la orientación precisa del bulbo olfatorio realizando una inyección IN de solución azul de metileno.
    13. Evalúe la precisión inspeccionando visualmente la deposición y propagación del color azul.

3. Prueba del cilindro

  1. Utilice un cilindro transparente, de 20 cm de altura y 15 cm de diámetro, colocado en el centro de la mesa.
  2. Coloque tres paneles de cartón negro alrededor del cilindro (a 4-8 cm de distancia) para minimizar los efectos de iluminación ambiental. Deje un lado del cilindro abierto para la grabación de video.
  3. Coloque la cámara a 40-60 cm del cilindro para capturar su vista completa.
  4. Coloque el mouse en el cilindro y comience a grabar inmediatamente durante 5 minutos.
  5. Después de que cada ratón complete la prueba, limpie el cilindro con agua, rocíe etanol al 70% para eliminar los olores y séquelo antes de probar el siguiente ratón.
  6. Reproduzca la grabación a media velocidad para permitir una observación detallada.
  7. Cuente cada instancia en la que el ratón levanta sus patas contra la pared del cilindro para evaluar el comportamiento exploratorio23.

4. Preparación de extractos de tejido cerebral para experimentos bioquímicos

  1. Anestesiar a los animales con pentobarbital (40 mg/kg, IP) y luego decapitarlos (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente).
  2. Diseccionar el cuerpo estriado y homogeneizar en 2 ml de TBS por gramo de tejido utilizando tampón de lisis (Triton X-100 al 1%, Tris-HCl 50 mM, EDTA 10 mM).
  3. La centrífuga homogeneiza a 14.000 × g durante 15 min a 4 °C.
  4. Mida la concentración de proteínas con el kit de determinación colorimétrica Biuret y almacene las alícuotas a -20 °C para su posterior análisis.

5. Medición de la formación de ROS intracelulares

  1. Incube el extracto de tejido cerebral con 10 μM de DCFH2-DA a 37 °C durante 30 min en la oscuridad.
  2. Retire el sobrenadante y lave dos veces con PBS (0,1 M, pH 7,4, 37 °C).
  3. Mida la fluorescencia utilizando un lector de microplacas a una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 538 nm.

6. Medición de marcadores de estrés oxidativo

  1. Malondialdehído
    1. Mezcle 20 μL de muestra (~50 μg de proteína) con 125 μL de TCA al 20% y 50 μL de TBA al 0,67%.
    2. Incubar a 95 °C durante 30 min, luego enfriar rápidamente a 4 °C.
    3. Añadir 800 μL de butanol, vórtice y centrifugar a 3000 × g durante 10 min a 4 °C.
    4. Mida la absorbancia a 532 nm y calcule los niveles de MDA utilizando el coeficiente de extinción (1,65 × 105 M-1 cm-1).
  2. Medición de carbonilo proteico
    1. Mezclar 200 μL de DNPH con 50 μL de muestra de proteína e incubar durante 1 h.
    2. Añadir 250 μL de TCA al 20% y enfriar durante 10 min con hielo.
    3. Centrifugar a 3000 × g durante 10 min a 4 °C y lavar el pellet con un 10% de TCA, luego con etanol:acetato de etilo (v/v).
    4. Vuelva a suspender el sedimento en 250 μL de clorhidrato de guanidina 6 M y mida la absorbancia a 370 nm.
    5. Calcule los niveles de PCO utilizando el coeficiente de extinción (22,000 M-1 cm-1)24.

7. Medición de las actividades de las enzimas antioxidantes

  1. Ensayo de superóxido dismutasa
    1. Incube la muestra (~50 μg) con catalasa bovina (0,4 U/L), DL-epinefrina (5 mg/ml) y tampón de Na2CO3/NaHCO3 (62,5 mM, pH 10,2).
    2. Mida la oxidación de epinefrina a 480 nm usando un espectrofotómetro durante 300 s a intervalos de 60 s25.
  2. Ensayo de catalasa
    1. Mezclar la muestra con 90 mM H2O2 en PBS.
    2. Controle la disminución de la absorbancia de H2O2 a 240 nm durante 3 min a intervalos de 30 s.
    3. Calcule la actividad CAT utilizando el coeficiente de extinción (40 M-1 cm-1).

8. Análisis de PCR en tiempo real

  1. Extraiga el ARN total del cuerpo estriado del ratón utilizando el método de tiocianato-fenol-cloroformo de guanidinio ácido.
  2. Trate el ARN con ADNasa I para eliminar el ADN genómico y medir la concentración de ARN a 260 nm.
  3. Realice RT-PCR cuantitativa utilizando 1 μg de ARN total con un kit de Q-RT PCR de un solo paso.
  4. Amplifique el ADNc con SYBR Green PCR Master Mix y cebadores (Tabla 1).
  5. Calcule los niveles relativos de ADNc utilizando el método 2−ΔΔCt con GAPDH como control interno26.

9. Análisis estadístico

  1. Realice análisis estadísticos utilizando el software GraphPad.
  2. Utilice la prueba t de Student para comparaciones individuales. Para comparaciones múltiples, use ANOVA de una o dos vías seguido de la prueba post hoc de Bonferroni, según corresponda. En todos los casos, considere un valor de p de 0.05 o menos como estadísticamente significativo.

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Resultados

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Después de la administración de MPTP, los ratones mostraron síntomas parkinsonianos característicos, que incluyen una cola de Straub elevada y rígida, piloerección, inmovilidad y anomalías posturales como la curvatura de la columna, lo que confirma el establecimiento exitoso del modelo MPTP (Figura 3). La verificación de la administración de IN utilizando azul de metileno, con ratones sacrificados 10 minutos después de la inyección, mostró una distribución efectiva del tinte...

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Discusión

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Estudios previos demostraron que la administración de ODN por ICV contrarrestó la degeneración inducida por MPTP de las neuronas dopaminérgicas nigroestriatales, el daño oxidativo y la neuroinflamación8. La investigación actual evaluó la eficacia de la administración de IN del análogo de ODN, ciclo(1-8)OP, para prevenir las deficiencias motoras, el daño oxidativo y la neurotoxicidad inducidos por MPTP en un modelo de EP in vivo utilizando raton...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros o relaciones personales que puedan haber influido en el trabajo reportado en este artículo.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por el Laboratorio de Neurofisiología, Fisiopatología Celular y Valorización de Biomoléculas, LR18ES03, NorDiC Inserm U1239, el programa de intercambio Francia-Túnez CMCU-Campus France/PHC Utique 24G0807/50283RD (a Olfa Masmoudi-Kouki y Jérôme Leprince), el Programa Horizon-Marie Skłodowska-Curie Actions (MSCA) PsyCoMed Grant agreement ID: 101086247, y el programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en el marco del acuerdo de subvención Marie Skłodowska Curie No 101034329.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2', 7'-Diclorofluorescina DCFH2-DASigma Aldrich064M4008V
Espectrofotómetro Bio-Rad Laboratorios Bio-Rad, Filadelfia, PA, EE. UU.
Butanol
Cámara
Catalasa de hígado bovinoSIGMA ciencias de la vidaSLBZ7596
ciclo(1-8)OPINSERM U1239 NorDiC, Rouen
Prueba de cilindro (vaso graduado)
DNPH 
EDTA plusTermocientífico 11836714
Etanol 70%
Solución de etanol-acetato de etilo
Software GraphPad La Jolla, CA, Estados Unidos
Clorhidrato de guanidinaGeneON5CCAE310
H2O2 PharmaghrebAEQ10101-D
Jeringa de insulina 2ml
L-epinefrina MP Biomédica151065
Azul de metileno Productos químicos Thermo Scientific10455081
Micropipeta 
Lector de microplacas Synergy LX-AgilentSynergy LX-Agilent
MPTPMedChemExpressHY-15608
MPTP
Na2CO3/NaHCO3 tampón 
NaCl 0.9
kit de PCR Q-RT de un solo paso Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra
Pentobarbital Sigma Aldrich
Espectrofotómetro Synergy LX Nanodrop 2000Biotek Agilent
Ácido tiobarbitúrico (TBA, 0,67%) LOBA CHEMIE PVT. LTD626500025
Consejos
Ácido tricloroacético (TCA, 20%)Laboratorios de investigación Sisco SRL6740608
Tri-Reactivo Sigma AldrichMFCD00213058
Tris-HClTermocientífico J22638. K2
Tritón X-100Termocientífico A16046.AE

Referencias

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